Name: 接合交配测定在接合介入转移蛋白的序列特异性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解接合交配测定在细菌接合转移基因功能研究中的应用。本方法通过同源重组敲除基因并利用质粒互补分析，帮助研究人员鉴定IV型分泌系统中蛋白质相互作用的关键区域。

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本研究得到了自然科学与工程研究理事会发现基金的资助 &amp;#38; 加拿大工程委员会（NSERC）

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</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

细菌接合过程为细菌传播基因提供了途径，使其在恶劣环境中生长时获得进化优势，例如抗生素抗性标记的传播。由于许多接合质粒体积庞大12，通过突变接合质粒本身上的靶基因来研究参与转移装置组装的蛋白质功能，操作上十分不便。本文详述的实验方案提供了一种更便捷的方法，可通过使用更小、更易操作的表达质粒来评估目标基因（图1）。我们采用F质粒衍生物pOX38-Tc（表1）来研究F质粒介导的接合；其他接合质粒也可利用本文所述方案及相应的衍生质粒进行研究。所概述的接合实验方法源自Frost及其同事42，并进行了部分修改。在以往的研究中8,33,42，pOX38-Tc Δ基因::Cm构建体的制备是通过使用适当的限制性内切酶切割目标基因，并将扩增的CAT盒插入pOX38-Tc中实现的42。在当前方法中，我们利用重组工程菌株E. coli DY330R33,34中的同源重组技术，敲除目标基因并用CAT盒替代。该方法的优势在于，所获得的携带pOX38-Tc Δ基因::Cm构...

在微生物层面，基因和蛋白质的转移在细菌的生存与进化以及感染过程中起着核心作用。细菌之间或细菌与细胞之间的DNA交换可以通过转化、接合或载体转导来实现1,2。与转化和转导相比，接合具有独特性，因为在大肠杆菌（Escherichia coli）等革兰氏阴性菌的接合过程中，DNA的转移是以供体细胞为主导的方式进行的，通过一个复杂的多分子系统将供体细胞与受体细胞连接起来。接合也是细菌细胞与宿主细胞相互作用并将基因、蛋白质或化学物质注入宿主系统的最直接途径3。此类物质的转移往往对宿主产生显著影响，从致病性和致癌性到宿主的进化与适应均可能受到影响。已有研究表明，在环境胁迫条件下，对于高突变率的细菌而言，接合重组可使其适应速率提高3倍4。此外，接合是目前细菌菌株中抗生素抗性基因传播最主要的途径5,6。
微生物进化出了特化的分泌系统，以支持大分子物质穿过细胞膜的转运；目前在革兰氏阴性细菌中已描述了9种类型的分泌系统（TSSs）：T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS、T7SS，以及Sec（分泌）途径和Tat（双精氨酸转运）途径。7,8 每种类型的分泌系统进一步分为不同的亚型，这是由于不同菌株中相关蛋白的多样性和通路的独特性所决定的。例如，在IV型分泌系统（T4SS）中，Ti系统和Cag系统介导效应分子的转运，而F质粒、R27和pKM101的T4SS则介导接合质粒的转移。7,9,10 深入理解生物体如何将其分泌系统的组分蛋白组装成功能结构，并将细胞内容物传递给受体或周围环境的机制，是开发靶向策略以对抗致病性微生物及细胞感染过程的重要因素。
在首次鉴定出细菌接合现象后 E. coli 由 Lederberg &amp;#38; 塔图姆，11 已鉴定并表征了大量可移动和接合型质粒。12 这类可移动质粒的大小范围较大（从1到超过200千碱基对（kb）），但所有可移动质粒均含有松弛酶（relaxase），该酶可识别转移起始位点（oriT），从而介导质粒的转移。接合型质粒还编码合成功能性IV型分泌系统（T4SS）所需的基因以及一种IV型偶联蛋白。12 例如，100 kb 的 F 质粒 E. coli 在一个33.3 kB的转移（tra）区段内编码了所有的接合基因。13 基因在 tra F质粒的该区域编码所有促进菌毛形成、接合对形成（Mpf）、DNA转移以及在接合质粒转移过程中发挥排斥功能的蛋白质。10,14,15 目前对结合型T4SS已有大量研究积累，但针对结合蛋白及其复合物的详细结构研究直到近期才逐渐取得进展。16-28
为了全面理解接合过程，需要将接合转移蛋白的详细结构研究与其突变分析相结合。这可通过接合交配实验实现。对于F质粒，其内部编码的每种蛋白 tra 该区域在F介导的接合中发挥作用；因此，转移基因的敲除或缺失将消除细胞的接合能力（图1尽管较小的移动性质粒更适用于标准的缺失操作，但对于F质粒等较大的接合性质粒而言，通过同源重组将目标基因替换为具有特定抗生素抗性的基因，能更高效地实现基因敲除。在本实验方案中，我们采用同源重组方法，将55 kb的F质粒衍生物pOX38-Tc中的一个目标转移基因替换为氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因。29,30 所得的敲除质粒 pOX38-Tc Δgene::Cm 可使细菌在含有氯霉素（Cm）的培养基中具有抗性。携带 pOX38-Tc Δgene::Cm 的供体细胞无法进行接合 DNA 转移/接合交配，这一点通过接合实验已得到证实；pOX38-Tc Δgene::Cm 供体细胞与正常受体细胞之间的接合效率会降低，更常见的是完全丧失。pOX38-Tc Δgene::Cm 质粒的接合转移能力可通过携带目标转移基因的小型恢复质粒得以恢复。该恢复质粒可为提供组成型表达的质粒，例如质粒 pK184（pK184-gene）31 或提供可诱导表达的质粒，只要该质粒能将基因正确靶向细胞内的特定位置（细胞质或周质空间）。因此，在这种新型供体菌（含有 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene 质粒）的接合实验中 以及受体细胞的交配效率应恢复至接近正常的供体-受体交配实验水平。该系统可通过构建一系列pK184-gene载体（包括缺失突变或点突变），并逐一检测各载体恢复携带pOX38-Tc Δgene::Cm的供体细胞交配能力的效果，从而探究被敲除基因的功能。

