从患者前列腺癌骨转移标本及其异种移植物中提取的三维（3D）有机物的建立与分析
2020年2月3日
患者BMPC标本和骨转移性前列腺癌异种移植物的三维培养，保持其原始肿瘤的功能异质性，导致囊肿、球形和复杂的肿瘤状有机体。本手稿为异质患者衍生样本的 3D 培养及其使用 IFC 进行分析提供了优化策略和方案。
我们描述了建立骨转移性前列腺癌的连续3D患者衍生器官的策略和分步方案。我们优化的协议是实用的，用于直接从患者或患者衍生的异种移植肿瘤组织使用有限的起始材料进行实验的 3D 培养物。该协议的3D器官可以用作外体模型，以了解骨转移性前列腺癌病理学的基本机制和测试治疗。
该协议中的3D器官培养基是特定于前列腺衍生细胞。我们协议的其他部分适用于不同类型的肿瘤组织和转移位点。多明技术可能是这个过程最困难的部分。
实践多明技术将确保有机体、介质和 Matrigel 的圆顶混合物的一致尺寸，并最大限度地减少样品悬浮过程中气泡的形成。视觉演示此方法提供了更好的理解如何处理粘性 Matrigel 成功地培养低密度器官从低数量的细胞。首先将细胞颗粒重新在适当体积的地下室膜中重新吸收，进行 24 孔板设置。
轻柔地向上和向下移液，以确保细胞被重新悬浮，然后移液将适当的细胞悬浮量移入预热组织培养板的中心。倒置板，并立即将它倒置在细胞培养培养箱设置在37摄氏度和5%二氧化碳15分钟。将含有10微摩尔Y-27632二氢氯的适当体积预加热介质放入每个井中。
要从连接的圆形圆顶上形成浮动圆顶，请使用电池刮刀将圆顶从板上拆下。切一块两四英寸的石蜡薄膜，从一毫升塑料移液器尖端盒中放在空尖端架的外壳上。使用戴手套的食指轻轻按下石蜡膜，以追踪注意不要突破膜的神器。
用 70% 乙醇喷洒石蜡膜，并打开细胞培养罩中的 UV 灯，对准备好的薄膜进行至少 30 分钟的消毒。同时，在20微升的地下室膜中重新吸收预处理的细胞。然后移液将悬浮液放入石蜡膜中形成的分管中。
将凝固的珠子和石蜡膜放入六井板和移液器中，将含有10微摩尔Y-27632二氢的预加热介质放入每个井中，同时轻轻刷掉石蜡膜上的珠子。要处理组织学的器官，请从井中去除现有介质，注意不要吸气地下室膜圆顶。加入等量的细胞恢复溶液，在4摄氏度下孵育板60分钟。
孵育后，使用移液器将地下室膜圆顶移出，用移液器尖端压碎。将分离的圆顶和细胞恢复溶液收集到 1.5 毫升管中。在4摄氏度内将管以300倍g离心5分钟，然后取出上一代，放在一边。
保存所有的超级纳，直到最后一步，当器官的存在确认在所需的体积的冷PBS和轻轻地移液器上下机械地移液颗粒，而不会破坏器官。重复离心并去除上经剂。在室温下将颗粒以 4%PFA 的匹配体积固定 60 分钟。
固定后，重复离心步骤和 PBS 洗涤。然后慢慢加入200微升热2%agarose，并立即，但轻轻地从管壁分离细胞颗粒，而不中断它使用25量针连接到一毫升注射器。对于气糖自旋方法，使用 25 量表针添加气糖后，将细胞颗粒从管壁上分离出至关重要。
一旦阿加罗斯完全凝固，用一根毫升注射器上连接25针将其从管子上分离，并将其转移到新的1.5毫升管中。用70%乙醇填充管子，并继续执行传统的组织脱水和石蜡嵌入方案。该协议被成功地用于建立3D器官从患者衍生的异种移植模型的骨转移前列腺癌，以及直接从癌症组织。
器官显示不同的表型，表现为囊肿，球状体，和更高复杂性的器官。从 25 个高分辨率、10 倍放大图像的拼接图像中可以看到整个地下室膜和器官圆顶。为了进一步研究肿瘤组织，对针对基底上皮细胞标记细胞蛋白-5、发光上皮细胞标记细胞蛋白-8和DAPI的五微米厚的器官石蜡部分进行了免疫荧光细胞化学。
该协议可以针对其他应用（如西方印迹、共培养和流式细胞学）进行优化，以探索 3D 器官的特性和药物治疗的效果。这些实验可以单独或结合当前疗法，解决耐药性机制和新型疗法的疗效。该技术的3D器官保留了主体间和主体内异质性，因此是患者疾病的更准确模型。
这项技术为研究人员探索耐药性、肿瘤生成、转移和治疗机制铺平了道路，这些机制可以更预测患者的疾病进展及其对治疗的反应。
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概述
本研究提出了从骨转移前列腺癌患者衍生的类器官建立三维（3D）培养的优化协议。这些类器官保持了原始肿瘤的功能异质性，允许对癌症病理和治疗测试进行分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 细胞生物学
背景
- 骨转移前列腺癌在研究中呈现出独特的挑战。
- 与传统的2D培养相比，3D培养可以更好地模拟肿瘤微环境。
- 患者衍生的样本对于理解个体肿瘤特征至关重要。
- 现有的协议可能不适用于有限的起始材料。
研究目的
- 开发患者衍生类器官3D培养的实用协议。
- 在培养中保持肿瘤的异质性。
- 提供一个用于研究骨转移前列腺癌病理的模型。
使用的方法
- 从患者衍生的标本建立连续的3D培养。
- 使用前列腺衍生细胞的特定培养基。
- 应用圆顶技术进行类器官形成。
- 对类器官进行实验测试的分析。
主要结果
- 成功维持来自患者样本的肿瘤样类器官。
- 在3D培养中展示功能异质性。
- 适用于各种肿瘤类型和转移部位的协议。
- 识别圆顶技术中的挑战。
结论
- 优化的协议促进了对骨转移前列腺癌的研究。
- 3D类器官作为治疗测试的宝贵的离体模型。
