Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

该交配测定的总体目标是评估共轭转移基因内突变对其在功能性 4 型分泌复合物背景下影响质粒转移的能力的影响。该方法允许提出蛋白质特定问题，例如识别转移蛋白之间发生的蛋白质-蛋白质相互作用区域，因为它们在细菌结合中组装功能性 4 型分泌系统。在这种技术中，大共轭质粒上的基因被同源重组敲除。

通过将靶基因提供给较小质粒上的敲除来评估基因功能。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为组织和设置是成功执行此程序的关键。为了获得可解释的结果，适当的实验准备是必要的。

如文本方案中所述，从制备消化的 pBAD33 质粒开始该方案。在琼脂糖凝胶上运行每个消化物。使用 UV 柜和无菌剃须刀，从凝胶中切下 2.8 kg 基带，该基带应溶于导管序列。

快速工作以尽量减少 DNA 的紫外线暴露。根据制造商的方案，使用凝胶提取试剂盒从切出的凝胶切片中提取 DNA。通过聚合酶链反应或 PCR 扩增提取的猫盒。

在无菌 PCR 管中制备反应混合物。使用包含与靶基因序列同源的突出端的引物进行同源重组。设置具有相同组分的阴性对照，但用双蒸水替换模板 DNA。

此外，使用已证明在 PCR 反应中有效的模板 DNA 和引物构建阳性对照。通过移液轻轻混合所有反应内容物。然后，使用文本协议中列出的 PCR 参数扩增提取的猫盒。

每个反应只需使用 5 μL 即可通过琼脂糖凝胶电泳确认正确的扩增大小。使用符合制造商方案的 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 扩增子。将 300 ng 扩增的猫盒添加到 50 微升电感受态 DY330R 细胞中，将 pOX38-Tc 质粒藏在冰上。

轻轻上下移液以混合。使用未修饰的 pBAD33 质粒作为阳性对照重复此步骤。然后，将细胞转移到预冷的 1 毫米电穿孔比色皿中。

使用电穿孔仪以 1.8 KB 电压对细胞进行电穿孔，时间常数为 5.5 毫秒。脉冲后，立即用 1 mL SOC 培养基稀释细胞并转移到新鲜的微量离心管中。将细胞在 32 摄氏度下孵育 2 小时。

接下来，将每个样品的 100 微升分装到含有 10 微克/毫升四环素和 20 微克/毫升氯霉素的琼脂平板中。使用无菌涂布器将等分试样涂布在板上。将板在 32 摄氏度下倒置孵育过夜。

第二天，选择成功的重组体。引入细胞的猫盒将与目标基因发生同源重组，并产生 pOX38-Tc 氯霉素敲除克隆。像以前一样，将电穿孔 300 ng pK184 基因或 pK184 基因突变质粒分离到 50 微升含有 pOX38-Tc 氯霉素敲除质粒的电能 DY330R 细胞中。

为了产生 XK1200，供体细胞进行偶联交配，然后进行电穿孔以产生 XK1200 细胞，如文本方案中所述，氯霉素敲除和 PK184 质粒均受到干扰。用氯霉素和卡那霉素在 20 毫升无菌 LB 中制备这些 XK1200 供体细胞的过夜培养物。此外，使用来自甘油原液或昂琼脂平板上单个菌落的细胞，在 50 毫升 LB 中制备 MC4100 受体细胞，其中含有 50 微克/毫升链霉素。

在 37 摄氏度下培养培养物，以 200 rpm 的速度摇动。向所有供体细胞中加入葡萄糖至终浓度为 100 毫摩尔。第二天，将每个过夜培养物的 1：70 稀释分别放入含有相同抗生素的 2 毫升无菌 LB 中。

在 37 摄氏度下以 200 rpm 振荡，将细胞培养至对数中期。离心细胞培养物以沉淀细胞并弃去上清液。然后，用冷无菌 LB 洗涤细胞沉淀一次以去除抗生素。

像以前一样第二次离心后，我们将细胞悬浮在 2 毫升冷无菌 LB.In 一式两份中，将 100 微升供体细胞和 100 微升受体细胞分装到 800 微升无菌 LB 培养基中，总体积为 1 毫升。让细胞在 37 摄氏度下交配 1 小时而不摇晃。一小时后，涡旋细胞 30 秒以破坏交配对。

然后，将细胞置于冰上 10 分钟以防止进一步交配。使用中对数培养物和新鲜无菌 LB，制备供体和受体细胞的六种连续稀释液，从 1 和 100 到 1000 万个。在含有纳拉地西酸、氯霉素和卡那霉素的琼脂平板的两半上，点取 10 微升 XK1200 供体细胞稀释液的等分试样。

在含有链霉素的琼脂平板上对受体 MC4100 细胞的稀释液重复点样。然后，将板在 37 摄氏度下孵育过夜。接下来，使用涡旋混合物和新鲜的无菌 LB，准备六种稀释的转偶联物。

选择含有 pOX38-Tc 氯霉素敲除的转偶联 MC4100 细胞，在含有链霉素和氯霉素的琼脂平板的每一半上点样 10 微升稀释液。对两个重复的混料重复上述步骤。然后，将板在 37 摄氏度下孵育过夜。

通过计算各自平板上每个供体、受体和转偶联细胞的相同稀释点样的菌落数来计算交配效率。此外，对受体菌落进行计数，以检测在给定稀释度下，转偶联物数量多于受体数量而导致的任何偏差。将交配效率计算为转结合菌落的数量除以供体菌落的数量，再乘以 100 得到每 100 个供体细胞的效率值。

当 4 型分泌系统基因 tra-F 从 pOX38-Tc 质粒中敲除时，导致 pOX38-Tc traF 氯霉素敲除质粒从供体细胞到受体细胞的共轭转移丢失。然而，当 PK184 traF 质粒和供体细胞以反式方式提供 traF 基因时，观察到 pOX38-Tc traF 氯霉素敲除质粒的结合转移的恢复。当在供体细胞中提供 traF 和 PK184 质粒的稀释突变体时，可以观察到 pOX38-Tc traF 氯霉素敲除质粒的偶联转移丢失。

共轭转移的缺失表明蛋白质区域对共轭 4 型分泌系统内的蛋白质-蛋白质相互作用很重要。然后可以通过影响转移效率的点突变更详细地探测该区域。一旦掌握，这项技术就可以在一个工作日内完成，并有预期的生长时间。

该协议可以在此处演示的细胞以外的细胞上完成。在这一点上，关键是供体细胞和受体细胞不包含目标质粒。因此，当您添加敲除质粒时，您不会得到相互冲突的结果。

在尝试此过程时，必须非常有条理，因为供体、受体和转偶联细胞的生长条件和抗生素不同。在此程序之后，可以执行其他方法，例如晶体学、NMR 或质谱法，以获得目标蛋白质的详细结构和功能图片。