Name: 从患者前列腺癌骨转移标本及其异种移植物中提取的三维（3D）有机物的建立与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 了解建立前列腺癌骨转移患者来源三维类器官的培养方案。该方法利用穹顶技术从有限起始材料中构建体外模型，用于研究肿瘤病理机制及药物测试，保留肿瘤异质性。

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本研究由 Leo 和 Anne Albert 慈善基金会以及 JM 基金会资助。我们感谢加州大学圣地亚哥分校摩尔斯癌症中心的 Jing Yang 博士和 Kay T. Yeung 博士允许我们使用其切片机，同时感谢外科手术科的 Randall French 提供技术指导。

本研究严格遵循加州大学圣地亚哥分校（University of California San Diego, UCSD）机构审查委员会（Institutional Review Board, IRB）指南中的建议进行。研究已获得UCSD机构审查委员会（IRB）批准（批准编号：IRB #090401），允许为科研目的收集患者的手术标本。每位患者均签署了知情同意书，并在股骨病理性骨折骨科修复过程中获取了骨转移性前列腺癌手术标本。动物实验方案依照加州大学圣地亚哥分校（UCSD）动物福利政策及机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC）批准的方案（批准编号：#S10298）执行。将通过机械法和酶解法分离的患者肿瘤组织细胞接种至6至8周龄雄性小鼠股骨内 Rag2-/-;γc-/- 小鼠，如先前所述17异种移植瘤体积采用以下方法测定：使用 体内 生物发光成像系统和游标卡尺测量。当肿瘤生长至2.0 cm（IACUC批准的最大允许尺寸）时，收获肿瘤用于建立三维类器官。
注意：图1 展示了建立三维类器官的工作流程以及实验步骤中每一步的方案编号。
1. 患者来源异种移植瘤（PDX）肿瘤组织的处理
注意：这是从小鼠异种移植模型中获得的肿瘤建立类器官的初始步骤。本方案改编自 Drost 等人先前发表的研究5，我们已对培养基条件进行了修改，向类器官培养基中添加了血清补充成分。
<ol>
	<li>按以下所述处理肿瘤标本。
	<ol>
		<li>将肿瘤样本切成 1–3 mm3 大小的组织块，并用 10 mL 细胞解离液在室温下消化 45 分钟。</li>
		<li>为终止消化，向样本中加入 20 mL DMEM 完全培养基。</li>
		<li>将悬液通过 70 μm 细胞筛过滤。使用无菌的推杆法兰将残余组织从 70 μm 细胞筛表面推下。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用新鲜的 adDMEM 完全培养基洗涤细胞沉淀三次。洗涤和重悬所用培养基的体积应与表 3中建议的体积一致。例如，对于 24 孔板培养条件，每次洗涤的体积应为 500 µL。 
		注：如表 3所示，本方案适用于不同的培养条件。</li>
		<li>使用台盼蓝染料和血细胞计数板测定最终细胞数量。</li>
		<li>获得细胞计数后，将细胞沉淀重悬于每 2 × 106 个肿瘤细胞加入 80 µL 含 2% FBS 的 PBS 中。</li>
		<li>每 2 × 106 个肿瘤细胞加入 20 µL 小鼠细胞去除混合液。充分混匀后，在 2–8 °C 条件下孵育 15 分钟。</li>
		<li>每 2 × 106 个肿瘤细胞用含 2% FBS 的 PBS 缓冲液将体积调至 500 µL。 
		注：每根 LS 柱最多可处理 2.5 mL 悬液中的 1 × 107 个肿瘤细胞。</li>
		<li>将 LS 柱安装至磁力分选装置上，并在下方放置一个 15 mL 尖底离心管以收集穿流液。</li>
		<li>用 3 mL 含 2% FBS 的 PBS 缓冲液冲洗每根柱子。弃去含有洗涤穿流液的离心管，更换为新的无菌 15 mL 尖底离心管。</li>
		<li>将细胞悬液（最多 2.5 mL，含 1 × 107 个肿瘤细胞）加至柱子上。收集穿流液，其中富含人源肿瘤细胞。</li>
