一种用于测定生物体温度偏好的温度梯度实验方法 果蝇 幼虫

该方法可用于解决体感研究领域中的一个关键问题，即果蝇（drosophila melanogaster）等动物选择其偏好的环境温度的机制。该技术的主要优势在于，当面对连续的温度梯度时，可在单次实验中确定一群幼虫的偏好温度。除了有助于了解果蝇幼虫的温度偏好外，IMPress平板法还可适用于其他模式生物，例如线虫（C elegans）。

首先，制备酵母糊以准备杂交用的试管。将酵母颗粒与蒸馏水混合，并用研杵研磨成糊状。然后，在标准果蝇试管内壁靠近培养基表面的上方，涂抹少量酵母糊。

为获得幼虫，收集12至35只雌蝇以及不超过10只、数量约为雌蝇一半的雄蝇。将这些果蝇组合放入含有酵母糊的试剂瓶中。将准备好的试剂瓶装入可容纳100个试剂瓶的托盘中。

在托盘中放入20个装有水的敞口小瓶以提供湿度。然后将托盘密封于透明塑料袋中，在25摄氏度下孵育48小时。在喂食和交配48小时后，将果蝇转移至新的培养瓶中以收集卵。

将它们轻轻敲至另一培养瓶中，切勿使用二氧化碳。随后，在25摄氏度条件下让果蝇产卵三小时。

随后，移除成虫，将含有卵的试剂管放回装有水试剂管的托盘中，并封好袋子。然后，在25摄氏度下将卵培养至所需的幼虫阶段。为建立单向浓度梯度，首先为检测实验创建一个人类环境条件。

将两个连接至独立水浴的铝块放置在湿润的纸巾上，相距10厘米。水浴需提前预热。接着，配制100毫升1%琼脂糖溶液，并在水平表面上向每个检测平板中各加入25毫升。

待琼脂糖凝固后，用三聚氰胺海绵轻轻擦拭其表面，使表面略微粗糙。随后，为促进高效的温度传递，使用喷雾瓶向检测板中铝块之间的缝隙加水，填满所有空隙。接着，将检测板放置在铝块上，并确保检测板的标记线距离两侧边缘均为两厘米，以精确对齐铝块的边缘。

接下来，向培养皿表面喷洒一层水，以防止凝胶干燥。然后用纸板箱覆盖整个系统，以减少蒸发并帮助稳定凝胶表面的温度。静置5到10分钟，使温度达到平衡。

然后，在培养皿上至少选择12个位置检测表面温度，确保整体温度均匀，允许正负2摄氏度的偏差。随后盖上盒子盖子，直至开始进行检测。为分离出纯净的幼虫，首先向一个50毫升的试管中加入约40毫升18%的蔗糖溶液。

然后用刮勺将幼虫从食物堆转移到溶液中。接着，用刮勺将幼虫在溶液中充分混匀。现在，静置30至60秒，等待幼虫上浮至试管的顶层。

然后将含有幼虫的溶液倒入另一个50毫升离心管中，并用新鲜的18%蔗糖溶液加满。再次等待幼虫上浮。食物的存在可能影响实验结果。

因此，为了获得可重复的实验结果，彻底清洗幼虫以尽量减少食物污染至关重要。操作时应轻柔，避免对幼虫造成损伤。接下来，将一个孔径300微米的细胞筛置于50毫升离心管上方，然后从蔗糖溶液表面移除所有死亡的成虫尸体及漂浮杂质。

现在，将幼虫倒入滤器中，使其收集在网筛上。然后，用约50毫升水冲洗滤器两次，以进一步清洗幼虫。接着，将大部分幼虫用水从滤器冲洗到一个空的35毫米培养皿中。

使用画笔将筛网上的剩余幼虫转移。然后用移液管吸走培养皿中的大部分水。接着将培养皿的盖子倒扣在皿上，以防止幼虫逃逸。

现在，让幼虫恢复10至20分钟，然后开始实验。首先，移去覆盖在凝胶上的纸板箱，并快速检查凝胶表面温度。如果表面干燥，可在表面喷少量水。

如果凝胶状态良好，则使用小号画笔将100至200条幼虫加载到每块平板的中心位置。然后，在每块检测平板上盖上盖子以困住幼虫，并用纸板箱罩住整个装置，避免光照。此时，检测实验已开始进行。

10 到 30 分钟后，移去纸板箱和微孔板盖。然后从上方拍摄平板，记录幼虫的位置。将纸板箱置于相机上方，以避免凝胶表面产生反光。

为了清理培养板，吸除所有可能散落的幼虫。现在，使用图像分析软件计算每个区域中幼虫的百分比分布。根据检测板上的刻度标记，每两厘米划一条线，并统计每个区域内的幼虫数量。

计数时，忽略分布在距边缘0.5厘米处的幼虫，因为凝胶边缘附近的厚度和温度条件不均匀。在18摄氏度至28摄氏度条件下，使用设定为16.8摄氏度和31摄氏度的水浴装置建立单向温度梯度。沿梯度方向的温度分布接近线性。

对照组幼虫在不同龄期进行了检测。一龄、二龄和早期三龄幼虫对24°C区域表现出最高的偏好性。在三龄中期，大多数幼虫聚集在18°C区域。

未游走的三龄晚期幼虫紧密聚集在18摄氏度区域。对照品系（White 1118）的三龄晚期幼虫倾向于聚集在18摄氏度区域的现象并非由于边缘效应所致，因为在使用双向梯度时，这些幼虫仍会聚集在18摄氏度区域。当我们分析携带温度分辨相关基因突变的三龄晚期幼虫时，结果发生了改变。

在trpA1基因上具有无效突变的幼虫在18摄氏度至28摄氏度的温度梯度中分布均匀。仅缺失trpA1基因A和B亚型或C和D亚型的幼虫也表现出严重的功能障碍。在编码磷脂酶Cβ的两个基因之一norpA上具有突变的幼虫同样表现出行为紊乱。

然而，编码另一种磷脂酶C β（plc21c）的基因发生突变的幼虫则表现出正常行为。观看本视频后，您应能清楚地了解如何利用连续的温度梯度获得可重复的实验结果，从而比较野生型与突变型黑腹果蝇幼虫的温度偏好。一旦掌握该技术，单次检测可在30分钟内完成。

进行该实验操作时，需注意观察果蝇培养瓶的状态，若培养瓶干燥则不应使用其中的幼虫。该技术有助于简化发现果蝇幼虫在适宜温度范围内选择偏好温度所需新基因的过程。