Name: 从土壤、根际和根 Endosphere 提取细菌群落数据的根菌群探析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学习从土壤、根际和根内层提取细菌群落数据的标准化方法，利用16S核糖体RNA基因分析技术。该方案有助于研究植物相关微生物群落的组成与多样性，揭示驱动微生物组结构的生物和非生物因素。

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本工作由美国农业部农业研究局（USDA-ARS，项目编号：CRIS 2030-21430-008-00D）资助。TS 获得美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（NSF Graduate Research Fellowship Program）的支持。

1. 根内菌群、根际及土壤样品的采集与分离
<ol>
	<li>进入野外前，将超纯水（每份样品至少 90 mL）进行高压灭菌以实现消毒。通过向 1 L 无菌水中加入 6.75 g KH2PO4、8.75 g K2HPO4 和 1 mL Triton X-100，配制附生生物去除缓冲液（每份样品至少 25 mL）。使用孔径为 0.2 µm 的真空滤器对缓冲液进行灭菌。
	<ol>
		<li>在执行步骤 1.2 至 1.5 时，始终佩戴经乙醇灭菌的洁净手套，并在处理每份样品之间更换手套，以防止污染。所有设备均需用 70% 乙醇灭菌，并在样品间擦拭清洁。采样前，确定实验所需的最优采样深度，并在所有土壤和根系采集过程中保持一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集散装土壤样品时，使用经乙醇灭菌的土壤钻取器，从植株基部约 23 至 30 cm 处采集不含植物根系的土壤。</li>
	<li>将土壤转移至塑料袋中，轻轻振荡使其均质化，然后取一份土壤样品（约 600 mg）装入一个 2 mL 离心管中。立即将该 2 mL 管置于干冰上，或在液氮（N2）中快速冷冻，直至准备进行 DNA 提取（步骤 2）。
	<ol>
		<li>在某些环境中，周围土壤可能含有植物材料。此时，在将土壤放入塑料袋前，应使用经灭菌的 2 mm 筛网将植物残渣与土壤分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为采集根系及根际样品，使用经乙醇灭菌的铲子小心挖出植株，尽可能获取完整的根系。采样深度取决于植物种类：小型植物（如小麦）仅需挖掘数厘米即可取出，而大型植物（如高粱）则可能需要挖掘 30 cm 或更深。轻轻抖动根部以去除多余土壤，直至根表附着约 2 mm 厚的土壤层。 
	注意：处理小型植物、根系脆弱的植物或干燥且高黏土含量的土壤时需格外小心。理想情况下，抖落后根部仅应残留一层薄薄的土壤。若仍有较大土团附着，可用橡胶锤轻敲茎基部以松动土壤。若此操作后残留土壤厚度超过或不足 2 mm，应记录其大致厚度。</li>
	<li>对于大型植物，使用无菌剪刀和/或修枝剪切取具有代表性的根系亚区段，并将不少于 500 mg 的根组织放入一个 50 mL 锥形管中。对于较小的禾本科植物，则将整个根系系统放入管中。加入足量的附生生物去除缓冲液以完全浸没根系，随后立即将样品置于干冰上，或在液氮（N2）中快速冷冻。 
	注意：注意不要过度填充 50 mL 锥形管，否则会影响后续洗涤步骤。应保留足够的空余空间，使附生生物缓冲液能够流至管底，充分包围根系并覆盖其顶部。由于某些禾本科植物的根系生物量过大，无法完全容纳于 50 mL 锥形管中，因此应仅采集部分根系。但需注意，切割根系可能导致内生细菌被冲洗至根际组分中，因此应尽量减少根系断裂。若样品返回实验室后不能立即处理，可于 -80 °C 保存。</li>
	<li>为分离根际与根系，将根系样品置于冰上解冻，随后在 4 °C 条件下对根系样品进行超声处理，功率 160 W，脉冲 30 秒，间隔 30 秒，持续 10 分钟。使用无菌镊子将根系转移至预冷（4 °C）的洁净 50 mL 离心管中。请勿丢弃含有缓冲液和土壤的原始管，其中内容物即为根际组分（图 1）。</li>