		<li>用 1 mL 含 2% FBS 的 PBS 缓冲液洗涤柱子两次。 
		注：必须在柱子排空后立即进行洗涤步骤。同时，应尽量避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据所需的培养设置（表 3），将适量体积的细胞悬液分装至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 1.5 mL 离心管 5 分钟。</li>
	<li>小心移除并弃去上清液。</li>
</ol>
2. 患者原发性肿瘤组织的处理
注意：这是类器官建立的初始步骤。
<ol>
	<li>执行第1步的全部操作 除了 小鼠细胞耗竭过程，该步骤在处理患者原代肿瘤组织时并非必需。</li>
</ol>
3. 在培养板上形成附着的圆形穹顶结构
注意：本论文描述了三种制备细胞沉淀与基底膜（例如 Matrigel）混合物形成穹顶结构的方法，如图1和图2所示。在步骤2-4中，应将细胞与基底膜置于冰上，以防止基底膜提前凝固。
<ol>
	<li>将细胞沉淀重悬于适当体积的基底膜中（例如，24孔板使用40 µL）（表3）。</li>
	<li>轻柔吹打混匀，确保细胞在基底膜中充分重悬。</li>
	<li>将适量体积的细胞-基底膜混合液（表3），以及可选的10 µL完全adDMEM培养基，移入预热的组织培养板中央。</li>
	<li>将培养板倒置，并立即放入设定为5% CO2、37 °C的CO2细胞培养箱中孵育15分钟。此步骤可防止细胞沉降并黏附于培养板底部，同时使基底膜凝固。</li>
	<li>向每孔中加入含10 μM Y-27632二盐酸盐的预热培养基适量体积（表3）。</li>
	<li>将培养板正放，置于CO2细胞培养箱（5% CO2，37 °C）中继续培养。</li>
	<li>每3–4天更换一次培养基。培养5–7天后，改用不含10 μM Y-27632二盐酸盐的培养基维持培养。</li>
</ol>
4. 从培养板上附着的圆形穹顶形成漂浮穹顶
<ol>
	<li>步骤 3.7 之后，使用细胞刮刀将半球形结构分离。</li>
</ol>
5. 形成悬浮微珠
注意：该实验方案被称为“悬浮珠状物”，因为基底膜、培养基和类器官的混合物看起来像小珠子。
<ol>
	<li>剪取一块 2 英寸 × 4 英寸的石蜡膜。</li>
	<li>将石蜡膜放置在 1000 µL 塑料移液器吸头盒的空吸头架凹槽面朝上的位置。</li>
	<li>戴上手套，用食指轻轻按压石蜡膜，沿凹槽轮廓按压成型，注意不要刺破石蜡膜。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒石蜡膜，并打开细胞培养罩内的紫外灯，对制备好的石蜡膜进行至少 30 分钟的灭菌处理。</li>
	<li>制备细胞与 20 µL 基底膜基质的混合液。每滴接种密度可为 50,000 - 250,000 个细胞。</li>
	<li>用移液器将步骤 1 或步骤 2 处理后的细胞混合液以及 20 µL 基底膜基质加入石蜡膜上已形成的凹槽模具中。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于基底膜基质中，并将细胞悬液移入已制备好的石蜡膜凹槽内。</li>
	<li>将凝固后的类器官小滴连同石蜡膜一起放入 6 孔板中。每个 6 孔板孔内最多可容纳 5 个类器官小滴。</li>
	<li>向每个孔中加入 3–5 mL 预热的培养基，其中含有 10 μM Y-27632 二盐酸盐，同时轻轻晃动以使类器官小滴脱离石蜡膜。 
	注意：建议最小体积为 3 mL。当每孔类器官数量达到最大值（N=5）时，建议使用 5 mL 培养基。</li>
	<li>将培养板放入 CO2 培养箱（5% CO2，37 °C）中培养。</li>
	<li>每 3–4 天更换一次类器官培养基。培养 5–7 天后，改用不含 10 μM Y-27632 二盐酸盐的培养基维持培养。</li>
</ol>
6. 使用显微镜进行体内类器官图像拼接8
注意：某些显微镜无法到达细胞板的外周区域（边缘壁）；因此，建议在图像拼接时使用靠近细胞板边缘的孔位。
