接合交配测定在接合介入转移蛋白的序列特异性分析
January 4th, 2017
在这里，我们提出了一种方案来敲除参与质粒偶联的目标基因，随后使用交配测定分析其缺失的影响。使用缺失或点突变进一步探索基因的功能到其序列的特定区域。
该交配测定的总体目标是评估共轭转移基因内突变对其在功能性 4 型分泌复合物背景下影响质粒转移的能力的影响。该方法允许提出蛋白质特定问题，例如识别转移蛋白之间发生的蛋白质-蛋白质相互作用区域，因为它们在细菌结合中组装功能性 4 型分泌系统。在这种技术中，大共轭质粒上的基因被同源重组敲除。
通过将靶基因提供给较小质粒上的敲除来评估基因功能。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为组织和设置是成功执行此程序的关键。为了获得可解释的结果，适当的实验准备是必要的。
如文本方案中所述，从制备消化的 pBAD33 质粒开始该方案。在琼脂糖凝胶上运行每个消化物。使用 UV 柜和无菌剃须刀，从凝胶中切下 2.8 kg 基带，该基带应溶于导管序列。
快速工作以尽量减少 DNA 的紫外线暴露。根据制造商的方案，使用凝胶提取试剂盒从切出的凝胶切片中提取 DNA。通过聚合酶链反应或 PCR 扩增提取的猫盒。
在无菌 PCR 管中制备反应混合物。使用包含与靶基因序列同源的突出端的引物进行同源重组。设置具有相同组分的阴性对照，但用双蒸水替换模板 DNA。
此外，使用已证明在 PCR 反应中有效的模板 DNA 和引物构建阳性对照。通过移液轻轻混合所有反应内容物。然后，使用文本协议中列出的 PCR 参数扩增提取的猫盒。
每个反应只需使用 5 μL 即可通过琼脂糖凝胶电泳确认正确的扩增大小。使用符合制造商方案的 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 扩增子。将 300 ng 扩增的猫盒添加到 50 微升电感受态 DY330R 细胞中，将 pOX38-Tc 质粒藏在冰上。
轻轻上下移液以混合。使用未修饰的 pBAD33 质粒作为阳性对照重复此步骤。然后，将细胞转移到预冷的 1 毫米电穿孔比色皿中。
使用电穿孔仪以 1.8 KB 电压对细胞进行电穿孔，时间常数为 5.5 毫秒。脉冲后，立即用 1 mL SOC 培养基稀释细胞并转移到新鲜的微量离心管中。将细胞在 32 摄氏度下孵育 2 小时。
接下来，将每个样品的 100 微升分装到含有 10 微克/毫升四环素和 20 微克/毫升氯霉素的琼脂平板中。使用无菌涂布器将等分试样涂布在板上。将板在 32 摄氏度下倒置孵育过夜。
第二天，选择成功的重组体。引入细胞的猫盒将与目标基因发生同源重组，并产生 pOX38-Tc 氯霉素敲除克隆。像以前一样，将电穿孔 300 ng pK184 基因或 pK184 基因突变质粒分离到 50 微升含有 pOX38-Tc 氯霉素敲除质粒的电能 DY330R 细胞中。
为了产生 XK1200，供体细胞进行偶联交配，然后进行电穿孔以产生 XK1200 细胞，如文本方案中所述，氯霉素敲除和 PK184 质粒均受到干扰。用氯霉素和卡那霉素在 20 毫升无菌 LB 中制备这些 XK1200 供体细胞的过夜培养物。此外，使用来自甘油原液或昂琼脂平板上单个菌落的细胞，在 50 毫升 LB 中制备 MC4100 受体细胞，其中含有 50 微克/毫升链霉素。
在 37 摄氏度下培养培养物，以 200 rpm 的速度摇动。向所有供体细胞中加入葡萄糖至终浓度为 100 毫摩尔。第二天，将每个过夜培养物的 1：70 稀释分别放入含有相同抗生素的 2 毫升无菌 LB 中。
在 37 摄氏度下以 200 rpm 振荡，将细胞培养至对数中期。离心细胞培养物以沉淀细胞并弃去上清液。然后，用冷无菌 LB 洗涤细胞沉淀一次以去除抗生素。
像以前一样第二次离心后，我们将细胞悬浮在 2 毫升冷无菌 LB.In 一式两份中，将 100 微升供体细胞和 100 微升受体细胞分装到 800 微升无菌 LB 培养基中，总体积为 1 毫升。让细胞在 37 摄氏度下交配 1 小时而不摇晃。一小时后，涡旋细胞 30 秒以破坏交配对。
然后，将细胞置于冰上 10 分钟以防止进一步交配。使用中对数培养物和新鲜无菌 LB，制备供体和受体细胞的六种连续稀释液，从 1 和 100 到 1000 万个。在含有纳拉地西酸、氯霉素和卡那霉素的琼脂平板的两半上，点取 10 微升 XK1200 供体细胞稀释液的等分试样。
在含有链霉素的琼脂平板上对受体 MC4100 细胞的稀释液重复点样。然后，将板在 37 摄氏度下孵育过夜。接下来，使用涡旋混合物和新鲜的无菌 LB，准备六种稀释的转偶联物。
选择含有 pOX38-Tc 氯霉素敲除的转偶联 MC4100 细胞，在含有链霉素和氯霉素的琼脂平板的每一半上点样 10 微升稀释液。对两个重复的混料重复上述步骤。然后，将板在 37 摄氏度下孵育过夜。
通过计算各自平板上每个供体、受体和转偶联细胞的相同稀释点样的菌落数来计算交配效率。此外，对受体菌落进行计数，以检测在给定稀释度下，转偶联物数量多于受体数量而导致的任何偏差。将交配效率计算为转结合菌落的数量除以供体菌落的数量，再乘以 100 得到每 100 个供体细胞的效率值。
当 4 型分泌系统基因 tra-F 从 pOX38-Tc 质粒中敲除时，导致 pOX38-Tc traF 氯霉素敲除质粒从供体细胞到受体细胞的共轭转移丢失。然而，当 PK184 traF 质粒和供体细胞以反式方式提供 traF 基因时，观察到 pOX38-Tc traF 氯霉素敲除质粒的结合转移的恢复。当在供体细胞中提供 traF 和 PK184 质粒的稀释突变体时，可以观察到 pOX38-Tc traF 氯霉素敲除质粒的偶联转移丢失。
共轭转移的缺失表明蛋白质区域对共轭 4 型分泌系统内的蛋白质-蛋白质相互作用很重要。然后可以通过影响转移效率的点突变更详细地探测该区域。一旦掌握，这项技术就可以在一个工作日内完成，并有预期的生长时间。
该协议可以在此处演示的细胞以外的细胞上完成。在这一点上，关键是供体细胞和受体细胞不包含目标质粒。因此，当您添加敲除质粒时，您不会得到相互冲突的结果。
在尝试此过程时，必须非常有条理，因为供体、受体和转偶联细胞的生长条件和抗生素不同。在此程序之后，可以执行其他方法，例如晶体学、NMR 或质谱法，以获得目标蛋白质的详细结构和功能图片。
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概述
本文介绍了一个用于敲除参与质粒接合的基因并通过交配测定分析其缺失效果的协议。该研究通过使用缺失或点突变探索基因序列的特定区域来进一步调查基因的功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 遗传学
- 细胞生物学
背景
- 理解质粒接合对于细菌遗传学至关重要。
- 四型分泌系统在基因转移中发挥重要作用。
- 同源重组是基因敲除的关键技术。
- 蛋白质-蛋白质相互作用对分泌系统的组装至关重要。
研究目的
- 评估接合转移基因突变的影响。
- 识别细菌接合中蛋白质相互作用的特定区域。
- 为新手提供详细的协议。
所用方法
- 通过同源重组进行基因敲除。
- 使用交配测定评估质粒转移效率。
- 使用较小的质粒来评估基因在敲除中的功能。
- 实验准备和组织以获得成功结果。
主要结果
- 接合转移基因的突变显著影响质粒转移。
- 在研究过程中识别了蛋白质相互作用的特定区域。
- 正确的设置和组织对于可解释的结果至关重要。
- 该协议为未来细菌接合研究提供了基础。
结论
- 该研究增强了对质粒接合中基因功能的理解。
- 识别蛋白质相互作用区域可以为未来的遗传学研究提供信息。
- 该协议为微生物学研究者提供了宝贵的资源。
常见问题
Executive Industry Relevance