<table><tbody><tr><td>GeneJet 质粒小提试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet 凝胶回收试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet PCR 纯化试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 定点突变试剂盒</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>宽范围 DNA Marker</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FB101</td><td>比色皿间隙为 1 mm。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA 聚合酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗生素&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>氯霉素（Cm）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP904-100</td><td>20 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>卡那霉素（Km）</td><td>BioBasic 公司</td><td>DB0286</td><td>50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>萘啶酸（Nal）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>利福平（Rif）</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>四环素（Tc）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP912-100</td><td>10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>链霉素（Sm）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP910-50</td><td>50 &amp;micro;g/mL</td></tr></tbody></table>

用于细菌接合转移蛋白序列特异性分析的接合交配实验

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

通过细菌接合转移遗传物质是一种通过特定转移蛋白形成的复合物介导的过程。在大肠杆菌（Escherichia coli）中，这些转移蛋白构成了一种被称为接合对形成或DNA转移复合物的DNA转移装置，可促进接合性质粒的转移。本文的目的是提供一种方法，通过一系列缺失突变和/或点突变结合接合实验，来确定特定接合转移蛋白的功能。目标基因首先在接合性质粒上被敲除，然后通过携带该目标基因的小型恢复性质粒以反式方式提供。恢复性质粒上目标基因的突变可揭示目标蛋白功能特性方面的信息，这些突变会导致携带突变基因的供体细胞接合效率发生改变。接合效率的变化有助于理解特定转移蛋白或其某个区域在促进接合性DNA转移过程中的作用和重要性。将该接合实验与详细的三维结构研究相结合，将全面揭示接合转移蛋白的功能，并为鉴定和表征蛋白质-蛋白质相互作用区域提供有效手段。