<ol>
	<li>将细胞培养板倒置放入Keyence显微镜的板架中。</li>
	<li>将镜头置于目标穹顶的中心位置。</li>
	<li>通过选择帧数设置自动拼接程序。例如，可选择3 × 3或5 × 5，以生成总共9张或25张图像。</li>
	<li>按下采集按钮以启动成像过程。</li>
	<li>打开图像查看软件，并加载步骤4拍摄的一组图像。</li>
	<li>点击图像拼接以生成高分辨率的拼接图像。 
	注意：连续采集9张或25张图像可通过手动或自动对焦设置完成。</li>
</ol>
7. 类器官组织学处理：琼脂糖离心法
注意：本方案改编自 Vlachogiannis 等人先前发表的研究7。我们增加了一个琼脂糖包埋步骤，以成功包埋所有类器官群体。
<ol>
	<li>移除孔中的原有培养基。注意不要吸走基底膜穹顶结构。</li>
	<li>加入与步骤1中移除体积相等的细胞回收溶液，并在4 °C下孵育60分钟。</li>
	<li>使用移液器松动基底膜穹顶，并用移液器吸头压碎该结构。将解离的穹顶和细胞回收溶液收集至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>移除上清液（细胞回收溶液）。将所有上清液分别保存在独立的离心管中，直至最终沉淀步骤确认类器官的存在后再行处理。</li>
	<li>加入所需体积（表3）的冷PBS，轻轻吹打混匀，以机械方式分散沉淀。</li>
	<li>在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>移除上清液（PBS）。</li>
	<li>用等体积（例如，24孔板培养条件下一个沉淀对应500 µL，见表3）的4%多聚甲醛（PFA）固定沉淀，室温固定60分钟。</li>
	<li>固定完成后，在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>移除上清液（PFA）。</li>
	<li>用等体积（例如，24孔板培养条件下一个沉淀对应500 µL，见表3）的PBS洗涤，并在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>制备温热的琼脂糖溶液（PBS中含2%琼脂糖）。 
	注：此处用于冷冻切片的细胞沉淀可直接重悬于200 µL OCT包埋剂中，无需进行方案7中的后续步骤。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于200 µL琼脂糖溶液（PBS中含2%琼脂糖）中。
	<ol>
		<li>加入琼脂糖后应立即使用连接在1 mL注射器上的25 G针头轻轻将细胞沉淀从1.5 mL离心管管壁上剥离。如图3所示，若细胞沉淀未从管壁上物理分离，则在琼脂糖包埋过程中可能丢失全部或部分细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等待PBS中的2%琼脂糖完全凝固。</li>
	<li>使用连接在1 mL注射器上的25 G针头将凝固的琼脂糖块从1.5 mL离心管中分离。</li>
	<li>将含有细胞沉淀的琼脂糖块转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>向管中加入70%乙醇（EtOH），并按照常规组织脱水与石蜡包埋流程继续操作。</li>
</ol>
8. 类器官的组织学与免疫荧光细胞化学（IFC）
<ol>
	<li>选择用于组织学或免疫荧光染色（IFC）的载玻片。</li>
	<li>在开始染色过程之前，确定细胞在载玻片上的位置，并使用记号笔在载玻片上细胞周围画一个圆圈。</li>
	<li>在实验记录本中绘制载玻片边缘或边界的轮廓，并标注圆圈在载玻片上的位置，以记录其具体位置。</li>
	<li>进行所需的染色。 
	注意：在此过程中，由于普通记号笔不耐化学试剂，所标记的圆圈会消失。即使某些组织学永久性记号笔，也可能在染色过程中被擦除。</li>
	<li>染色完成后，将载玻片覆盖在实验记录本中的绘图上，以确定载玻片上细胞的位置。</li>
</ol>

