Name: 基于数字PCR的沙门氏菌健康高通量分析竞争指数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 了解基于数字PCR的高通量分子技术，用于精确量化混合菌群中高度相似菌株的微生物。该方法通过基因组DNA条形码实现沙门氏菌竞争指数的准确测定，适用于多种可遗传操作生物的适应性比较研究。

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本研究的资助来自 George F. Haddix 校长教员研究基金以及美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所（NIH）的资助项目（编号 GM103427）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

<ol><li>Beuzón, C. R., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mixed+infections+with+Salmonella+strains+to+study+virulence+genes+and+their+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo.</a> Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).</li>
<li>Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+mutations+in+invA+and+lpfC+on+the+ability+of+Salmonella+typhimurium+to+cause+murine+typhoid%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).</li>
<li>Vital, M., Hammes, F., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+of+Escherichia+coli+O157+with+a+drinking+water+bacterial+community+at+low+nutrient+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations.</a> Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).</li>
<li>Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+combining+immunofluorescence+and+flow+cytometry+for+improved+understanding+of+competitive+interactions+between+lactic+acid+bacteria+%28LAB%29+and+methicillin-resistant+S.+aureus+%28MRSA%29+in+mixed+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Becker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Salmonella+metabolism+limits+possibilities+for+new+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials.</a> Nature. 440 (7082), 303(2006).</li>
<li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li>
<li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477(2009).</li>
<li>Ahmer, B. M., Gunn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Salmonella+spp.+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 101(2011).</li>
<li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li>
<li>Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767(2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome%E2%80%90wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn%E2%80%90seq%2C+a+high%E2%80%90throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).</li>
<li>Mutalik, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-barcoded+shotgun+expression+library+sequencing+for+high-throughput+characterization+of+functional+traits+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria.</a> Nature Communications. 10 (1), 308(2019).</li>
<li>Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR-based+competitive+index+for+high-throughput+screening+of+Salmonella+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors.</a> Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+redox+balance+by+the+stringent+response+regulatory+protein+promotes+antioxidant+defenses+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).</li>
<li>Poteete, A. R., Fenton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%BB+red-dependent+growth+and+recombination+of+phage+P22%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">λ red-dependent growth and recombination of phage P22.</a> Virology. 134 (1), 161-167 (1984).</li>
<li>McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+SPI2+transcription+by+nitric+oxide-producing%2C+IFN%CE%B3-activated+macrophages+promotes+maturation+of+Salmonella+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).</li>
<li>Shaw, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+has+three+transketolase+enzymes+contributing+to+the+pentose+phosphate+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).</li>
<li>Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemotaxis+in+the+association+of+motile+bacteria+with+intestinal+mucosa%3A+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies.</a> Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).</li>
<li>Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+phoA+gene+fusions+to+identify+a+pilus+colonization+factor+coordinately+regulated+with+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).</li>
<li>Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethidium+monoazide+for+DNA-based+differentiation+of+viable+and+dead+bacteria+by+5%27-nuclease+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR.</a> Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).</li>
<li>Nocker, A., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approaches+toward+preferential+detection+of+viable+cells+using+nucleic+acid+amplification+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques.</a> FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).</li>
<li>Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).</li>
<li>Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+detection+of+live+bacteria+combining+propidium+monoazide+sample+treatment+with+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology.</a> Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).</li>
<li>Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+monitoring+of+disinfection+efficacy+using+propidium+monoazide+in+combination+with+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).</li>
<li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+for+live%2Fdead+distinction+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).</li>
<li>Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alternative+Electron+Acceptor+Tetrathionate+Supports+B12-Dependent+Anaerobic+Growth+ofSalmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+on+Ethanolamine+or+1%2C+2-Propanediol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol.</a> Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).</li>
<li>Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+host+strains+significantly+affect+the+quality+of+small+scale+plasmid+DNA+preparations+used+for+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677(1993).</li>
<li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+in+Escherichia+coli%3A+Tc+R+and+Km+R+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

