步特定老鼠的精子细胞分选流式细胞仪

该程序的总体目标是将小鼠精子细胞分为四个不同的种群，以便进行精子发生的分子研究。这种方法可以帮助回答镜像复制领域的关键问题，例如色度建模对基因组完整性有什么影响。该技术的主要优点是它可以将精子分离成纯细胞群，而不会产生交叉污染。

当我们在细胞分选前一天观察到染色质重塑过程中单倍体参数的 DN 染色强度的重要变化时，我们第一次想到了这种方法。将 1 至 2 毫升热灭活的 FBS 添加到 5 毫升聚丙烯圆底管以及 15 毫升和 50 毫升聚丙烯锥形管中。接下来，第二天在 4 摄氏度的旋转器上通过过夜倒置缓慢涂覆管子。

使用 P 200 移液器小心倒出 FBS，以去除 15 和 50 毫升试管中的任何残留 FBS，并在 5 毫升试管中留下少量残留的 100 至 200 微升 FBS，用于在细胞当天收集纯化的细胞。分拣，将封装的试件在 500 μL 分拣缓冲液中切碎。然后使用截短的微量移液器吸头将组织碎片转移到 1.5 毫升的试管中。

通过轻柔的上下移液冲洗生细精小管中的生殖细胞，然后用完整的吸头冲洗。接下来，使用 40 微米细胞过滤器去除碎屑和团块，将滤液收集在 FBS 涂层的 50 毫升锥形管中。用分选缓冲液清洗过滤器一次，总体积不超过 3 mL，然后将滤液转移到 FBS 涂层的 15 mL 锥形管中。

然后向细胞中加入每毫升细胞悬液 16 微升 EDTA，并使用 10 毫升移液器在一分钟内用三体积的冰冷的 100% 乙醇缓慢固定细胞，同时低速涡旋，固定后悬浮液会变成乳白色。将细胞在冰上孵育 15 分钟，偶尔倒置。然后离心细胞悬液，将托盘重悬于 2 mL 分选缓冲液中，并在分选前立即用 4 μL cyto 16 DNAD 对生殖细胞进行染色。

通过 50 微米过滤器将细胞过滤到 FBS 涂层的传真管中，并用 1 至 2 毫升分选缓冲液充分洗涤过滤器。将固定的生殖细胞加载到配备 488 纳米激光的细胞分选仪上。接下来，用直方图显示事件总数，直方图表示针对 Alexa floor 4 88 区域的事件数，并对阳性 DNA 染色细胞进行门控。

然后，在侧向散射区域中显示来自该门的单元格，以对照前向散射区图和门。如图所示，这些细胞在 Alexa floor 4 88 区域、绘图和门的前向散射区域中显示这些门控细胞。然后，单元格再次将这些门显示到单独的 Alexa floor 4 88 宽度与 Alexa floor 4 88 面积图的对比中。

精子发生步骤 1 到 9 和 10 到 12。然后可以对精子细胞进行门控排序，以收集步骤 13 至 14 和 15 至 16。精子细胞根据 EXOR 4 88 面积图和门将来自第一个门的细胞显示到前向散射区域。

如图所示的细胞群。然后将这些门显示到单个 Alexa 中。4 楼 88 宽度与 Alexa 4 楼 88 面积图和门。

步骤 13 到 14 和 15 到 16 精子进行分类。最后，将纯化的级分收集在 100 至 200 微升 FBS 中的单个 FBS 包被的 5 毫升圆底管中，置于冰上。在这些图像中，显示了流式分选的 smited 种群的 dappy 染色。

精子发生步骤 1 到 9 精子细胞通常显示圆形细胞核，在精子发生中呈椭圆形。第 9 步精子细胞，在第 10 步到第 12 步中观察到细长的钩。精子细胞精子发生步骤 13 至 14 和 15 至 16 精子细胞表现出形状相似的细胞核，但 DNA 染色强度略有不同，这使得这些不同的 sper 群体可以在流式细胞术分选过程中被识别出来。

按照演示的方案，单个 S 实验群体的纯度预计在 95% 到 100% 之间该技术可以在 6 到 8 小时内完成。如果正确执行每个步骤。要记住，在整个过程中始终将细胞保持在冰上，按照此程序可以获得不同的精子群，为分子分析提供足够数量的材料，例如表征戏剧性的重塑过程或研究这种转变的遗传影响。