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<li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCSD1%2C+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer%2C+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275(2014).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019).</li>
</ol>

Sanghee Lee 和 Christina A.M. Jamieson 是 JoVE 方法合集的客座编辑。

源自患者骨转移性前列腺癌细胞的3D类器官仍相对罕见。本文介绍了建立骨转移性前列腺癌（BMPC）患者来源的系列3D类器官（PDOs）的策略及进一步优化的实验方案。此外，还描述了针对细胞密度较低样本的类器官固定方法，以满足IFC和IHC分析的要求。囊状结构、球状体以及更复杂的类器官所表现出的不同表型表明，本方案提供的培养条件可使患者体内异质性的肿瘤细胞群体保持其细胞表型和组织结构。因此，本研究中所采用的培养条件（基于Drost等5的方法，并添加FBS血清进行改良）已被证明最适合培养患者来源的BMPC细胞，使其保留个体内和个体间的异质性（相关论文正在准备中）。
我们优化的实验方案适用于从有限起始量的原代肿瘤组织或PDX肿瘤组织中建立3D类器官培养，并可实现多种实验终点。通常情况下，从患者原代肿瘤组织建立3D类器官的成功率低于从PDX肿瘤组织建立3D类器官。因此，建议从患者原代肿瘤组织建立3D类器官时，采用更高的细胞接种密度（最高可达PDX肿瘤组织的四倍）。在肿瘤组织处理过程中提高细胞得率的一种方法是：将过滤后残留在70 μm细胞筛网顶部的任...

三维培养的类器官因其能够重现原始组织的体内结构、细胞功能和遗传特征而受到广泛关注1,2,3,4,5。尤为重要的是，由患者肿瘤组织或患者来源的异种移植（PDX）模型建立的3D类器官，为深入理解肿瘤发生过程中细胞信号传导的机制，以及评估药物治疗对各类细胞群体的作用提供了不可替代的研究机会6,7,8,9,10,11,12,13。Drost 等人5建立了一种人和小鼠前列腺类器官培养的标准方案，该方案已在泌尿学领域被广泛采用。此外，研究人员已投入大量努力，进一步表征3D类器官，并深入解析肿瘤发生与转移的详细机制4,12,14,15。除此前已建立并被广泛接受的3D类器官培养方案外，本文还详细描述了一种在优化培养条件下，采用三种不同覆膜方法进行PDO三维培养的逐步操作流程。
在本研究中，建立了三维类器官作为骨转移性前列腺癌（BMPC）的离体模型。用于这些培养的细胞来源于前列腺癌圣地亚哥（PCSD）系列，直接取自患者前列腺癌骨转移肿瘤组织（PCSD18 和 PCSD22），或取自患者来源的异种移植瘤（PDX）模型（样本命名为 PCSD1、PCSD13 和 PCSD17）。由于在基因工程小鼠模型中，前列腺癌细胞发生自发性骨转移极为罕见16，因此我们采用将人源肿瘤细胞直接注射至雄性 Rag2-/-γc-/- 小鼠股骨内（IF）的方法，建立骨转移性前列腺癌的PDX模型17。
一旦从异质性的患者肿瘤细胞或患者来源的异种移植瘤中建立了三维类器官，确认其作为前列腺肿瘤细胞的身份并确定其在三维类器官培养中的表型就显得至关重要。免疫荧光化学（IFC）可实现对每个细胞中蛋白质表达的原位可视化，通常可提示特定细胞群体的潜在功能2,4。通常情况下，针对包括组织和细胞在内的绝大多数样本，IFC方案均较为直接且已全面优化。然而，类器官的细胞密度和数量可能显著低于常规培养物。因此，针对类器官的IFC方案需要增加额外步骤，以确保样本中所有类器官均能被妥善处理并包埋于石蜡中。本文描述了琼脂糖预包埋过程的附加步骤，以及标记切片后类器官在载玻片上位置的技巧，这些方法可显著提高类器官IFC实验的成功率，尤其是在类器官样本的细胞密度低于理想水平时。

<table><tbody><tr><td>1 mL 移液器</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD Syringe</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Spectrum Lab Products</td><td>941-11326-ATP083</td><td></td></tr><tr><td>25G 针头</td><td>BD PrecisionGlide Needle</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇（EtOH）</td><td>VWR</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>adDMEM</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50000</td><td></td></tr><tr><td>细胞角蛋白 5 抗体</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>细胞角蛋白 8 抗体</td><td>Biolegend</td><td>904801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>生物发光成像系统，IVIS 200</td><td>Perkin Elmer Inc</td><td>IVIS 200</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板 - 24 孔</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板 - 48 孔</td><td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板 - 6 孔</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离液，Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>细胞回收溶液</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>83.180</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>3546</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073-1ML</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Corning/Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Denville Scientific</td><td>S728696</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-0420401</td><td></td></tr><tr><td>磁性柱分离器：QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>标记笔</td><td>VWR</td><td>52877-355</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（生长因子减少型）</td><td>Mediatech Inc. (Corning)</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（高浓度）</td><td>BD (Fisher Scientific)</td><td>CB354248</td><td></td></tr><tr><td>显微镜成像软件，Keyence</td><td>BZ-X800（最新软件） BZ-X700（旧版软件）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜，Keyence</td><td>BZ-X700（2016-2017 型号）/BZ-X710（2018-2019 型号）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠细胞去除试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>American National Can</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen-Strep）</td><td>Mediatech Inc. (Corning)</td><td>30-002-CI-1</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 移液器吸头（蓝色吸头）</td><td>Fisherbrand Redi-Tip</td><td>21-197-85</td><td></td></tr><tr><td>推杆（来自 3 mL 注射器）</td><td>BD Syringe</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>前列腺素 E2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 1</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>SB2021190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076-25MG</td><td></td></tr><tr><td>小型台式离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002426</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Sci</td><td>2320</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