准确量化微生物的能力对微生物学研究至关重要，而从初始混合种群中计数特定菌株的能力已被证明是评估细菌适应性与毒力特征的宝贵工具。然而，实现这一目标的技术发展速度并未跟上分子生物学领域的现代进展。对包括伤寒沙门菌（S. Typhimurium）在内的多种细菌染色体进行简便修饰的技术已有近二十年的历史14，但该技术极少被用于通过独特的DNA序列对菌株进行分子标记。通过利用在细菌染色体上插入独特且干扰极小的DNA条形码，从而构建出易于识别的菌株，并结合最先进的分子标识物检测与定量技术（即数字PCR），我们建立了一套系统，可在复杂的细菌种群中对单个菌株进行高灵敏度、高特异性、高准确性和高精确度的简便定量。
如上所述，计算竞争指数（CI）和竞争输出指数（COI）依赖于能够准确地对细菌染色体进行相应的修饰。所有修饰均应通过Sanger测序进行验证，以确保未发生随机突变。使用高保真聚合酶可将此类错误降至最低，但任何发生的突变都会影响对该菌株的检测能力，这是本实验方案的另一个关键方面。尽管我们已证明数字PCR能够在近200万的背景中检...

评估病原体的适应性与毒力是微生物学研究的基本方面。它能够对不同菌株或突变体之间进行比较，使研究人员得以确定特定条件下某些基因的重要性。传统上，毒力评估采用动物感染模型，通过使用不同细菌菌株并观察感染动物的结果（例如感染剂量50, 致死剂量50死亡时间、症状严重程度、无症状 等等）。该方法可提供有关毒力的宝贵信息，但需要待测菌株在感染结果上与野生型产生显著差异，才能检测出其变异。此外，该方法的结果为半定量性质，因为尽管疾病进展和症状严重程度可随时间进行主观量化，但与野生型相比的毒力评估仍以定性为主（即毒力更强、更弱或相当）。进行动物感染实验的一种常见替代方法是构建竞争指数（competitive indices, CIs），该数值通过混合感染直接比较待测菌株与其野生型对应菌株的适应性或毒力。1该技术通过将毒力标准化至野生型菌株并确定可量化的减毒程度指标，在诸多方面优于传统的动物感染模型。此外，该技术还可通过测定抵消竞争指数（COI）来分析细菌中的基因相互作用。2计算一组突变生物体的协同感染指数（COI），可帮助研究人员判断两个基因是独立地参与致病过程，还是共同参与同一条毒力通路并相互依赖。此外，竞争指数（CI）的计算需要对细菌进行计数，这能够为微生物的致病机制提供有价值的见解。CI 和 COI 还使研究人员能够评估那些不引起临床疾病的无毒力菌株，尽管其不致病，但仍可能存在适合度上的差异。该技术受限于传统抗生素抗性标记的使用，从而将可同时分析的输入菌株数量限制为仅一至两个。由于这一限制，实验需设置大量分组和重复，这不仅增加了人力和材料成本，也加大了实验条件变异和结果不准确的风险。（有关利用混合感染研究毒力、适合度及基因互作的优势与应用的全面综述，参见 C.R. Beuzón 和 D.W. Holden） 1)
人们已尝试通过多种方法克服这一局限性，例如使用流式细胞术定量荧光标记的细胞3,4,5。该技术通过以下两种方式之一对细胞进行定量：1）针对表型标志物的标记抗体，或 2）内源性表达的荧光蛋白。使用标记抗体的检测下限为 1,000 个细胞/mL，因此需要大量细胞才能进行分析3。表达荧光蛋白的细胞其生理状态会发生改变，并且由于高水平蛋白表达而容易引起适应性变化6。这两种方法均受限于流式细胞术可检测的荧光标记数量。在分子定量方面的一项进展是开发出一种微阵列技术，在小鼠模型中，该技术能够从最初混合感染的 1,000 多个菌株中检测出 120 个菌株的毒力减弱情况7。该技术通过对突变菌株的 RNA 进行微阵列分析，但由此导致结果存在较大变异性。&#160; 尽管如此，该研究证实了混合感染的大规模菌株库是一种有效的工具，并且通过使用高灵敏度的检测技术，可以识别细菌毒力的差异。随着下一代测序技术的发展，Tn-seq 扩展了转座子突变的应用，成为一种强大的方法，可用于定量随机突变的细菌8,9,10,11。最近开发出一种替代性方案，无需使用转座子，而是利用 DNA 条形码更简便地识别和追踪基因组变化及其对适应性的影响12。该技术是一项重大进步，但基因组条形码的插入仍是一个随机过程。为了克服以往实验的随机性，Yoon 等人开发了一种方法，通过将独特的 DNA 条形码插入沙门菌（Salmonella）菌株染色体上的特定位点，来计算其竞争指数（CI）13。该方法采用基于 SYBR Green 和针对每种独特条形码的特异性引物的 qPCR 技术来检测带有独特条形码的菌株。然而，该技术受限于 qPCR 本身的技术限制，包括引物扩增效率的差异以及灵敏度较低，这一点从 qPCR 前需进行巢式 PCR 即可证明。尽管如此，该方法表明，可通过靶向基因组修饰来检测甚至可能定量多种细菌菌株的混合群体。
在以下实验方案中，我们描述了一种新颖的方法，用于开展包含大量混合接种物的细菌竞争实验，并通过高灵敏度的数字PCR技术进行精确量化。该方案涉及利用插入染色体无害区域的独特DNA条形码对细菌菌株进行遗传标记。这种改造使得菌株能够借助现代分子技术实现快速而准确的定量，而无需依赖表型标记（如抗生素抗性）的传统方法，例如连续稀释、影印平板及菌落形成单位计数。该改造允许在单个混合接种物中同时评估多个菌株，显著降低了实验变异性，因为所有菌株均暴露于完全相同的实验条件下。此外，尽管本技术最初在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）血清型中开发，但其高度适用于任何可进行遗传操作的生物体，以及几乎所有需要精确细菌计数的实验设计，为微生物学实验室提供了一种新工具，可在摆脱先前方法限制的同时提高检测准确性和通量。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22600028</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>16 mL 培养管</td><td>MidSci</td><td>8599</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>5–200 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>RAININ</td><td>30389241</td><td>更换其他品牌吸头时需谨慎，应基于制造质量进行评估</td></tr><tr><td>5–50 &amp;mu;L 多通道移液器</td><td>RAININ</td><td>17013804</td><td>使用其他多通道移液器时需谨慎</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>BLAST 分析</td><td>NCBI</td><td>N/A</td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>C1000 Touch 梯度PCR仪配备96孔深孔反应模块</td><td>Bio Rad</td><td>1851197</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>化学感受态 DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td>可从任意制造商处采购，或自行制备</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>Cytation5 