	<li>将含有缓冲液和根际的离心管在 4 °C、4,000 × g 条件下离心 10 分钟。倾去上清液，将含有根际组分的离心管在液氮（N2）中快速冷冻，并于 -80 °C 保存，直至准备进行 DNA 提取（步骤 2）。</li>
	<li>清洗根系时，向根系组分中加入约 20 mL 预冷（4 °C）的无菌水。通过剧烈振荡（手动或使用混合器，持续 15–30 秒）清洗根系，然后排去水分。</li>
	<li>重复此步骤至少两次，直至根系表面无可见土壤残留。若 DNA 提取（步骤 2）不能立即进行，应用无菌铝箔包裹根系，在液氮（N2）中快速冷冻，并于 -80 °C 保存，直至准备进行 DNA 提取。</li>
</ol>
2. DNA 提取
注意：在步骤2和3的整个过程中，应始终佩戴经乙醇消毒的清洁手套，并在经乙醇消毒的台面上进行所有操作。
<ol>
	<li>从土壤和根际样品中提取DNA。
	<ol>
		<li>使用无菌刮勺迅速将步骤1.3和1.7中获得的250 mg土壤及根际样品分别转移至专用于土壤DNA提取的商业化DNA提取试剂盒所提供的收集管中，随后按照试剂盒供应商提供的操作说明进行DNA提取。</li>
		<li>使用DNA提取试剂盒提供的洗脱缓冲液洗脱DNA后，将DNA储存于-20 °C，待进行步骤3时取出使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从根部样品中提取DNA。
	<ol>
		<li>使用液氮预冷已灭菌的研钵和研杵2. 称取 600 至 700 mg 根组织，将组织放入研钵中。小心地加入足量液氮2 以覆盖根部。</li>
		<li>将根部研磨成小块。继续添加液氮的过程2 研磨（至少两次，样品间保持一致），直至根部组织成为细粉。确保在此步骤中根组织不发生解冻。 
		注意：使用液氮时，应佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和低温手套）。2. 
		注意：对于低质量的DNA提取，可将过量的根组织研磨成粉末并储存在-80 °C，以利于后续操作。</li>
		<li>迅速地，在根粉开始解冻之前，使用无菌刮勺将根粉转移至预称重的、置于冰上的1.5 mL离心管中。记录管和粉末的重量。通常转移300 - 400 mg粉末。</li>
		<li>使用无菌刮勺迅速将150 mg根粉转移至专用于土壤样品DNA提取的商业化DNA提取试剂盒所提供的收集管中，随后按照试剂盒供应商提供的操作步骤进行DNA提取。 
		注意：对于某些根样品，DNA沉淀中可能残留较高浓度的有机物，这会抑制PCR过程中DNA的扩增，尤其是在采用不同的DNA提取方案时例如，CTAB 提取法）进行提取。如有必要，按照环境 DNA 纯化试剂盒提供的说明对 DNA 进行纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用高灵敏度台式荧光计测量所有DNA样品的浓度。
	<ol>
		<li>将每种洗脱的DNA样品各取1 - 20 µL加入dsDNA高灵敏度检测试剂盒提供的试管中。加入荧光计工作液（1:200 染料:缓冲液）至终体积为200 µL。</li>
		<li>另准备两支试管，分别加入10 µL DNA标准品1（0 ng/µL DNA）或10 µL标准品2（100 ng/µL），然后向每支标准品试管中各加入190 µL荧光计工作液。</li>
		<li>测定各标准品和样品的浓度。如果未自动完成，则根据两个标准品的吸光度值通过线性回归计算DNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 扩增子文库制备与提交
<ol>
	<li>准备扩增反应所需材料。
	<ol>
		<li>在 4 °C 下解冻 DNA 样品，并在整个步骤 3 中保持样品置于冰上。随机排列 DNA 样品顺序，以尽量减少因样品在 PCR 板上位置不同而产生的偏差（表 2）。</li>
		<li>在 96 孔 PCR 板中，将每个样品的 DNA 用分子级水稀释至总反应体积为 20 µL，浓度为 5 ng/µL。在四个角落孔中各加入 20 µL 分子级水，作为扩增的阴性对照（空白）（表 2）。</li>
