多年生草试验中土壤、根际和根系微生物群落的分离与分析

这种方法可以帮助回答土壤、根际和根内圈微生物组领域的关键问题，例如微群落多样性如何响应样本类型、处理和植物基因型而变化。该技术的主要优点是它非常适合需要大量样品和复制的现场实验。演示该程序的是我和我实验室的研究生和研究技术员 Stephanie Futrell。

要开始该方案，请在洗脸盘和水桶上贴上带有植物样品详细信息的便利贴。将贴有标签的桶带到地块，并将清洗盘留在田间已建立的工作站。从地块内的不同区域随机选择并收集每个地块的两株植物。

接下来，用铲子将土壤刺入 30 厘米深处，以切断将植物固定在土壤中的任何侧根。用铲子挖出植物根部，然后将根球放入贴有标签的桶中。将铲斗带回现场工作站。

摇晃根部，用铁锹或手持式耕耘机去除根部的土壤。戴上手套并将根部放在加工站附近。摇动根部后，在清洗盘中混合土壤，并用手持式耕耘机打碎任何土块。

将无碎屑的土壤样本放入贴有标签的 17.7 x 19.5 厘米拉链储物袋中，然后放在冰上。在 70% 乙醇中对修枝剪刀进行消毒。使用无菌剪刀切除各种根，每株植物大约 4 到 6 根，每个根长约 9 到 12 厘米。

将切除的根放入贴有标签的 50 mL 试管中，该试管含有 35 mL 高压灭菌磷酸盐缓冲液和 Silwet L-77 等表面活性剂。摇动试管 2 分钟，使根际从根部表面释放出来。使用发生器和涡旋器改善振荡。

用 70% 乙醇消毒的镊子，从试管中取出根部，在纸巾上短暂吸干，然后将它们放入一个新的、贴有标签的 50 毫升试管中。将含有根际的试管和含有根的试管都放在冰上。将大约 35 毫升 50% 漂白剂和 0.01% 吐温 20 加入 50 毫升试管中，并在田间收集根部。

涡旋或摇晃试管 30 到 60 秒。倒掉漂白剂，加入 35 毫升 70% 乙醇，再涡旋或摇晃根部 30 到 60 秒。摇晃后，倒出 70% 乙醇，加入 35 毫升无菌超纯水，涡旋或摇动样品 1 分钟。

再重复两次水冲洗步骤，以便用无菌超纯水冲洗根部总共三次。用干燥、干净的纸巾吸干根部，并为每个样品使用干净的纸巾。使用无菌镊子和修枝剪刀，将根部切成大约 5 毫米的小块，然后将切下的根放入干净、贴有标签的 15 毫升锥形管中，然后将样品储存在零下 80 摄氏度下，直到进一步加工。

摇晃现场含有根际样品的 50 毫升试管 20 至 30 秒，以重新悬浮整个样品。使用无菌的 100 微米网状细胞过滤器，将重新悬浮的样品过滤到新的 50 mL 试管中。然后，在室温下以 3， 000 x g 离心试管 5 分钟。

立即倒出并丢弃上清液。将根际颗粒放入 50 毫升试管中，置于冰上。接下来，向根际沉淀中加入 1.5 毫升不含表面活性剂的无菌磷酸盐缓冲液，并涡旋以重新悬浮样品。

将悬浮液体移液到干净的、贴有标签的 2 毫升微量离心管中。在室温下以 15， 871 x g 离心试管 2 分钟。立即倒出上清液，用干净的纸巾排干试管。

将颗粒储存在零下 20 摄氏度，直到进一步加工。使用无菌金属刮刀，在干净的、贴有标签的 2 毫升试管中加入大约 3 克用于 DNA 提取的土壤，避免使用任何小根块和碎屑。在每个样品之间用 70% 乙醇冲洗金属刮刀。

将此土壤样品储存在零下 20 摄氏度。在干净的洗涤盘中，将泥土袋倒入堆叠的筛子中，较大的筛子放在较小的筛子上，然后通过两个筛子手动筛土。使用刷子仔细清洁样品之间的筛子。

将 100 至 125 克过筛的土壤放在一个 17.7 x 19.5 厘米的拉链袋中，以备将来进行土壤理化和质地分析。将泥土袋放在 4 摄氏度下进行短期储存。接下来，将液氮倒入带有干净抹刀和干净砂浆的塑料烧杯中。

将冷冻的组织放入研钵中，用研杵研磨成细粉。在整个研磨过程中不断添加液氮，以保持样品冷冻。使用刮刀将磨碎的组织转移到干净、贴有标签的 2 毫升管中，然后将组织储存在零下 80 摄氏度。

用 70% 乙醇和 1% 家用漂白剂擦拭工作区域。从零下 20 摄氏度的储存中取出土壤样品，并在冰桶中解冻。从 96 孔萃取板上取下密封垫盖，将盖子放在两张纸巾之间，以便在不使用时保持清洁。

用 8 孔 PCR 联管粘性覆盖板的 12 根色谱柱，以避免污染。在秤上去皮一个无菌的小称重漏斗，称出 200 至 250 毫克的土壤。小心地提起胶条，将装满的称量漏斗的颈部放入适当的孔中，然后轻轻地将土壤样品引入适当的孔中。

更换胶条以覆盖孔。对每个孔重复此过程，为每个样品使用新的无菌漏斗。更换提取板上的密封垫盖，并将板储存在零下 20 摄氏度，直到准备好提取 DNA。

从零下 20 摄氏度的储存中取出根际样品，并在冰桶中解冻。如上一节所述准备 DNA 提取板。将干净的纸巾放在秤上，然后用无菌金属刮刀在秤上去皮。

用刮刀小心地从样品管中舀出一些根际沉淀。称取 200 至 250 毫克根际样品。小心地提起胶条，露出提取板的第一个孔。

将装满的刮刀倾斜到孔中，然后用无菌牙签将根际材料刮入适当的孔中。用水冲洗金属刮刀，然后在样品之间用 70% 乙醇冲洗。最后，对板的每个孔重复此过程，直到板装满，留下一个空孔作为提取空白对照。

在这个具有代表性的数据集中，样本类型之间存在非常显著的差异，根际和土壤的组成似乎比根系更相似。进一步分析表明，根际和土壤之间的微生物群落组成也存在极显著的差异。α 多样性分析表明，内圈中的微生物群落低于土壤和根际中的群落。

草种之间多样性的唯一显着差异是大蓝茎和柳枝稷的内圈样品之间。相对丰度分析突出了变形菌门在所有样品类型中的优势，其次是放线菌门。土壤和根际以酸杆菌门和绿弯菌属为主，而根部的细菌属相对丰度较高。

所有样品类型的 PERMANOVA 分析阐明了由于植物物种引起的微生物群落组成的高度显着差异。观看此视频后，您应该对如何执行一系列步骤以用于土壤、内圈和根际微生物组的研究有很好的了解。我们要感谢内布拉斯加州 EPSCoR 和美国国家科学基金会 EPSCoR 研究基础设施计划轨道 1 为本教育视频提供部分资金。