微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td>CYT5MF</td><td>可从任意制造商处采购，使用任何能够准确量化DNA的系统</td></tr><tr><td>数据分析软件（QuantaSoft 和 QuantaSoft 数据分析 Pro）</td><td>Bio Rad</td><td>N/A</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>ddPCR 96孔板</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>ddPCR 微滴生成仪用油</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>探针法 ddPCR 超混合液（不含 dUTP）</td><td>Bio Rad</td><td>1863024</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>QX200/QX100 微滴生成仪用 DG8 羧基胶条</td><td>Bio Rad</td><td>1864008</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>QX200/QX100 微滴生成仪用 DG8 垫圈</td><td>Bio Rad</td><td>1863009</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>探针法微滴生成油</td><td>Bio Rad</td><td>1863005</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>可从任意制造商处采购，或自行配制（成分包括琼脂、胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl）</td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>可从任意制造商处采购，或自行配制（成分包括胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl）</td></tr><tr><td>PCR 板热封膜，铝箔，可穿刺型</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>pPCR Script Cam SK&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Stratagene/Agilent</td><td>211192</td><td>已不再商业化供应</td></tr><tr><td>引物/探针设计工具</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>pSKAP 和 pSKAP_Barcodes</td><td>Addgene</td><td>质粒编号 122702–122726</td><td>www.addgene.org</td></tr><tr><td>PX1 PCR 板封膜仪</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>QX200 微滴生成仪</td><td>Bio Rad</td><td>1864002</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>QX200 微滴读取仪</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella typhimurium&lt;/em&gt; 菌株 ATCC 14028s</td><td>ATCC</td><td>ATCC 14028s</td><td>www.atcc.org</td></tr><tr><td>Take3 微体积检测板</td><td>BioTek</td><td>TAKE3</td><td>可从任意制造商处采购，使用任何能够准确量化DNA的系统</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERFD0054</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest DpnI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERFD1704</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest HindIII</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERFD0504</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>Thermo Scientific GeneJet 凝胶回收与DNA纯化微量试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERK0832</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>Thermo Scientific GeneJet 质粒小提试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERK0503</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Phusion 高保真DNA聚合酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F534L</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>Thermo Scientific T4 DNA 连接酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FEREL0011</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio Rad</td><td>1861096</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr><tr><td>UVP Visi-Blue 凝胶成像系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>UV95043301</td><td>或其他可用于DNA可视化观察的透射仪</td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP28191</td><td>可从任意制造商处采购</td></tr></tbody></table>