F质粒驱动的细菌接合过程是一个协调过程，涉及接合转移蛋白 tra F质粒中负责组装IV型分泌系统（T4SS）以促进菌毛合成和接合DNA转移的区域。接合F菌毛的形成需要TraF蛋白（GenBank登录号 BAA97961；UniProt ID P14497）。10,14,35-37 该蛋白含有一个C端硫氧还蛋白样结构域，但缺乏催化作用的CXXC基序。35,38 尽管已预测其通过N端结构域与TraH蛋白相互作用，39 一个被证明比其C端结构域更具有动态性的区域，37 关于该蛋白的结构特征，目前所知甚少。为了在结构研究的基础上评估 TraF 蛋白的功能特性，我们首先敲除了 traF 通过同源重组将基因插入 pOX38-Tc，生成 pOX38-Tc ΔtraF::Cm 质粒 (表1) 在 E. coli DY330R 细胞33,34</...

本文介绍了一种敲除参与质粒接合的靶基因并利用接合实验分析其缺失影响的实验方案。通过缺失突变或点突变，进一步将该基因的功能定位至其序列的特定区域。

通过接合蛋白形成的特定复合物，细菌接合介导的遗传物质转移是一种在大肠杆菌（Escherichia coli）中发生的过程。

本交配实验的总体目标是评估接合转移基因内的突变对其在功能性Ⅳ型分泌复合物背景下影响质粒转移能力的作用。该方法可用于提出针对特定蛋白质的科学问题，例如鉴定在接合过程中转移蛋白组装功能性Ⅳ型分泌系统时，蛋白间相互作用发生的区域。在本技术中，通过同源重组敲除大型接合质粒上的基因。通过将目标基因搭载在较小的质粒上提供给基因敲除个体，从而评估基因功能。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为实验的组织与准备工作是成功实施该操作的关键。必须进行恰当的实验准备，才能获得可解读的结果。按照文本方案中的描述，开始本实验前首先准备经消化的 pBAD33 质粒。将每种酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。使用紫外透射仪和无菌剃刀，从凝胶中切下对应于 cath 序列的 2.8 千碱基条带。操作需迅速，以尽量减少 DNA 的紫外线暴露。使用凝胶回收试剂盒，按照制造商的说明书从切下的凝胶条带中提取 DNA。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增提取的 cat 筛选标记片段。在无菌的PCR管中配制反应混合物。使用含有与目标基因序列同源的末端序列的引物，以用于同源重组。设置一个阴性对照，其成分与反应体系相同，但将模板DNA替换为双蒸水。同时，使用已证实可在PCR反应中有效扩增的模板DNA和引物建立阳性对照。通过移液操作轻轻混匀所有反应组分。然后，根据文本方案中列出的PCR参数扩增提取的cat基因片段。仅使用每种反应产物5 µL，通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段大小正确。使用PCR纯化试剂盒，按照制造商提供的方案纯化PCR扩增产物。将300 纳克扩增后的cat基因盒加入到50 µL含有pOX38-Tc质粒的冰上放置的电转化感受态DY330R细胞中。轻轻吹打混匀。使用未修饰的 pBAD33 质粒作为阳性对照重复此步骤。然后，将细胞转移至预冷的 1 毫米电穿孔杯中。使用电穿孔仪，在1.8千伏电压下对细胞进行电穿孔，时间常数为5.5毫秒。脉冲结束后立即用1毫升SOC培养基稀释细胞，并转移至新的微量离心管中。将细胞在32摄氏度下孵育2小时。接下来，取100微升每种样品，分别接种到含有10微克/毫升四环素和20微克/毫升氯霉素的琼脂平板上。使用无菌涂布棒将样品均匀涂布于平板表面。将平板倒置于32摄氏度培养过夜。第二天，筛选成功的重组子。导入细胞的cat基因盒将与目的基因发生同源重组，从而构建pOX38-Tc氯霉素敲除克隆。将300纳克pK184基因或pK184基因突变型质粒分别加入到50微升含有pOX38-Tc氯霉素敲除质粒的电转感受态DY330R细胞中，操作方法同前。为获得XK1200供体细胞，需先进行接合交配，随后进行电穿孔，以获得同时携带氯霉素敲除片段和PK184质粒的XK1200细胞，具体操作如文本方案所述。