		<li>将条形码引物（10 µM）排列在 PCR 条形管或 96 孔板中，以便使用多通道移液器添加（图 2）。</li>
		<li>配制足够的 PCR 主混合液，用于每个 DNA 样品的三重扩增。每份主混合液包含：1.5 µL BSA（20 mg/mL）、37.5 µL 预制的 2x 主混合液（含 PCR 缓冲液、MgCl2、dNTPs 和&#160;Taq&#160;DNA 聚合酶）、0.57 µL 叶绿体 PNA（100 µM）、0.57 µL 线粒体 PNA（100 µM）以及 25.86 µL 分子级水。</li>
		<li>将主混合液倒入无菌的 25 mL 多通道移液器储液槽中，使用多通道移液器向新的 96 孔 PCR 板的每个孔中分配 66 µL 主混合液。 
		注：计算主混合液试剂用量时，需额外计入每块板上的 4 个空白孔。</li>
		<li>使用多通道移液器，将 6 µL 浓度为 5 ng/µL 的 DNA（来自标准化 DNA 板）加入主混合液板中。然后向主混合液板中加入 1.5 µL 浓度为 10 µM 的正向引物，使每一列具有不同的正向条形码；再加入 1.5 µL 浓度为 10 µM 的反向引物，使每一行具有不同的反向条形码（图 2）。 
		注：在添加引物之前，若使用不同的引物，可将已随机化的板和主混合液用于扩增 ITS 或 ITS2 真菌基因。若如此操作，可采用类似的引物设计。</li>
		<li>将 PCR 板短暂离心（3,000 x g）。使用多通道移液器轻轻混匀，然后将反应混合液分装至三块新板中，每孔 25 µL。 
		注：尽管三重重复并非绝对必要，但可降低技术变异的影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用设定为以下条件的热循环仪对每块板中的 DNA 进行扩增：98 °C 预变性 180 秒，进行 30 个循环（98 °C 变性 45 秒，78 °C PNA 退火 10 秒，55 °C 引物退火 60 秒，72 °C 延伸 90 秒），随后在 72 °C 延伸 600 秒，最后 4 °C 保存。扩增完成后，将三块重复板的产物合并至一块 96 孔板中。</li>
	<li>使用高灵敏度荧光计试剂，在 96 孔板读数仪中定量 DNA。
	<ol>
		<li>向 96 孔微孔板中每孔加入 2 µL PCR 产物，并加入 98 µL 荧光计工作液（染料:缓冲液 = 1:200），共 100 µL。设置 4 个标准品孔：分别加入 5 µL DNA 标准品 1（0 ng/µL DNA）、1 µL 标准品 2（10 ng/µL）、2 µL 标准品 2（20 ng/µL）和 5 µL 标准品 2（50 ng/µL），再补加荧光计工作液至终体积为 100 µL。 
		注：若无板式读数仪，可使用台式荧光计按步骤 2.3 所述方法单独测量每个样品。</li>
		<li>根据四个标准品的吸光度值进行线性回归，计算 DNA 浓度。</li>
		<li>对于成功扩增的带条形码产物（浓度高于 15 ng/µL 的样品），将每个样品取 100 ng 汇集至一个 1.5 mL 离心管中（表 2）。</li>
		<li>使用电子表格程序中的 =AVERAGE() 函数计算加入混合样品的平均体积。将&#34;空白&#34; PCR 产物的体积也加入混合样品中。 
		注：由于&#34;空白&#34; PCR 产物具有独特的条形码组合，可用于测序以检测实验室中的任何污染源。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用台式荧光计（如步骤 2.3 所述）测定混合产物的浓度，取 600 ng DNA，用分子级水稀释至终体积为 100 µL，置于 1.5 mL 管中。将剩余的混合产物储存于 -20 °C。</li>
	<li>按照既定的 PCR 纯化流程，使用磁性纯化珠在 96 孔板格式下对 600 ng DNA 分装样品进行洗涤，仅作少量调整。
	<ol>
		<li>新鲜配制 600 µL 70% 乙醇。轻轻振荡磁珠瓶，使沉降于底部的磁珠重新悬浮。</li>
