从土壤、根际和根 Endosphere 提取细菌群落数据的根菌群探析

本实验的总体目标是使用 16S 核糖体 RNA 基因的群落分析来表征根微生物组、土壤、根际和根内层的三个隔室。这种方法可以帮助回答微生物生态学中的关键问题，例如作为微生物组结构重要驱动因素的生物和非生物因素。该技术的主要优点是它标准化了从根和根际分离到 DNA 提取再到制备测序文库的每个步骤。

演示此程序的是 Coleman-Derr 实验室的研究生 Tuesday Simmons。要开始该方案，请使用乙醇灭菌的土壤核心收集器收集大量土壤样品，以获得不含植物根的土壤。从植物底部收集大约 23 到 30 厘米的核心。

接下来，将土壤转移到塑料袋中，轻轻摇动袋子使土壤均质化，将 600 毫克等分试样的土壤样品转移到一个 2 毫升的试管中，并立即将 2 毫升的试管放在干冰上，直到 DNA 提取。要收集根和根际，请使用乙醇消毒的铲子挖出植物，注意获取尽可能多的根。轻轻抖掉根部多余的土壤，直到有大约 2 毫米的土壤粘附在根部表面。

对于大型植物，使用无菌剪刀剪下具有代表性的根部分，并将至少 500 毫克的根组织放入 50 毫升的锥形小瓶中。添加足够的附生植物去除缓冲液以覆盖根部，然后立即将样品放在干冰上。为了将根际与根部分离，请在冰上解冻根样品，然后对根部样品进行超声处理。

使用无菌镊子将根部转移到冷却、干净的 50 毫升试管中。不要用缓冲液和污垢处理原管。这包含根际分数。

接下来，离心含有缓冲液和根际的试管。倒出上清液，并将根际部分置于干冰中。要清洗根部，请在根部部分加入大约 20 毫升 4 摄氏度的无菌水。

用力摇晃 15 到 30 秒清洗根部，然后沥干水分。使用无菌刮刀将 250 毫克土壤和根际快速转移到市售 DNA 分离试剂盒中提供的单独收集管中，用于土壤提取，然后使用试剂盒供应商的方案进行。洗脱后，将 DNA 储存在零下 20 摄氏度，直到准备好进行扩增子文库制备，然后从根样品中提取 DNA。

用液氮冷却消毒过的研钵和研杵。量出 600 至 700 毫克根组织，将组织放入研钵中，小心添加足够的液氮以覆盖根部。将根部磨成小块。

继续添加液氮并研磨至少两次，样品之间保持一致，直到根部成为细粉。在根粉开始解冻之前，使用无菌刮刀将根粉转移到预先称重的 1.5 毫升冰管中。记录试管和粉末的重量。

使用无菌刮刀将 150 毫克根粉快速转移到设计用于从土壤中提取的市售 DNA 分离试剂盒中提供的收集管中，然后使用试剂盒供应商的方案进行 DNA 分离。准备足够的 PCR 预混液，以一式三份扩增每个 DNA 样品。将预混液倒入无菌的 25 mL多通道移液器储液槽中，并将 66 μL 预混液分配到新的 96 孔 PCR 板的每个孔中。

接下来，从归一化 DNA 板中加入 6 微升每微升 5 ng的 DNA，加入到预混液板中。然后，向母板中加入 1.5 微升 10 微摩尔正向引物，使每列具有不同的正向条形码，以及 1.5 微升 10 微摩尔反向引物，使每行具有不同的反向条形码。用薄膜盖住板，然后在 3， 000 RCF 下短暂旋转板。

使用多通道移液器轻轻混合内容物，然后用 25 微升反应混合物将它们分成三个板，并用 PCR 膜覆盖板。使用热循环仪扩增每个板中的 DNA。扩增后，将三个重复板合并到一个 96 孔板中。

使用计算机电子表格，计算每个样品的 100 ng 体积，以及所有样品的平均体积。对于每个空白 PCR 产物，将计算的平均体积加入单个 1.5 mL 试管中。对于成功扩增的样品，将每个样品的 100 ng 混合到同一管中，然后使用台式荧光计测量混合产物的浓度，并在 1.5 mL 试管中洗脱 600 ng DNA 的分子级水，最终体积为 100 μL。

将剩余的混合产品储存在零下 20 摄氏度。在纯化 600 ngDNA 等分试样之前，制备 600 μL 新鲜的 70% 乙醇。使用顺磁珠遵循既定的 PCR 纯化过程。

摇动磁珠管，使沉淀到底部的磁珠重悬。将 1 倍体积 100 μL 的磁珠溶液添加到 600 ng 等分试样的 DNA 中。通过移液 10 次将溶液和珠子彻底混合。

充分混合后，在室温下孵育混合物 5 分钟。将试管放在磁力架上 2 分钟或直到溶液澄清，以将磁珠与溶液分离。将试管放在支架上，小心吸出透明上清液，不要接触磁珠，然后将其丢弃。

将试管放在支架上，向试管中加入 300 μL 70% 乙醇，并在室温下孵育微珠 30 秒。吸出乙醇，然后丢弃。重复此过程，并在第二次洗涤后去除所有乙醇。

从磁力架中取出试管，将内容物风干 5 分钟。向干燥的珠子中加入 30 微升分子级水，并移液 10 次混合。在室温下孵育 2 分钟。

将试管放回磁力架上 1 分钟，以将磁珠与溶液分离。将洗脱液转移到新试管中。使用台式荧光计测量清洁、混合的 DNA 的最终浓度。

将等分试样稀释至 10 纳摩尔，最终体积为 30 μL，或稀释至测序设施首选的浓度和体积。扩增步骤之后，进行测序以确定每个样品的细菌群落组成。PNA 序列与所研究植物宿主的每个叶绿体和线粒体 16S 核糖体 RNA 基因的比对不应显示任何错配。

与 13 个碱基对 PNA 序列的单个错配会大大降低有效性，例如提供的叶绿体 PNA 序列和 Lactuca sativa 或生菜的叶绿体 16S 核糖体 RNA 基因。由于每个样品混合了等量的扩增 DNA，因此在测序后，每个样品获得了偶数个与细菌分类群匹配的读数，并根据其条形码索引进行排序。一旦掌握，这项技术可以在大约 8 小时内完成 8 株植物。

在尝试此过程时，实验之间保持一致非常重要。DNA 提取方法和 PCR 预混液的变化等小细节可能会引入偏倚。按照这个程序，可以使用其他方法（如元转录组学）来回答其他问题，例如哪些微生物是活跃的，它们表达什么基因？

不要忘记，使用液氮可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护装备。