优化负染：通过电子显微镜检查小和不对称蛋白结构的高通量协议

以上蛋白质的一半是小分子蛋白（分子量<200 kDa）的具有挑战，为电子显微镜成像和三维重建。优化的负染色是一个强大的和高通量的协议来获得高对比度和相对较高的分辨率（〜1毫微米）的小的非对称的蛋白质或复合物的不同生理条件下的图像。

该程序的总体目标是使用负染色电子显微镜的高通量优化方案对小而不对称的蛋白质进行成像。这是通过首先在准备好的孵育站中孵育蛋白质，同时准备阴性染色工作站来实现的。该程序的第二步是依次快速清洗三个水滴上的样品。

第三步是按顺序对样品进行三个染色液滴的仔细染色。最后一步是从 EM 网格的背面印迹，然后在氮气下轻轻干燥，以去除多余的溶液。最终，结果可以在低散焦条件下通过 TEM 成像显示小蛋白质的高分辨率图像。

与冷冻电镜相比，该技术的主要优势是设定的。它可以对小而不对称的蛋白质结构进行高通量检查和高对比度成像，同时减少传统负染色造成的结构伪影。尽管这种方法可以深入了解胆固醇酯转移蛋白等小蛋白质机制的结构基础。

它也可以应用于其他蛋白质，如 IgG one antibody、高密度脂蛋白和蛋白酶体，这些蛋白质的大小差异很大。这种方法的视觉演示至关重要，因为洗涤和染色步骤由于时间的变化而难以学习，甚至样品印迹也会对成品染色蛋白质产生巨大影响我实验室的 Z.A 研究人员将错过演示该程序。在准备此协议时，有必要制作 1% 小便池 8 形溶液，并特别注意尽量减少其暴露在光线下。

这包括在第一次过滤溶液时，将注射器 N 0.2 微米过滤器部件包裹在箔纸中。过滤后，在实验当天将两毫升铝箔包装的小瓶等分试样储存在负 80 摄氏度。完全解冻后，在室温水浴中解冻等分试样。

通过 0.02 微米过滤器再次过滤，部件用铝箔包裹。收集瓶也应用铝箔包裹。将阴性染色剂转移到冰箱中，直到使用完为止。

通过将 8 英寸长的参数压在移液器吸头支架上来制作液滴固定片。这使得道路压痕用作直径为 5 毫米的井。制作六排井后，将冰压平聚苯乙烯泡沫塑料托盘表面，然后将冰片放在冰上。

接下来，将 35 微升去离子水加入左侧板材的前三个井中。然后将 35 微升制备的阴性染色溶液加载到片材中的三个右侧孔中。盖上托盘，以尽量减少溶液的光照。

这将用作染色站。现在从空的移液器吸头盒中准备一个 EM 网格孵育站，该盒带有可以安装镊子的附件。将盒子装满冰块的一半，以便在安装镊子时冰面靠近镊子的尖端。

首先，将薄碳涂层的 300 目铜 EM 网格放电约 10 秒。接下来，用镊子拿起一个挂在 EM 网格孵化站上的网格。将镊子与网格一起悬挂，使网格在冰面上倾斜 45 度半英寸。

现在以每毫升溶液 50 至 100 μg 蛋白质的浓度在 DPBS 中稀释蛋白质样品。立即将约 4 微升稀释液涂抹到 EM 网格中。让样品孵育约一分钟。

一分钟后，用滤纸快速轻拍网孔以去除多余的溶液。然后在染色站，将网片接触封口膜上的第一滴水。快速重复干燥过滤器并用下一个液滴浸渍的过程。

总共使用三个水滴，并尽快完成。必须用水快速清洗网格，以避免缓冲液变化对蛋白质产生不利影响。在 3 秒内轻拍最后一次洗涤后，开始在第一滴阴性染色溶液上漂浮网格。

让它在那里漂浮 10 秒钟。同时，通过将尖端压入滤纸中来清洁镊子。10 秒后，用滤纸吸干溶液几次，然后在下一滴染色剂中开始另一个浮子，持续 2 秒钟。

在这两秒钟内清洁镊子。接下来，将网格吸干并将其放在第三个液滴上。在此步骤中，覆盖染色站整整一分钟。

必须通过触摸 EM 网格的背面精确时间来去除污渍，以确保网格均匀干燥。如果滤纸接触污渍的时间过长，则可能会去除过多的污渍，从而导致成像效果不佳。接下来，继续干燥网格。

首先，将整个非碳面接触滤纸，直到溶液转移出去。其次，应用平缓的氮气流。现在将网格转移到衬有滤纸的培养皿上，并部分覆盖培养皿。

让网格在室温下在培养皿中干燥 30 分钟。或者，含脂质的样品可以在 40 摄氏度下烘烤一小时。完全干燥后，将 EM 网格转移到 EM 网格存储盒中，然后再开始，首先对齐 TEM。

使用负染网格的碳膜区域的功率谱检查最高可见解冻环的分辨率，这应该优于目标分辨率。然后，要调整对准，请仔细检查试样碳膜区域的功率谱。在正确对齐的条件下，可以可视化超过 20 T tho 环，这相当于比 5 埃更好的可视化。

这些环是通过在 1.6 微米的散焦和每平方 20.4 个电子的剂量下对无定形碳图像进行更毛茸茸的转移制成的。埃。现在将焦点带回约 0.1 微米的近 Scherzer 聚焦条件，以便在检查 EM 网格期间进行小蛋白质成像。理想情况下，在低放大倍率下，染色区域通常靠近较厚的染色混浊区域的边缘。

用 OPNS 观察脂蛋白标本的结构。示例包括重组 HDL、人血浆、LDL、人血浆 IDL 和人血浆 VLDL。还看到了较小的结构，如 53 千道尔顿、CETP

这是 EEM 成功成像的最小蛋白质之一。CETP 晶体结构的超级拼贴与图像非常匹配，非常动态。在 160 道尔顿免疫球蛋白 G 抗体中也观察到异质性蛋白质。

三个子域清晰可见。对 IgG one 抗体进行更仔细的检查，以与其晶体结构进行比较。IgG one 抗体的晶体结构在许多方面与这些抗体的 EM 视图相匹配，例如结构域位置及其形状。

其他观察到的分子包括 28 千道尔顿、无脂质载脂蛋白 A 单生长 EL 和蛋白酶体。从本质上讲，OPNS 方法显着推进了小型不对称结构的 EM 成像边界以及在尝试该程序时进行的相关机理研究。重要的是要尽可能减少对染色试剂的光照，以快速清洗标本并使用 near treasure focus 进行成像。遵循此程序。

可以执行其他方法，如电子断层扫描，以回答其他问题，例如单个分子的纳米分辨率结构以及它们之间的确认变化。在此发展之后，这项技术为结构生物学领域的研究人员探索人血浆脂蛋白之间簇酯转移的磁体铺平了道路。