		<li>向 600 ng DNA 分装样品中加入 1 倍体积（100 µL）的磁珠溶液，通过移液吹打 10 次充分混匀。室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>将管置于磁力架上 2 分钟（或直至溶液澄清），使磁珠与溶液分离。在管仍置于磁力架上的情况下，小心吸除上清液，避免触碰磁珠，并弃去上清液。 
		注：此时扩增产物已结合在磁珠上。若在吸除过程中扰动或丢失磁珠，将导致 DNA 损失。</li>
		<li>保持管在磁力架上，向管中加入 300 µL 70% 乙醇，室温孵育 30 秒。吸除乙醇并弃去。重复此步骤一次，并在第二次洗涤后彻底去除所有乙醇。将管从磁力架上取下，室温晾干 5 分钟。</li>
		<li>向干燥的磁珠中加入 30 µL 分子级水，通过移液吹打 10 次混匀。室温孵育 2 分钟。将管放回磁力架静置 1 分钟，使磁珠与溶液分离。将上清液转移至新管中。 
		注：磁珠不会影响后续反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用台式荧光计（如步骤 2.3 所述）测定纯化后混合 DNA 的最终浓度。取一份样品稀释至 10 nM，终体积为 30 µL，或根据测序机构要求调整至其推荐的浓度和体积。</li>
	<li>送样至测序机构，使用高通量测序平台（NGS）进行 2 x 300 bp 双端测序。</li>
</ol>

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<li>Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+primer+choice+and+short+read+sequences+on+the+outcome+of+16S+rRNA+gene+based+diversity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies.</a> PLoS One. 8 (8), e71360(2013).</li>
<li>Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+nucleic+acid-mediated+PCR+clamping+as+a+useful+supplement+in+the+determination+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity.</a> Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).</li>
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<li>Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+correlation+of+hypervariable+regions+in+16S+rRNA+genes+in+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis.</a> BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案展示了一条从田间取样到样品处理及后续测序的成熟流程，用于研究根内生圈、根际及土壤微生物群落组成。研究根际相关微生物组面临独特挑战，部分原因在于土壤取样的固有困难。土壤在物理和化学性质上具有高度变异性，不同土壤条件之间的距离可能仅有几毫米28,29。这可能导致从相邻取样点采集的样品在微生物群落组成和活性方面存在显著差异30,31。因此，在DNA提取前使用土壤钻取器和铲子以保持取样深度一致并进行均质化处理，对于根微生物组研究的可重复性至关重要。高效分离根际与根组织组分同样关键；采用过于剧烈的根表面灭菌方法可能在DNA提取前导致根内内生菌裂解，而过于温和的冲洗则可能无法完全去除根表面附着的微生物7。另一个可能对测序结果产生负面影响或造成干扰的因素是细菌污染，污染来源多样，有时难以与环境样品中的目标细菌区分32<...

