使用标准实验室设备从小鼠测试中浓缩帕西滕苯细胞和精子

简单和廉价的方法，我们称之为MDR允许您从小鼠睾丸分离富集的帕奇滕精子细胞，圆形精子和拉长精子。MDR 方法的主要优点是简单。您只需要大多数生物医学研究实验室提供的标准实验室设备。

MDR协议非常适合对男性生殖细胞进行功能研究的研究人员。例如，正在研究精子生成、影响男性生育力的因素以及父系表观遗传遗传的群体。MDR 方法需要最少的起始材料。

事实上，我们通常只使用一只成年雄性小鼠获得大量的细胞。首先设置必要的设备和试剂。将水浴设置为 37 摄氏度，将细胞培养孵化器设置为 34 摄氏度、5%的二氧化碳和 95% 的湿度。

将管旋转器放在培养箱内。准备并标记适当数量的显微镜玻璃滑梯，然后用润滑脂笔绘制直径约一厘米的环，让润滑脂干燥。当准备解剖动物时，用70%乙醇喷洒小鼠的腹腔，并使用剪刀在腹部骨盆腔中形成V形开口。

用钳子拉上表皮脂肪垫，找到睾丸，用剪刀取出它们，确保避免干扰图尼卡阿尔布吉纳。将睾丸放在含有 1X KREBS 的 6 厘米培养皿上。斩首睾丸，丢弃图尼卡阿尔布吉纳，然后轻轻用钳子戏弄它们，稍微分散半尼的管。

将它们转移到一个50毫升的圆锥管中，含有两毫升新鲜准备的胶原酶溶液。在37摄氏度的水浴中孵育浴缸3分钟，通过摇动轻轻搅拌。然后加入至少40毫升的暖1X KREBS，让管在室温下沉淀。

取出上一液，再重复洗涤。加入25毫升新鲜准备的尝试性西普辛溶液。将管子放在细胞培养箱内的旋转器上，并在那里放置 15 到 20 分钟，以大约 15 rpm 转速旋转。

偶尔检查浴缸。一旦溶液变得多云，只剩下小块的浴缸，将管子放在冰上，然后进入下一步。通过 40 微米电池滤株将溶液过滤到新的 50 毫升圆锥形冰管中。

然后在600xg下离心5分钟，在4摄氏度下对细胞进行分粒。小心地倒出上一提液，然后敲击细胞颗粒，在 1X KREBS 的剩余部分重新浇注细胞。将至少 40 毫升冷 1X KREBS 添加到重新增殖的细胞中，然后重复离心。

通过敲击管子重新暂停细胞。然后将移液器尖端安装到一毫升移液器上，然后切割它，使孔径直径约为 3 毫米。在 KREBS 中，最多加三毫升 0.5%BSA。

通过上下移液来重新暂停细胞，确保避免气泡。通过 40 微米滤株过滤细胞悬浮液，然后立即在 BSA 梯度上加载电池。在将细胞加载到梯度上之前，您必须获得均匀的单细胞悬浮液。

块块细胞会更快地沉淀，破坏你的梯度和污染的分数。在冰上垂直设置一个50毫升的管子，确保可以看到管子的一侧。然后从十毫升血清移液器的尖端切割约五到十毫米，并安装在移液器控制器上。

将 5%BSA 溶液的五毫升移液到 50 毫升管的底部。轻轻触摸 5% 溶液的表面，使用移液器的切尖，并在 5% 溶液顶部缓慢地将 5 毫升 4% BSA 溶液分层。与其他 BSA 解决方案重复此过程，以获得 5% 到 1% BSA 的梯度。

图层之间应显示一条清晰的线。然后小心地将单细胞悬浮在梯度顶部，而不会干扰它。让细胞沉淀通过梯度一个半小时。

使用切制移液器尖端，小心地将一毫升分数收集到单独的 1.5 毫升管中，并将其储存在冰上，确保按收集顺序对管进行编号。将细菌细胞分数在600xg下离心，在4摄氏度下10分钟。然后注意不要打扰颗粒，丢弃大部分上最后一种物，然后通过轻拂管子重新暂停细胞。

在每个管中加入一毫升冰冷 1X KREBS 缓冲液，然后重复离心。丢弃大部分上一液，留下约100微升，并仔细重新暂停细胞颗粒。要分析细胞分数，请从将 20 微升的 4% 对非成醛移液到编号显微镜幻灯片上每个润滑脂笔圈内。

立即从相应分数中添加两个重新释放的细胞的微升。然后在室温下干燥滑梯至少一小时。使用 PBS 冲洗幻灯片一次，并使用 DAPI 安装介质安装幻灯片。

在荧光显微镜下分析每张幻灯片，以估计每个分数中富集了哪种生殖细胞类型。从每个分数中提取一个样品进行显微镜检查后，将一毫升的冰冷 1X KREBS 添加到每个分数中，并在 4 摄氏度下以 600 至 13000 x g 的 600 至 13000 x g 将细胞离心，10 分钟。取出并丢弃上流液，然后继续首选的下游分析。

该协议特别适用于丰富圆形精子。在第二、三、四部分，90%以上的富集。伸长精子往往停留在梯度的顶部，并收集与第一部分。

由于其体积大，帕奇特内精子细胞沉淀物更快，最后被收集。富集在分数14和15中约为75%。从大多数分数获得的总RNA范围从0.5微克到2.5微克，足以进行下游RNA分析。

从每个分数获得的蛋白质量通常为20至140微克，这足以满足几个西方的印迹。在该协议中，从单馏分中提取的10%的蛋白质酸盐足以在标准西方印迹上清楚地检测DDX4、PIWIL1和PIWIL2蛋白质。一个分数中的蛋白质量也足以利用针对PIWIL1的抗体进行免疫沉淀，并用于检测共性免疫沉淀的PIWIL2。

即使对于第一个计时器，只要您确保细胞的预处理良好，并且没有什么能干扰沉淀期间的梯度，此协议也运行良好。从单个小鼠获得高度丰富的细胞，可用于不同的下游分析，如RT-PCR，RNA测序，免疫沉淀和西方印迹。虽然MDR不是丰富雄性生殖细胞的唯一方法，但它是一个非常方便的工具，因为它不需要任何专门的设备或广泛的培训。