利用常规实验室设备从小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞和精子细胞

我们称之为MDR的这一简单且经济的方法，可从小鼠睾丸中分离出富集的粗线期精母细胞、圆形精子细胞以及伸长中的精子细胞群体。MDR方法的主要优势在于其简便性。您仅需使用大多数生物医学研究实验室中常见的标准实验设备即可。

MDR 方法非常适合进行男性生殖细胞功能研究的研究人员，例如研究精子发生、影响男性生育力的因素以及父系表观遗传传递的科研团队。MDR 方法所需的起始材料极少。

事实上，仅使用一只成年雄性小鼠我们便能常规获得足量的细胞。首先准备所需的仪器和试剂，将水浴锅预热至37摄氏度，将细胞培养箱设置为34摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度。

将试管旋转仪放入培养箱内。准备并标记适量的显微镜玻片，然后用记号笔在玻片上画一个直径约一厘米的圆圈，并让记号笔液干燥。准备解剖动物时，用70%乙醇喷洒小鼠的腹侧腹部，并用剪刀在腹盆腔处剪出V形切口。

用镊子轻轻拉住附睾脂肪垫，找到睾丸，并用剪刀将其剪下，注意避免损伤白膜。将睾丸置于含有1X KREBS溶液的6厘米培养皿中。剥除睾丸的白膜并弃去，然后用镊子轻轻分离，使生精小管略微散开。

将它们转移至含有2毫升新配制的胶原酶溶液的50毫升锥形管中。在37摄氏度水浴中孵育管状结构3分钟，通过轻轻摇动进行温和振荡。然后加入至少40毫升预热的1×KREBS溶液，于室温下使管状结构自然沉降。

弃去上清液，再重复洗涤一次。加入25毫升 freshly prepared trypsin solution。将试管置于细胞培养孵育箱内的旋转仪上，以约15 rpm的速度旋转，孵育15至20分钟。

偶尔检查小管。当溶液变浑浊且仅剩少量小管碎片时，将试管置于冰上，并进行下一步操作。将溶液通过40 µm细胞滤网过滤至预冷的50 mL锥形管中，置于冰上。

然后在4°C条件下以600 × g离心5分钟，使细胞沉淀。小心倒出上清液，并轻敲细胞沉淀，用剩余的1× KREBS缓冲液重悬细胞。向重悬的细胞中加入至少40毫升冷的1× KREBS缓冲液，并重复离心步骤。

轻轻敲击离心管使细胞重悬。然后将枪头装在1 mL移液器上，并将其末端剪去，使孔径直径约为3 mm。加入最多3 mL含0.5% BSA的KREBS溶液。

用移液器反复吹打使细胞重悬，注意避免产生气泡。将细胞悬液通过40微米滤网过滤，立即进行BSA梯度液加样。在将细胞加样至梯度液之前，必须获得均一的单细胞悬液。

成团的细胞会更快地沉降，从而破坏梯度并污染各组分。将一个50毫升离心管垂直置于冰上，确保能够观察到管子的一侧。然后从一支10毫升移液管的尖端切去约5到10毫米，并将其安装在移液控制器上。

用移液器将5毫升5% BSA溶液加入50毫升离心管底部。用移液器的切口尖端轻轻接触5%溶液的液面，缓慢地将5毫升4% BSA溶液铺加在5%溶液上方。对其他浓度的BSA溶液重复此操作，以获得从5%至1%的BSA梯度。

各层之间应可见一条清晰的分界线。然后小心地将单细胞悬液加在梯度液上方，避免扰动。让细胞在梯度液中沉降一个半小时。

使用剪去尖端的移液枪头，小心地将每1毫升组分分别收集到1.5毫升离心管中，并置于冰上保存，确保按收集顺序对离心管进行编号。在4°C条件下，以600 × g离心10分钟，对生殖细胞组分进行离心。随后小心操作，避免扰动沉淀，弃去大部分上清液，并通过轻弹管壁重悬细胞。

向每支试管中加入1毫升冰冻的1×KREBS缓冲液，并重复离心。弃去大部分上清液，保留约100微升，然后小心重悬细胞沉淀。为分析细胞组分，首先用移液器将20微升4%多聚甲醛加入编号载玻片上每个润滑笔画出的圆圈内。

立即加入对应组分中重悬细胞的两微升。然后在室温下干燥载玻片至少一小时。用 PBS 冲洗载玻片一次，并使用含 DAPI 的封片剂封片。

在荧光显微镜下分析每张载玻片，以评估各组分中富集的特定生殖细胞类型。在为显微镜检查取样后，向每份组分中加入一毫升预冷的1×KREBS缓冲液，并在4°C条件下以600至13000 × g离心10分钟。弃去上清液并丢弃，随后进行后续偏好的分析步骤。

该方案特别适用于富集圆形精子细胞，在第二、第三和第四组分中富集度均超过90%。伸长阶段的精子细胞倾向于停留在梯度上层，并随第一组分被收集。

由于体积较大，粗线期精母细胞沉降速度更快，因此最后被收集。第14和第15组分的富集度约为75%。从大多数组分中获得的总RNA量介于0.5至2.5 µg之间，足以进行后续的RNA分析。

每个组分中获得的蛋白质量通常在 20 至 140 微克之间，足以进行多次 Western 印迹分析。在本方案中，单个组分来源的蛋白裂解物取 10% 即可在标准 Western 印迹中清晰检测到 DDX4、PIWIL1 和 PIWIL2 蛋白。单个组分中的蛋白质量也足以使用抗 PIWIL1 抗体进行免疫共沉淀，并可用于检测共免疫沉淀的 PIWIL2。

即使是初次操作，只要确保细胞预处理得当，并且在沉降过程中不干扰梯度，该方案也能取得非常好的效果。从一只小鼠可获得高度富集的细胞，可用于多种下游分析，如RT-PCR、RNA测序、免疫沉淀和蛋白质印迹。虽然MDR并非富集雄性生殖细胞的唯一方法，但它是一种非常便捷的工具，因其无需任何专用设备或 extensive training。