与植物相关的微生物组由动态且复杂的微生物群落组成，包括细菌、古菌、病毒、真菌以及其他真核微生物。除了在引发植物病害方面已被广泛研究的作用外，与植物相关的微生物还能通过提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性、促进养分有效性以及通过产生植物激素来增强植物生长，从而对植物健康产生积极影响。因此，人们特别关注定殖于植物根内生境、根际以及周围土壤中的微生物类群。尽管部分微生物可在实验室培养基上单独培养，但许多微生物无法实现体外培养，部分原因在于它们可能依赖于与其他微生物的共生关系、生长极为缓慢，或需要实验室环境中难以复制的特定条件。由于基于测序的环境与宿主相关微生物样本系统发育分析无需依赖培养，且具有成本较低、通量较高的优势，已成为研究微生物群落结构的首选方法。
选择适当的测序技术取决于用户需求，这些技术由多种新一代测序（NGS）平台提供1，关键因素包括：所需的覆盖度、扩增子长度、预期的群落多样性，以及测序错误率、读长和每运行/每兆碱基的成本。在基于扩增子的测序实验中，另一个需要考虑的变量是选择扩增哪个基因以及使用哪些引物。在设计或选择引物时，研究人员通常不得不在扩增的通用性与从所得扩增子中获得的分类学分辨率之间进行权衡。因此，这类研究通常会选择能够选择性靶向微生物组特定子集的引物和标记基因。评估细菌群落组成通常通过测序细菌16S rRNA基因的一个或多个高变区来实现2,3。在本研究中，我们描述了一种为NGS平台开发的基于扩增子的测序方案，该方案靶向细菌16S rRNA基因约500 bp的V3-V4区域，既可实现对多种细菌类群的广泛扩增，又能提供足够的变异以区分不同分类单元。此外，该方案还可轻松适配于其他引物组合，例如靶向真菌ITS2标记或真核生物18S rRNA亚基的引物。
尽管其他方法（如宏基因组鸟枪法测序、宏转录组学和单细胞测序）具有各自的优势，包括可获得完整的微生物基因组以及对群落功能进行更直接的测定，但这些技术通常比本文所述的系统发育谱型分析成本更高，且对计算资源的需求更大4。此外，在根部样品上进行宏基因组鸟枪法测序和宏转录组学分析时，会产生大量来源于宿主植物基因组的测序读段，目前针对这一局限性的解决方法仍在开发中5,6。
与任何实验平台一样，基于扩增子的分析可能会引入多种潜在偏差，这些偏差在实验设计和数据分析过程中均需加以考虑。这些偏差包括样本采集方法、DNA提取方法、PCR引物的选择以及文库制备方式。不同的方法会显著影响所产生的可用数据量，也可能阻碍不同研究之间结果的比较。例如，去除根际细菌的方法7，以及不同提取技术或DNA提取试剂盒的选择8,9，已被证明会显著影响下游分析，从而导致关于存在哪些微生物及其相对丰度的不同结论。由于基于扩增子的分析具有可定制性，跨研究之间的比较可能具有挑战性。地球微生物组计划提出，研究植物相关微生物组等复杂系统的研究人员应制定标准化操作流程，以尽量减少因不同研究间采用不同方法所引起的变异性10,11。本文将讨论上述多个主题，并在适当情况下提供最佳实践建议。
该方案演示了采集土壤、根际和根部样品的过程 高粱（Sorghum bicolor） 使用一种成熟的DNA提取试剂盒提取DNA11此外，我们的方案包含一个详细的扩增子测序流程，采用一种常用的高通量测序平台，用于确定细菌群落的结构12,13,14该方案已在最近发表的一项研究中得到验证，适用于18种单子叶植物的根系、根际及关联土壤，涵盖多种植物宿主 高粱（Sorghum bicolor），玉米（Zea mays） 和 Triticum aestivum15该方法也已验证可用于其他标记基因，例如在龙舌兰微生物组研究中成功应用于真菌ITS2标记基因的分析。16,17 以及草莓微生物组18.