基于数字pcr的竞争指数用于高通量分析细菌适应性 沙门菌

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

竞争指数是一种用于评估细菌适应性及/或毒力的常用方法。该方法的优势在于操作简便，并能够将多种菌株的适应性标准化至野生型生物体。然而，该技术受限于可用的表型标记以及可同时检测的菌株数量，因而需要进行大量重复实验。伴随实验数量的增加，基于表型标记对细菌进行定量所耗费的人力与材料成本也不容忽视。为了在保留该方法优点的同时克服上述缺点，我们开发了一种基于分子生物学的方法，通过在细菌染色体上构建遗传标记，实现对微生物的直接定量。独特的25个碱基对DNA条形码被插入到野生型和突变型沙门氏菌（Salmonella）染色体的非必需位点。体外竞争实验采用混合菌株组成的接种物进行。竞争结束后，利用数字PCR对每种菌株的绝对数量进行定量，并据此计算各菌株的竞争指数。我们的数据表明，该方法在定量沙门氏菌（Salmonella）时具有极高的灵敏度、准确性和精确性，能够有效检测高丰度（高适应性）和稀有（低适应性）的微生物。此外，该技术可轻松适用于几乎所有染色体可被修饰的生物体，以及需要对微生物进行绝对定量的多种实验设计。

使用该方法需要进行适当的对照反应，以验证用于识别目标 DNA 的每种探针的灵敏度和特异性。在此代表性实验中，我们使用八种相应的探针对八种独特的 DNA 条形码进行了验证。所有八种探针在非模板对照（NTC）和阴性对照反应中均表现出较低的假阳性率（表 3），表明即使在高度相似的 DNA 序列中也具有良好的特异性。为了评估每种条件的灵敏度，将含有独特条形码的基因组 DNA（gDNA）在含有其余七种条形码序列之一的恒定背景 gDNA 中进行连续稀释。采用上述方法，数字 PCR 能够在近 2,000,000 条相似 DNA 序列的背景下，准确区分低至 2 个拷贝的 gDNA（表 3）。
除了确定每种探针和DNA条形码序列的灵敏度与特异性外，验证研究中进行的系列稀释还允许我们根据所得数据计算模拟的竞争指数。尽管本实验并无真实意义上的输入或输出，但可将数据视为竞争实验的结果进行分析。为此，我们将每个...