Sequence-specific conjugative mating assays enable precise functional dissection of bacterial transfer proteins, directly informing target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial resistance research. Quantitative analysis of mating efficiency following targeted gene knockouts and complementation provides actionable insights into protein domains critical for DNA transfer machinery assembly. This approach supports predictive confidence at the intersection of discovery biology and translational microbiology, with implications for portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of specific transfer protein functions through gene knockout and complementation.
- Supports identification of protein-protein interaction domains essential for conjugative transfer.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking sequence alterations to functional outcomes.
- Provides quantitative benchmarks for target validation in bacterial systems.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, quantitative mating efficiency assays for functional screening of mutants.
- Standardizes biological system preparation for downstream mechanistic or structural studies.
- Enables scalable evaluation of sequence variants impacting transfer efficiency.
- Supports assay readiness for high-confidence compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional protein analysis with structural studies for comprehensive target characterization.
- Provides continuity from genetic manipulation to phenotypic readout in disease-relevant bacterial models.
- Informs risk-adjusted advancement of anti-conjugation strategies in preclinical pipelines.
- Supports translational biomarker identification by linking genotype to functional phenotype.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of bacterial transfer proteins and supporting downstream structural and functional analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein function and interaction within conjugative complexes.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible mating efficiency data for comparative analysis of mutants.
- Analytics: Provides colony count-based efficiency metrics for robust statistical evaluation.
- Translational Research: Bridges genetic manipulation with phenotypic outcomes relevant to antimicrobial resistance.
- Enterprise Reuse: Offers a modular assay platform adaptable to diverse bacterial systems and transfer proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of conjugative transfer.
- Operational Value: Promotes assay standardization, reproducibility, and scalability across research teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and strategies for combating horizontal gene transfer.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, homologous recombination, and quantitative assay design.
- Demands access to molecular biology instrumentation and colony counting infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of growth conditions and antibiotic selection.
- Adaptable to various bacterial strains, provided plasmid compatibility and selection markers are validated.
- Interpretation depends on precise control of experimental variables and robust statistical analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Amplification of the Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) Cassette from pBAD33 Plasmid Using Oligomers Designed for Homologous Pairing
2:38
Generation of pOX38-Tc Δgene::Cm Strains
4:26
Conjugative Mating Assay from XK1200 Donors to MC4100 Recipients
8:38
Results: Transfer Gene Knockout and Recovery of Conjugative DNA Transfer
9:45
Conclusion