建立与分析源自前列腺癌骨转移患者样本及其异种移植瘤的三维（3d）类器官

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

来自人类患者肿瘤标本及前列腺癌患者来源的异种移植（PDX）模型的类器官三维（3D）培养，被称为患者来源类器官（PDO），是研究前列腺癌发生及转移机制的宝贵资源。其主要优势在于，与传统细胞系不同，PDO能够维持原始组织特有的基因组和功能异质性。此外，PDO的3D培养可用于预测药物治疗对个体患者的疗效，是实现个体化医学的重要一步。尽管具有这些优势，目前仍仅有少数研究团队常规使用该方法，部分原因在于不同患者样本可能需要对PDO培养条件进行大量优化。我们先前已证实，所建立的前列腺癌骨转移PDX模型PCSD1能够重现供体患者骨转移灶对雄激素抑制治疗的耐药性。我们利用PCSD1的3D类器官进一步表征了抗雄激素耐药的机制。在综述当前已发表的PDX与PDO模型研究基础上，本文详细描述了一种在优化培养条件下，利用穹顶状或悬浮基底膜（如Matrigel）小球进行PDO三维培养的分步操作方案。同时介绍了体内连续成像及组织学样本的细胞处理方法。该方案可进一步优化用于其他应用，包括蛋白质印迹（western blot）、共培养等，并可用于探究3D培养PDO在药物耐药性、肿瘤发生、转移及治疗反应等方面的特性。

成功从骨转移性前列腺癌（BMPC）的患者来源异种移植瘤（PDX）模型以及直接从患者骨转移性前列腺癌组织中建立了3D类器官（图4）。简言之，我们的BMPC PDX模型通过将肿瘤细胞经股骨内注射（IF）至雄性Rag2-/- c-/-小鼠体内建立，随后按照本文所述方法收获并处理PDX肿瘤组织。如图4所示，来自PCSD系列的PDX肿瘤组织形成了具有不同表型的3D类器官，其表现为囊状结构、球状体以及采用该方案形成的更复杂的类器官结构。
由25张高分辨率10倍放大图像拼接而成的图像显示了完整的基底膜和类器官结构（图5）。通过使用图像分析软件，可以选择筛选出大于特定尺寸的细胞或细胞簇，或手动选择球状体或囊状结构。
类器官培养物的琼脂糖包埋步骤以及在载玻片上标记切片类器官位置的技巧，可提高对类器官进行免疫荧光染色（IFC）...

患者骨髓来源的前列腺癌骨转移样本及其异种移植瘤的三维培养物可维持原始肿瘤的功能异质性，从而形成囊状结构、球状体以及复杂的类肿瘤类器官。本文提供了一种针对异质性患者来源样本进行三维培养的优化策略及实验方案，并介绍了利用成像流式细胞术（IFC）对其进行分析的方法。