这种基于分子的方法通过量化独特的基因组DNA条形码，可精确且准确地检测微生物，从而评估细菌的适应性。该方案描述了计算沙门氏菌（Salmonella）菌株竞争指数的方法；然而，该技术可轻松适用于需要对任何遗传上可改造的生物体进行绝对定量的各种实验方案。

基于数字PCR的竞争指数用于高通量分析细菌适应性 沙门菌

竞争指数是一种常用于评估细菌适应性及/或毒力的方法。该方法的优势体现在操作简便，且能够将多种菌株的适应性标准化为与野生型菌株的比较。然而，该技术受限于可用的表型标记以及可同时检测的菌株数量，因而需要大量重复实验。伴随实验数量的增加，基于表型标记对细菌进行定量所耗费的人力与材料成本也不容忽视。为克服这些局限性，同时保留该方法的优势，我们开发了一种基于分子生物学的方法，通过在细菌染色体上引入工程化遗传标记，直接对微生物进行定量。我们将独特的25个碱基对长的DNA条形码插入沙门菌野生型及突变株染色体的无害位点。使用混合菌株组成的接种物进行体外竞争实验。竞争结束后，利用数字PCR定量各菌株的绝对数量，并据此计算每种菌株的竞争指数。我们的数据表明，该沙门菌定量方法在检测高丰度（高适应性）和低丰度（低适应性）微生物方面均具有极高的灵敏度、准确性和精确性。此外，该技术可轻松适用于几乎所有染色体可被修饰的生物体，以及需要对微生物进行绝对定量的多种实验设计。

该技术能够利用快速、高通量的分子学方法，对高度相似菌株混合群体中的微生物进行准确且精确的定量。最终实现菌株间适应性差异的比较。通过在单个混合菌群中同时评估大量菌株，可显著降低孔间或个体间变异，因为所有菌株均处于完全相同的实验条件下。该技术的适应性使其几乎可用于任何可进行遗传操作的生物体，以及任何需要准确量化微生物的实验设计。按照文本方案中所述，首先在细菌染色体上构建遗传标记。构建一个包含除一个以外所有条形码的基因组DNA混合物。使用该混合液作为稀释液，对含有单个剩余条形码的基因组DNA进行系列稀释。根据制造商关于使用适用于探针法化学反应的数字PCR超级混合液的建议，设置数字PCR反应，并进行复孔。以混合的基因组DNA作为模板DNA。此外，按照文本方案中的说明添加20倍引物探针预混液。根据制造商的建议，为数字PCR准备复孔对照反应。每种探针混合液的对照反应必须包括无模板对照、阴性对照和阳性对照。重复这些步骤，为每个带有条形码的基因组 DNA 样本制备数字 PCR 反应。根据制造商的说明，使用微滴生成仪为每种反应条件生成微滴。将新生成的微滴转移至相应的 96 孔板中。在5至50微升多通道移液器上使用200微升移液器吸头。在所有液滴生成并转移后，用铝箔板封膜密封板。使用制造商推荐的热循环仪执行扩增程序。在进行热循环的同时，使用数据分析软件输入板式设置信息，例如样本名称、实验类型和所用的Supermix。还需输入目标1名称和目标1类型，以及目标2名称和目标2类型。热循环完成后，根据制造商的说明，将完成的反应产物转移至液滴读取仪并启动读取过程。当所有孔均已读取且运行完成后，使用数据分析软件打开QLP数据文件。选择使用相同引物探针预混液的所有孔。在“液滴”选项卡中，检查每个孔中分析的液滴数量，包括阳性和阴性液滴。排除总液滴数少于 10,000 的任何孔进行分析。切换到一维振幅选项卡，检查阳性与阴性液滴的振幅，确保其形成两个明显不同的群体。在软件中，使用阈值功能为所用的每种探针设定阳性与阴性液滴的区分阈值。当所有孔均已应用适当的阈值后，软件将计算每个反应中的DNA拷贝数。将数据导出至电子表格，以便进行后续分析。根据这些值，计算样品中每种独特基因组条形码的初始拷贝数。从阴性对照反应中确定平均假阳性率，并从实验反应获得的值中减去该值。根据每个实验设置时进行的稀释倍数，对数值进行相应的乘法计算。现在，通过基于数字PCR对条形码菌株进行定量，计算竞争指数或校正后的竞争指数，以确定生物体的相对适应性。对所有时间点的每种条形码菌株均执行此步骤。将含有AA条形码的基因组DNA稀释于其他所有条形码基因组DNA的背景中。通道 1 代表针对 AA 条形码的 FAM 探针，而通道 2 代表针对 AO 条形码的 HEX 探针。每个探针的结果均以单个液滴的荧光强度以及直方图形式展示，该直方图表示所选孔中所有液滴荧光强度的频率分布。对于每种条件，阳性液滴与阴性液滴应形成两个明显不同的群体。应使用阈值功能对群落进行区分，以定义阳性和阴性液滴。阈值会因所用探针的不同而有所差异，但使用相同探针混合物的所有孔都应设置相同的阈值。对于稀释后的AA样本，由于阳性液滴数量远少于阴性液滴，直方图中仅显示出单一的群落峰。然而，通过观察左侧面板中液滴荧光强度，仍可分辨出两个不同的群体。随着AA条形码基因组DNA的稀释，阳性液滴数量减少，而AO阳性液滴的数量保持不变。在对所有孔位设定适当的阈值后，软件将计算出每个反应中DNA拷贝的数量。如果您的研究中常规进行 PCR，可采用此技术评估模式生物的适应性。该方法通常用于确定上游实验的最终结果。其真正优势在于提高依赖细菌定量的各类实验的便捷性和通用性。我们正在利用该技术评估沙门氏菌在小鼠感染模型中的适应性。此外，本实验室也正在将该技术改造用于其他病原微生物的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