<table><tbody><tr><td>0.1-10/20 &amp;micro;L 过滤吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3122000027</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;升，100 &amp;micro;L，和1000 &amp;micro;L 微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3120000909</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 过滤型微量移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>2 mm 土壤筛</td><td>林业供应商</td><td>60141009</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 过滤型微量移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>25 mL 储液槽</td><td>VWR International LLC</td><td>89094-664</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>50 mL 锥形瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>500 mL 真空滤器（0.2 &amp;micro;m 孔径）</td><td>VWR International LLC</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板</td><td>USA Scientific</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>BioRad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NC9933872</td><td>使用说明：&lt;br/&gt; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&lt;br/&amp;>&amp;amp;documentName=B37419AA.pdf</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>木板路</td><td>7124</td><td>可使用其他供应商的等效产品替代。</td></tr><tr><td>分析天平，精度为 0.001 g</td><td>Ohaus Pioneer</td><td>PA323</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>Bioruptor Plus 超声波破碎仪</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）20 mg/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5811000908</td><td>包括50 mL和96孔板桶适配器</td></tr><tr><td>低温手套</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z183490</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>DNeasy PowerClean 试剂盒（可选）</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12877-50</td><td>先前的 MoBio</td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil 试剂盒</td><td>Qiagen 公司</td><td>12888-100</td><td>先前的 MoBio</td></tr><tr><td>干冰</td><td>任何</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12321D</td><td>请勿替换</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR International LLC</td><td>89125-188</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>加仑尺寸冷冻袋</td><td>Ziploc</td><td>NA</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>Gemini EM 微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td>EM</td><td>可使用另一种从顶部读取96孔板的荧光计。</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>实验服</td><td>Workrite</td><td>J1367</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>液氮&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>任何</td><td>NA</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>液氮&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 杜瓦瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4150-9000</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>Milli-Q超纯水净化系统</td><td>Millipore Sigma</td><td>SYNS0R0WW</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>分子级水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4387937</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>研钵</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-150</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>腈基手套</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>19167032B</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>VWR International LLC</td><td>BWK6212</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>PCR板封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9684493</td><td></td></tr><tr><td>PCR条形管</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>研钵</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-166</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>塑料刮勺</td><td>LevGo, Inc.</td><td>17211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13000014</td><td></td></tr><tr><td>PNA - 叶绿体和线粒体</td><td>PNA Bio</td><td>NA</td><td>务必通过生物信息学方法对序列进行验证</td></tr><tr><td>防护眼镜</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z759015</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>橡胶锤（可选）</td><td>Ace Hardware</td><td>2258622</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>VWR International LLC</td><td>89259-936</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>铲子</td><td>家得宝</td><td>2597400</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>土壤钻取器（小直径： &amp;小于1英寸</td><td>Ben Meadows</td><td>221700</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>喷雾瓶</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-395278</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>标准去盐带条形码引物（10 &amp;micro;M)（表1）</td><td>IDT</td><td>NA</td><td>4 nmol Ultramer DNA 寡核苷酸，标准脱盐。NGS 接头和测序引物（表 1）针对使用 v3 化学的 Illumina MiSeq 平台设计。</td></tr><tr><td>PCR扩增仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E950040015</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr><tr><td>称量舟</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>B6001W</td><td>可替换为其他供应商的等效产品。</td></tr></tbody></table>

探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

植物宿主与其相关微生物之间的密切互作在决定植物适应性方面至关重要，并可促进植物对非生物胁迫和病害的耐受性提升。由于植物微生物组可能具有高度复杂性，通常优先选用低成本、高通量的方法（如基于扩增子的16S rRNA基因测序）来表征其微生物组成与多样性。然而，在开展此类实验时，选择合适的方法学对于减少可能影响样本间及研究间分析与比较的偏差至关重要。本方案详细描述了一种从土壤、根际和根组织样本中收集和提取DNA的标准化方法。此外，我们介绍了一个经过充分验证的16S rRNA扩增子测序流程，可用于探究这些样本中细菌群落的组成，并可轻松适配于其他标记基因。该流程已成功应用于多种植物物种，包括高粱、玉米、小麦、草莓和龙舌兰，且有助于克服植物细胞器DNA污染带来的问题。

执行推荐的实验方案后，应获得一组带有索引的双端测序数据，这些数据可回溯至各个样本，并根据下游分析方法被归类为细菌可操作分类单元（OTU）或精确序列变体（ESV，也称为扩增子序列变体（ASV）和亚可操作分类单元（sOTU））。为了获得高质量的序列数据，在样本处理和文库构建的每一步都必须注意保持样本间的一致性，并尽量减少任何潜在偏差的引入。在完成样本采集、处理及DNA提取（步骤1和步骤2）后，所得洗脱液应呈透明状态，不含可能抑制扩增反应的有机污染物。虽然可通过微量分光光度计测定各DNA样本的纯度，但我们发现土壤DNA提取试剂盒能够可靠地去除所有污染物。由于DNA质量具有可预测性，因此相较于基于紫外吸收的定量方法，使用特异性结合DNA的荧光染料进行定量更为合适19,20,21。在PCR扩增前，土壤和根际样本的DNA浓度平均约为10 ng/µL，而根组织样本的平均浓度通常约为30 ng/µL（<...