- 未来的研究可以扩展这些方法以用于更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Three-dimensional patient-derived organoids (PDOs) from prostate cancer bone metastases provide a translationally relevant model that preserves tumor heterogeneity and functional characteristics. This capability enables mechanistic de-risking and predictive confidence for drug response and resistance studies at critical discovery and preclinical inflection points. Integrating PDOs into R&D pipelines supports risk-adjusted portfolio decisions and advances personalized therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tumorigenic pathways and resistance mechanisms in a disease-relevant system.
- Supports functional target validation by maintaining patient-specific genomic and phenotypic heterogeneity.
- Facilitates predictive confidence in target selection and mechanistic de-risking for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Provides validated 3D biological systems for quantitative drug response and resistance assays.
- Enables assay standardization and reproducibility through optimized culture protocols.
- Supports scalable screening of novel therapeutics and combination regimens in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with patient tumor biology for improved translational continuity.
- Enables exploration of drug resistance, metastasis, and therapeutic efficacy in ex vivo systems.
- Supports biomarker discovery and validation in models that reflect clinical heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
PDO establishment from patient and xenograft specimens bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by providing a reusable, disease-relevant platform.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic studies of tumorigenesis and drug resistance.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Enables high-content imaging, immunofluorescence, and molecular profiling for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains patient-specific heterogeneity for biomarker alignment and therapeutic prediction.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to various tumor types and research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and drug validation.
- Operational Value: Standardizes 3D culture workflows for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by modeling clinical heterogeneity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D culture techniques and handling of viscous matrices like Matrigel.
- Demands access to imaging, histology, and molecular analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for protocol reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other tumor types with optimization of culture conditions.
- Limited by technical challenges in doming and sample handling, especially with low cell numbers.