基于数字PCR的沙门氏菌健康高通量分析竞争指数

我们描述了一种多重PCR方法，用于快速检测肠道沙门菌（Salmonella...

一种用于鉴定的等位基因分型PCR 鼠伤寒沙门氏菌 血清型肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌

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绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

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双重数字PCR同时定量双基因标志物

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一种用于同时定量水中粪肠球菌属（Enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法

Salmonella spp./Shigella spp. 是导致腹泻的常见病原体。本文介绍一种高通量平台，用于通过实时 PCR 结合导向培养法对 Salmonella spp./Shigella spp.

一种用于高通量筛选的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 种（spp.）

本文介绍一种通过准宏基因组测序联合检测和分型沙门氏菌的实验方案，用于制备食品和环境微生物组的DNA样本。结合使用培养增菌、免疫磁分离（IMS）和多重置换扩增（MDA）技术，可有效富集 沙门氏菌...

准宏基因组分析法检测食品与环境样本中的Salmonella

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发现CsgD调控靶点 沙门氏菌 使用染色质免疫沉淀和高通量测序（ChIP-seq）研究生物膜

Salmonella 可侵入并在肠上皮细胞内增殖，其增殖位置既包括 Salmonella 特异性液泡，也包括细胞质中（超增殖）。本文介绍了一种基于高通量荧光显微镜的实验方案，通过 ImageJ 进行两种互补的图像分析，可在单细胞分辨率下定量分析 Salmonella...

细胞内表型的自动化分析 沙门氏菌 使用 ImageJ

本文介绍了智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的原理、结构及操作方法。以中国山东地区家禽分离的沙门氏菌（Salmonella）为例，说明该系统的应用。计算了Lar指数，并全面讨论了其在评估抗菌药物耐药性中的意义。...

智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的应用及抗菌耐药性幼虫指数

本方案描述了如何通过每日传代和定期冷冻保存来维持大肠杆菌（Escherichia...

每日转移、群体保藏与长期进化实验中的适合度测定 大肠杆菌

在低水平下准确量化家禽中的沙门氏菌是当前工业界和监管领域面临的一项挑战。本方案描述了一种MPN检测方法，可用于定量生制及即食家禽产品中的沙门氏菌。该方法快速、灵敏，且符合食品安全检验局（FSIS）的指南要求，有助于提升食品安全并支持公共卫生工作。...

改良的最可能数法检测生鸡和即食鸡产品中的沙门氏菌

了解基于数字PCR的高通量分子技术，用于精确量化混合菌群中高度相似菌株的微生物。该方法通过基因组DNA条形码实现沙门氏菌竞争指数的准确测定，适用于多种可遗传操作生物的适应性比较研究。

基于数字PCR的竞争指数用于高通量分析细菌适应性沙门菌

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