通过脑室内注射血红蛋白建立新生儿脑室出血模型

本方案具有重要意义，因为我们建立了一种临床相关的脑室内出血（IVH）诱导性脑损伤及脑积水模型，通过向脑室注射血红蛋白，可在后续应用中对脑室体积进行定量分析，从而用于测试新的治疗策略。该技术的主要优势在于，能够专门研究由血红蛋白及铁代谢通路血液分解产物介导的IVH病理过程。此外，该技术操作简便且具有良好的通用性。

该技术的应用前景包括为脑出血后脑积水的治疗提供新思路，因为它有助于进一步理解脑室内出血（IVH）的病理生理机制，并评估具有临床相关性的治疗策略，以预防IVH后神经系统后遗症的发生。本实验操作将由来自澳大利亚实验室的副博士后研究员Sruthi Ramagiri进行演示。首先，将麻醉后的实验大鼠俯卧位固定于立体定位仪中，并将其鼻部置于麻醉适配器内。

然后通过拧紧外耳道处的非穿刺耳杆来固定头部。清洁头部时，先将浸有聚维酮碘的无菌棉签尖端接触头部中心，然后向外移动，以环形方式涂抹聚维酮碘。接着，用浸有70%乙醇的棉签重复此操作。

接下来，使用手术刀在头部正中央垂直向下做一道0.3厘米的切口，以暴露颅骨的前囟。然后用棉签擦拭该区域使其干燥。设置立体定位注射仪时，将先前配制好的血红蛋白溶液吸入一支0.3或0.5毫升的注射器中，并将该注射器安装到立体定位注射仪系统上。

接下来，打开立体定位注射仪的接口，点击配置按钮以输入注射体积和流速参数。点击体积，将体积设置为 20,000 纳升。然后点击灌注速率，将速率设置为每分钟 8,000 纳升。

单击复位位置按钮以退出配置。点击注入按钮冲洗针尖，直至针尖出现一小滴血红蛋白，然后使用棉签轻轻去除该液滴。开始动物注射前，通过调整注射器的内外侧和前后位置，在立体定位注射系统上将前囟设为零点。

然后将注射器针头轻轻下移至触及颅骨前囟点。确定所选坐标后，将注射器针头抬高至颅骨上方1厘米处，以避开头皮。设定正中-外侧和前-后坐标。

然后缓慢降低注射器，使针头轻轻接触颅骨，并在30秒内设定背腹向坐标。坐标设定完成后，点击立体定位注射仪界面上的运行按钮，开始注射。注射结束后，将针头留置原位2分钟，以尽量减少溶液回流。

接下来，在两分钟内沿背腹向坐标缓慢撤出注射器，直至针尖位于头皮上方两厘米处。然后将立体定位注射臂移开手术区域，并使用6-0单股缝线缝合头皮。对于磁共振成像（MRI），选择T2加权快速自旋回波序列进行T2加权成像。

按照文中所述设置 MRI 参数后，点击继续按钮以启动序列。进行图像处理和脑体积分析时，在分割软件中打开原始 T2 加权数据。为手动勾画侧脑室，点击画笔模式并选择方形画笔样式，然后将画笔大小调整为 1。

接下来，单击布局检查器，选择轴向视图，然后单击“适合窗口”以缩放。随后将光标置于图像上，描记并填充侧脑室区域。最后，单击工具栏中的分割按钮，接着选择体积和统计，以查看分割后的体积。

接受血红蛋白注射的动物在通过MRI评估时出现中度脑室扩大。与注射ACSF的动物相比，血红蛋白注射后24小时和72小时，其侧脑室显著增大。尽管两组大鼠在38天后侧脑室体积的差异不再具有显著性，但MRI扫描显示，接受血红蛋白注射的大鼠中仍有44%存在未缓解的脑室扩大。

此外，与ACSF相比，注射血红蛋白在38天后导致白质体积显著减少。血红蛋白还促进了体内的炎症反应，表现为注射血红蛋白后促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α水平显著升高，而注射生理盐水或全血则无此现象。此外，胶质纤维酸性蛋白的免疫组织化学染色显示，与注射ACSF相比，注射血红蛋白后星形胶质细胞的活化程度显著更高。

进行此操作时最重要的是要设定正确的注射坐标，以确保将血红蛋白注入侧脑室。在此操作之后，可将脑脊液示踪剂注入脑脊液腔，以评估脑室内出血（IVH）后脑脊液循环及外流模式的变化。这一附加方法可用于研究脑室内出血后继发性脑积水（IVH PHH）中脑脊液流动的改变情况。