多年生草本植物实验中土壤、根际及根部微生物群落的分离与分析

该方法有助于回答土壤、根际和根内微生物组领域中的关键问题，例如微生物群落多样性如何响应样本类型、处理方式和植物基因型而变化。该技术的主要优势在于，它非常适合需要大量样本和重复的田间试验。演示该实验流程的将是我本人以及来自我实验室的研究生兼研究技术员Stephanie Futrell。

开始实验步骤时，使用带有植物样品信息的便利贴标记一个清洗盘和一个桶。将标记好的桶带至样地，而将清洗盘留在田间已设立的工作站处。从样地内的不同区域随机选取并采集每块样地的两株植物。

接下来，用铁锹刺入土壤至30厘米深度，切断固定植株的侧根。利用铁锹撬动，挖出植物根系，并将根团放入已标记的桶中。将桶带回田间的工作站。

轻轻摇动根部，并使用铁锹或手持式耕机清除根部的土壤。戴上手套，将根部放置在处理工作站附近。摇动根部后，在清洗盆中混合土壤，并用手持式耕机打碎任何土壤结块。

将无杂物的土壤样品放入已标记的、尺寸为17.7 × 19.5厘米的拉链密封袋中，并置于冰上。用70%乙醇对修枝剪进行灭菌。使用无菌剪刀从每株植物上切取4至6条根，每条根长约9至12厘米。

将切除的根置于含有35毫升灭菌磷酸盐缓冲液（添加Silwet L-77等表面活性剂）的已标记50毫升离心管中。振荡管子2分钟，以使根际从根表面释放。使用振荡器和涡旋仪提高振荡效果。

用70%乙醇灭菌的镊子将根从管中取出，在纸巾上短暂吸干，然后放入一个新的、已标记的50毫升离心管中。将装有根际的管子和装有根的管子都置于冰上。向在田间采集的根所放入的50毫升离心管中加入约35毫升50%次氯酸钠溶液（含0.01%吐温20）。

将试管涡旋或振荡30至60秒。倒掉次氯酸钠溶液，加入35毫升70%乙醇，再对根部涡旋或振荡30至60秒。振荡后，倒掉70%乙醇，加入35毫升无菌超纯水，涡旋或振荡样品1分钟。

再重复水洗步骤两次，使根部总共接受三次无菌超纯水冲洗。将根部放在干燥、洁净的纸巾上吸干，并为每个样品使用一张新的洁净纸巾。使用无菌镊子和修枝剪，将根部分切成约五毫米长的片段，并将切好的根放入干净且标记好的15毫升锥形管中，随后将样品储存于负80摄氏度，待后续处理。

轻轻振荡装有田间根际样品的50毫升离心管，持续20至30秒，以重新悬浮整个样品。使用无菌的100微米孔径细胞筛网，将重新悬浮的样品过滤至新的50毫升离心管中。随后，在室温下以3,000 ×g离心5分钟。

立即倒掉并弃去上清液。将根际沉淀物放入装有冰的50毫升离心管中。接着，向根际沉淀物中加入1.5毫升无表面活性剂的无菌磷酸盐缓冲液，并涡旋振荡以重新悬浮样品。

用移液器将悬浮液转移至洁净、已标记的2毫升微量离心管中。在室温下以15,871 ×g离心2分钟。立即倒掉上清液，并将离心管倒置于洁净的纸巾上沥干。

将沉淀物保存在零下20摄氏度，直至进一步处理。使用无菌金属刮勺，将约三克土壤装入洁净并已标记的2毫升离心管中用于DNA提取，注意避免混入细小根段和杂质。每处理一个样品后，用70%乙醇冲洗金属刮勺。

将该土壤样品在 -20 摄氏度下保存。在洁净的洗样盘中，将土壤倒入叠放的筛子中，较大的筛子置于较小的筛子上方，手动将土壤过筛，依次通过两个筛子。使用刷子在样品之间仔细清洁筛子。

取100至125克过筛土壤，置于一个17.7厘米×19.5厘米的带封口塑料袋中，用于后续土壤理化性质和质地分析。将装有土壤的袋子在4°C条件下短期保存。随后，用洁净的刮勺将液氮倒入洁净的研钵中的塑料烧杯内。

将冷冻的组织放入研钵中，用研杵研磨成细粉。研磨过程中需持续加入液氮，以保持样品处于冷冻状态。用刮勺将研磨后的组织转移至洁净、已标记的2毫升离心管中，随后将组织在-80摄氏度条件下保存。

用 70% 乙醇和 1% 家用漂白剂擦拭工作区域。从 -20 摄氏度保存环境中取出土壤样品，并在冰桶中解冻。取下 96 孔提取板的密封垫盖，将盖子置于两张擦拭纸之间，以保持清洁，避免使用时污染。

使用粘性8孔PCR条带覆盖板上的12列，以避免污染。将无菌的小号称量漏斗置于天平上归零，称取200至250毫克土壤。小心抬起粘性条带，将装有土壤的称量漏斗颈部放入相应的孔中，并轻轻引导土壤样品进入对应的孔内。

更换粘性封条以覆盖孔板。对每个孔重复此操作，每个样本使用一个新的无菌漏斗。将提取板的密封膜盖重新盖好，并将板置于-20摄氏度保存，直至进行DNA提取。

将根际样品从-20°C冰箱中取出，在冰桶中解冻。按照前一节的方法制备DNA提取板。将一张干净的擦拭纸放在天平上，然后将无菌金属刮勺去重归零。

使用刮勺小心地从样品管中取出部分根际沉淀物。称取200至250毫克的根际样品。小心揭开粘性条带，暴露提取板的第一个孔。

将装有样品的刮勺倾斜插入孔中，用无菌牙签刮取根际物质并转移至相应的孔中。每处理一个样品后，先将金属刮勺在水中冲洗，再用70%乙醇浸泡。最后，重复此操作，直至填满整块板的所有孔，仅留一个孔为空白，作为提取空白对照。

在此代表性数据集中，不同样品类型之间存在极显著差异，且根际与土壤在群落组成上比根更相似。进一步分析表明，根际与土壤之间的微生物群落组成也存在极显著差异。Alpha多样性分析显示，内生环境中的微生物群落多样性低于土壤和根际中的微生物群落。

不同草种之间在多样性上的唯一显著差异存在于大须芒草和柳枝稷的内生圈样品之间。相对丰度分析显示，在所有类型的样品中，变形菌门（Proteobacteria）均占主导地位，其次是放线菌门（Actinobacteria）。土壤和根际样品以酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）为主，而根组织中拟杆菌门（Bacteriodetes）的相对丰度更高。

所有样本类型的PERMANOVA分析揭示了不同植物物种间微生物群落组成存在极显著差异。观看本视频后，您应能充分理解如何执行一系列步骤，用于土壤、内生圈及根际微生物组的研究。我们感谢内布拉斯加EPSCoR项目以及美国国家科学基金会EPSCoR研究基础设施计划第一轨道项目对本教育视频的部分资助。