建立与分析源自前列腺癌骨转移患者样本及其异种移植瘤的三维（3D）类器官

来自人类患者肿瘤样本及前列腺癌患者来源的异种移植（PDX）模型类器官的三维（3D）培养，见……

我们介绍了建立骨转移性前列腺癌患者来源类器官三维连续培养的策略及逐步操作方案。我们优化后的方案可利用直接来自患者或患者来源异种移植瘤组织的有限起始材料，便捷地建立用于实验的三维培养体系。本方案获得的三维类器官可作为体外模型，用于研究骨转移性前列腺癌病理的基本机制以及进行治疗测试。本方案中的3D类器官培养基专用于前列腺来源的细胞。我们方案的其他部分适用于不同类型的肿瘤组织和转移部位。封顶技术可能是该过程中最具挑战性的步骤。练习穹顶技术可确保类器官、培养基和Matrigel混合物形成的穹顶大小一致，并在样品悬浮过程中尽量减少气泡的产生。通过直观演示该方法，有助于更好地理解如何操作黏稠的Matrigel，从而利用少量细胞成功培养低密度类器官。首先，将细胞沉淀重悬于适用于24孔板体系的适当体积的基底膜基质中。轻轻吹打混匀，确保细胞充分重悬，然后将适量细胞悬液加入预热的组织培养板中央。将培养板倒置，并立即放入设定为37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中，孵育15分钟。向每孔中加入含10 µM Y-27632二盐酸盐的预热培养基适量。为了从已贴附的圆形穹顶形成一个悬浮穹顶，使用细胞刮刀将穹顶从培养板上分离。剪下一小块大小为两英寸乘四英寸的石蜡膜，并将其覆盖在1毫升塑料移液器吸头盒的空吸头架凹槽面上。戴上手套后，用食指轻轻按压石蜡膜，沿凹槽轮廓按压成型，注意不要刺破薄膜。用70%乙醇喷洒石蜡膜，并打开细胞培养罩内的紫外灯，对制备好的膜至少消毒30分钟。同时，将预处理的细胞重悬于20 µL基底膜中。然后将悬液移入石蜡膜上形成的凹坑中。将凝固的凝胶珠和石蜡膜放入六孔板中，用移液器向每孔加入三到五毫升含有10微摩尔Y-27632二盐酸盐的预温培养基，同时轻轻刷下石蜡膜上的凝胶珠。为进行组织学处理，小心吸除孔中现有培养基，注意避免吸走基底膜凝胶滴。加入等体积的细胞回收溶液，将六孔板在4摄氏度下孵育60分钟。孵育结束后，用移液器松动基底膜穹顶，并用移液器吸头将其压碎。收集解离的穹顶及细胞回收液至1.5毫升离心管中。在4°C下以300 × g离心5分钟，然后弃去上清液并保留备用。将所有上清液保存至最后一步，当在预期体积的冷PBS中确认类器官存在后，轻轻吹打混匀，通过机械方式使沉淀物脱离，同时避免破坏类器官。重复离心并移除上清液。用等体积的4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定沉淀物60分钟。固定后，重复离心步骤及 PBS 洗涤。然后缓慢加入 200 µL 温热的 2% 琼脂糖，并立即使用连接在 1 mL 注射器上的 25 号针头轻轻将细胞沉淀从管壁上脱离，注意不要破坏沉淀。对于琼脂糖离心法，加入琼脂糖后立即用 25 号针头将细胞沉淀从管壁上脱离至关重要。待琼脂糖完全凝固后，用连接在1毫升注射器上的25号针头将其从管中剥离，并转移至新的1.5毫升离心管中。加入70%乙醇充满管体，随后按照常规组织脱水与石蜡包埋流程进行操作。该方案已成功用于建立来源于骨转移性前列腺癌患者异种移植模型的三维类器官，也可直接从癌组织中建立类器官。类器官表现出不同的表型，表现为囊状结构、球状体以及更复杂的类器官结构。通过25张高分辨率、10倍放大图像拼接而成的图像，可以观察到完整的基底膜穹顶结构及其中的类器官。为进一步研究肿瘤组织，对厚度为五微米的类器官石蜡切片进行了免疫荧光细胞化学染色，靶标分别为基底上皮细胞标志物细胞角蛋白-5、腔面上皮细胞标志物细胞角蛋白-8以及DAPI。该方案可优化用于其他应用，如蛋白质印迹、共培养和流式细胞术，以研究三维类器官的特性及药物处理的效果。这些实验可用于探讨药物耐药机制，以及新型治疗药物单独使用或与现有疗法联合使用时的疗效。该技术获得的三维类器官保留了个体间和个体内的异质性，因此更能准确模拟患者中的疾病状态。该技术为研究人员探索药物耐药性、肿瘤发生、转移及治疗机制提供了新途径，这些研究可能更准确地预测患者的疾病进展及其对治疗的反应。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

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