本文介绍了一种获取土壤、根际和根内微生物组扩增子序列数据的实验方案。该信息可用于研究与植物相关的微生物群落的组成和多样性，适用于多种植物物种。

植物宿主与其相关微生物之间的密切互作对于决定植物适应性至关重要，并可促进植物对逆境胁迫的耐受性提升……

本实验的总体目标是通过16S核糖体RNA基因的群落谱型分析，对根系微生物组的三个区室——土壤、根际和根内圈——进行表征。该方法有助于回答微生物生态学中的关键问题，例如影响微生物组结构的重要生物和非生物因素。该技术的主要优势在于，它对从根与根际的分离、DNA提取到测序文库制备的每一步都实现了标准化。本次实验操作由Coleman-Derr实验室的研究生Tuesday Simmons示范。开始实验前，使用经乙醇灭菌的土壤钻取器采集无植物根系的土壤样品。从植物基部向外约23至30厘米处采集土芯。接下来，将土壤转移至一个塑料袋中，通过轻轻摇晃袋子使土壤均质化，取600毫克土壤样品放入一个2毫升离心管中，并立即将该2毫升离心管置于干冰上，直至进行DNA提取。为采集根系及根际土壤，使用经乙醇灭菌的铲子将植株挖出，注意尽可能完整地获取根系。轻轻摇动根部以去除多余土壤，直至根系表面附着约2毫米厚的土壤层。对于大型植物，使用无菌剪刀剪取具有代表性的根部小段，并将至少500毫克的根组织放入一个50毫升的锥形管中。加入足量的表生微生物去除缓冲液以浸没根部，然后立即将样品置于干冰上。为了将根际与根部分离，先将根样品在冰上解冻，然后对根样品进行超声处理。使用无菌镊子将根转移至预冷的洁净50毫升离心管中。请勿丢弃含有缓冲液和土壤的原始离心管，其中含有根际圈组分。接下来，离心含有缓冲液和根际样品的离心管。倾去上清液，将根际组分置于干冰中。用约 20 毫升 4°C 的无菌水冲洗根部组分。用力振荡清洗根部15至30秒，然后倒掉水。使用无菌刮勺迅速将250毫克土壤和根际样品分别转移至土壤DNA提取商品试剂盒提供的收集管中，随后按照试剂盒供应商提供的操作步骤进行处理。洗脱后，将DNA于-20°C保存，直至准备进行扩增子文库构建，然后提取根样品中的DNA。使用液氮冷却已灭菌的研钵和研杵。称取 600 至 700 毫克根组织，将组织放入研钵中，并小心加入足量液氮以完全覆盖根组织。将根组织研磨成小碎片。重复添加液氮并研磨至少两次，各样本间操作需保持一致，直至根组织成为细粉。在根粉开始解冻前迅速操作，使用无菌刮勺将根粉转移至预称重的、置于冰上的1.5毫升离心管中。记录管和粉末的总重量。使用无菌刮勺迅速将 150 毫克根粉转移至专为土壤样品 DNA 提取设计的商品化 DNA 提取试剂盒所提供的收集管中，随后按照试剂盒供应商提供的方案进行 DNA 提取。配制足量的 PCR 扩增主混合液，以对每个 DNA 样品进行三复孔扩增。将主混合液倒入无菌的 25 毫升多通道移液器储液槽中，并向新的 96 孔 PCR 板的每孔分配 66 微升主混合液。接下来，从标准化的DNA板中取六微升浓度为每微升五纳克的DNA，加入到主混合板中。然后，向主混合板中加入1.5微升浓度为10微摩尔的正向引物，使每一列含有不同的正向条形码，并加入1.5微升浓度为10微摩尔的反向引物，使每一行含有不同的反向条形码。用封口膜覆盖板孔，于3,000 RCF短暂离心。