用20毫升含氯霉素和卡那霉素的无菌LB培养基制备XK1200供体细胞的过夜培养物。同时，使用甘油保存菌种或琼脂平板上的单菌落，接种于50毫升含50微克/毫升链霉素的LB培养基中，制备MC4100受体细胞。将培养物在37摄氏度、200 rpm振荡条件下培养。向所有供体细胞中加入葡萄糖，使其终浓度为100毫摩尔。次日，将每种过夜培养物分别用含有相同抗生素的2毫升无菌LB培养基按1:70比例稀释。在37摄氏度、200 rpm振荡条件下将细胞培养至对数中期。离心菌液以沉淀细胞，并弃去上清液。随后用预冷的无菌LB培养基洗涤菌体沉淀一次，以去除抗生素。按照之前的方法再次离心后，将细胞重悬于2毫升冷的无菌LB培养基中。取100微升供体细胞和100微升受体细胞，分别加入800微升无菌LB培养基中（总体积为1毫升），每个处理设两个重复。将细胞在37摄氏度下孵育1小时，期间不振荡，以允许细胞接合。孵育1小时后，涡旋振荡细胞30秒，以破坏接合对。然后，将细胞置于冰上10分钟，以防止进一步接合。使用对数中期培养物和新鲜无菌的LB培养基，将供体和受体细胞分别从1:100至1:1000万进行六倍系列稀释。在含有萘啶酸、氯霉素和卡那霉素的琼脂平板的两个半区上，分别点样10微升各稀释度的XK1200供体细胞。将受体MC4100细胞的不同稀释液重复点样于含有链霉素的琼脂平板上，然后在37摄氏度下过夜培养。接着，使用涡旋振荡混合物和新鲜无菌LB培养基，制备六种不同稀释度的接合子。通过将每个稀释度的十微升等分试样点样到含有链霉素和氯霉素的琼脂平板的每一半，筛选含有 pOX38-Tc 氯霉素敲除质粒的转接合子 MC4100 细胞。对两份重复混合物均进行重复操作。然后，在 37 摄氏度下将平板过夜培养。通过计数各供体、受体及接合子细胞在相应平板上相同稀释度点样所形成的菌落数量，计算交配效率。同时，计数受体菌落，以检测在该稀释度下接合子数量多于受体时可能产生的偏差。将接合子菌落数除以供体菌落数，再乘以100，计算每100个供体细胞的交配效率值。当将 pOX38-Tc 质粒中的 IV 型分泌系统基因 traF 敲除后，会导致 pOX38-Tc traF 氯霉素抗性敲除质粒从供体细胞向受体细胞的接合转移能力丧失。然而，当在供体细胞中通过 PK184 traF 质粒以反式提供 traF 基因时，可观察到 pOX38-Tc traF 氯霉素抗性敲除质粒的接合转移能力恢复。当供体细胞中含有 traF 基因的不同稀释突变体以及 PK184 质粒时，可观察到 pOX38-Tc traF 氯霉素抗性敲除质粒的接合转移能力丧失。接合转移能力的丧失表明了该蛋白在接合型 IV 分泌系统内参与蛋白-蛋白相互作用的关键区域。随后可通过影响转移效率的点突变对该区域进行更深入的研究。一旦掌握，该技术可在一个工作日内完成，并包含预期的培养时间。本方案可用于本文所展示之外的其他细胞。目前关键的一点是，供体细胞和受体细胞均不携带目标质粒。这样在加入敲除质粒后，不会产生干扰性结果。在进行该实验操作时，必须保持高度的条理性，因为供体细胞、受体细胞和接合子细胞具有不同的培养条件和抗生素需求。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如晶体学、核磁共振（NMR）或质谱分析，以获得目标蛋白的详细结构与功能信息。

conjugative-mating-assays-for-sequence-specific-analysis-transfer

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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来源： Erdogan, F.,et al., 用于分析细菌接合中转移蛋白序列特异性的接合交配实验。J. Vis. Exp. (2017)本视频演示了使用救援质粒将F质粒从供体菌转移至受体菌大肠杆菌（E.

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