基于数字PCR的沙门氏菌健康高通量分析竞争指数

该技术使用快速和高通量分子基技术，能够准确准确地定量地定量来自高度相似菌株的混合种群的微生物。归根结底，在能够比较菌株之间的健身。同时评估单个池中多个菌株的能力可显著减少井对井或有机体对有机体的变异性，因为所有菌株都暴露在完全相同的条件下。

该技术的适应性使得它几乎可用于任何基因可塑性生物体和几乎任何需要精确定量微生物的实验设计。如文本协议所述，从对细菌染色体进行遗传标记的工程开始。创建包含除一个条形码以外的所有条形码的基因组 DNA 池。

使用此池作为稀释剂，使用含有单个剩余条形码的基因组 DNA 执行稀释序列。根据制造商关于使用专为探头化学设计的数字 PCR 超级混合的建议，为数字 PCR 重复准备反应。使用池基因组DNA作为模板DNA。

此外，添加 20 X 底像探头主混合，如文本协议中所述。根据制造商的建议为数字 PCR 准备复制控制反应。每个探针组合的控制反应必须包含无模板控件、负控件和正控制。

重复这些步骤，为每个条形码基因组DNA样本创建数字PCR反应。根据制造商的说明，使用液滴发生器针对每种反应条件生成液滴。将新创建的液滴转移到适当的 96 井板中。

在 5 至 50 微升多通道移液器上使用 200 微升移液器提示。生成并转移所有液滴后，使用铝箔板密封器密封板。使用制造商推荐的热循环器执行循环条件。

在进行热循环时，使用板设置信息（如样品名称、实验类型和使用的 Supermix）对数据分析软件进行编程。还包括目标 1 名称和目标 1 类型，以及目标 2 名称和目标 2 类型。热循环完成后，根据制造商的说明，将完成的反应转移到液滴读卡器，并开始读取过程。

读取所有孔并完成运行后，使用数据分析软件打开 QLP 数据文件。选择使用相同底像探头母版混合的所有孔。在"液滴"选项卡上，检查每个井中分析的液滴数量，包括正液滴和负液滴。

从分析中排除任何总液滴少于 10，000 的井。移动到 1D 振幅选项卡并检查正和负液滴的振幅。确保它们由两个不同的群体组成。

在软件中，使用阈值功能为使用的每个探头进行正极和负液滴之间的截止。一旦将适当的阈值应用于所有油井，软件将计算每次反应中的DNA拷贝数。将数据导出到电子表格，以便于进一步分析。

使用这些值，计算样本中每个唯一基因组条形码的初始拷贝数。从负控制反应中确定平均误报率，并从实验反应中获得的值中减去此值。根据设置每个实验时执行的稀释值，必要时将值相乘。

现在，通过计算竞争指数或取消基于数字PCR的条形码应变定量中的竞争指数来确定生物体的相对健康。在所有时间点对每个条形码应变执行此步骤。含有 AA 条形码的基因组 DNA 在所有其他条形码基因组 DNA 的背景中稀释。

通道 1 表示 AA 条形码的 FAM 探头，而通道 2 表示 AO 条形码的 HEX 探头。每个探针的结果均作为单个液滴荧光振幅和表示选定孔中所有液滴荧光强度频率的直方图。对于每种情况，正液和负液滴应形成2个不同的种群。

应使用阈值特征分隔种群，以定义正液滴和负液滴。阈值会因使用的探测器而异，但使用相同探头组合的所有孔应具有相同的阈值。在被稀释的 AA 中，直方图似乎只描绘了单个总体，因为正液滴的数量大大超过负液滴。

然而，通过检查左侧面板中的液滴荧光振幅，仍然可以看到 2 个不同的群体。随着 AA 条形码基因组 DNA 被稀释，阳性液滴减少，而阳性 AO 液滴的数量保持不变。一旦将适当的阈值应用于所有油井，软件将计算每次反应中的DNA拷贝数。

如果您常规执行 PCR 作为研究的一部分，您可以执行此技术来评估模型生物体的适合性。此过程通常用于确定上游实验的最终结果。它的真正用途是促进任何依赖于细菌定量的实验的易用性和多功能性。

我们使用这种技术来评估沙门氏菌在感染的莫林模型中的体能。此外，这项技术正在被调整，用于我们的实验室中的其他致病微生物。