使用多通道移液器轻轻混匀反应液，然后将混合物分装至三个孔板中，每孔加入25微升反应体系，并用PCR封板膜覆盖孔板。使用PCR仪扩增各孔板中的DNA。扩增完成后，将三个重复孔板的反应产物合并至一个96孔板中。使用计算机电子表格，计算每个样本中 100 纳克对应的体积，以及所有样本的平均体积。针对每个空白的 PCR 产物，将计算所得的平均体积加入同一个 1.5 毫升离心管中。对于成功扩增的样本，将每个样本的 100 纳克等量混合至同一离心管中，然后使用台式荧光计测量混合产物的浓度，并将 600 纳克 DNA 溶解于分子生物学级水中，最终体积为 100 微升，置于 1.5 毫升离心管中。将剩余的混合产物于-20摄氏度保存。在纯化600纳克DNA等分试样之前，配制600微升新鲜的70%乙醇。使用磁性珠按照既定的PCR纯化流程进行操作。轻轻振荡磁珠管，使沉降到管底的磁珠重新悬浮。向含有600纳克DNA的等分试样中加入1倍体积（即100微升）的磁珠溶液。通过移液器吹打混合溶液和磁珠10次，确保充分混匀。充分混匀后，将混合物在室温下孵育五分钟。将离心管置于磁力架上两分钟，或直至溶液变澄清，以分离磁珠与溶液。保持离心管在磁力架上，小心吸取上清液，避免接触磁珠，并弃去上清液。将离心管置于管架上，向管中加入 300 微升 70% 乙醇，在室温下孵育磁珠 30 秒。用移液器吸去乙醇并弃去。重复此步骤，并在第二次洗涤后彻底去除所有乙醇。将离心管从磁力架上取下，在室温下晾干管内物质5分钟。向干燥的磁珠中加入30 µL分子生物学级水，用移液器吹打10次混匀。室温孵育2分钟。将离心管放回磁力架上静置1分钟，使磁珠与溶液分离。将上清液转移至新的离心管中。使用台式荧光计测定纯化后合并DNA的最终浓度。将等分试样稀释至终体积为30微升、终浓度为10纳摩尔，或根据测序机构的要求调整至其偏好的浓度和体积。扩增步骤完成后，进行测序以确定每个样品中细菌群落的组成。所用PNA序列与所研究植物宿主的叶绿体和线粒体16S核糖体RNA基因序列比对时，不应出现任何错配。与13个碱基对的PNA序列存在单个错配即可显著降低其有效性，例如所提供的PNA序列与莴苣（Lactuca sativa）叶绿体16S核糖体RNA基因之间的匹配情况。由于每个样本混合了等量的扩增DNA，测序后根据其条形码索引进行分类，每个样本获得的匹配细菌分类群的读长数量均大致相等。一旦掌握该技术，可在约八小时内完成八个植物样本的实验。在进行该实验流程时，保持各次实验之间的一致性至关重要。诸如DNA提取方法和PCR预混液的细微变化等细节均可能引入偏差。在完成本流程后，可采用其他方法（如宏转录组学）进一步回答更多问题，例如哪些微生物具有活性，以及它们正在表达哪些基因？请注意，使用液氮可能具有极高的危险性，进行此操作时必须采取预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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根际土壤，多物种生物膜，微生物群落，生物膜构建，土壤微生物学，微生物相互作用，体外模型，高通量筛选，微生物组工程，生物膜动态

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