使用液相色谱-串联质谱分析原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi Rhizoma样品
December 23rd, 2022
在这里，使用超高效液相色谱-高分辨率串联质谱（UPLC-MS/MS）对原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi rhizoma（CR）样品进行了比较分析。检查CR处理的大鼠和醋处理的CR（CRV）大鼠之间代谢物和样品成分的血液水平变化。
代谢组学测量整体和动态代谢反应，与确定传统中药的整体疗效一致。由于身体代谢反应引起的药物成分的变化可以通过代谢组学来确定。利用该技术可以缩小中药有效成分的筛选范围。
通过研究单个成分可以避免片面性。该方法可以同时测定吸收到血液中的内源性代谢物和外源性成分。代谢组学已广泛应用于中医药、药物毒理学、健康管理、体育、食品等领域的研究。
首先，确定所需的Cyperi rhizoma提取物，或CR，或用醋或CRV处理的Cyperi rhizoma，以治疗一组六只Sprague Dawley大鼠三天。使用此公式计算每只大鼠要施加的CR或CRV的体积。要处理CRV，请充分混合100克CR和20克醋，每100毫升含有超过5.5克乙酸，并孵育12小时。
孵育后，将混合物在 110 至 120 摄氏度的铁锅中翻炒 10 分钟。然后，取出混合物，让它在室温下冷却。要制备CR提取物，请用10倍于CR量的纯水浸泡CR两个小时，确保药材低于液位。
接下来，将水和药物的混合物用大火煮沸，并在小火下煮沸20分钟。然后，通过100目滤布过滤内容物，并收集滤液。然后，将收集的滤液浓缩到带有旋转蒸发器的提取物中至每毫升一克。
要制备 CRV 提取物，请执行浸泡、煮沸和浓缩的步骤，如 CR 提取所示。为了测试CR和CRV提取物，将500微升提取物移液到1.5毫升微量离心管中的500微升甲醇中，并涡旋30秒以混合。将样品在 16， 500 g 下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。
然后，取出上清液，并将其转移到样品瓶中进行测试。测试样品后，使用分析软件执行主成分分析或PCA和建模。将代谢物的标准化数据导入软件，然后使用Autofit构建分析模型。
最后，使用分数获得PCA的分数散点图。要执行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），请将代谢物以及CR和CRV组的标准化数据导入软件。然后，将 CR 和 CRV 数据导入到各自创建的组中。
然后，使用自动拟合构建分析模型，并使用分数获取OPLS-DA的分数散点图。最后，使用VIP获取投影中的可变显著性或OPLS-DA中的VIP值。要识别潜在的差异代谢物，请筛选出VIP值大于1的代谢物。
然后，使用统计软件通过学生的T检验计算筛选代谢物的P值。接下来，要鉴定差异代谢物，请使用注释的代谢物，并筛选出要在KEGG数据库中匹配的差异代谢物。通过绘制热图显示CR和CRV组中差异代谢物的变化。
要检查潜在的代谢途径，请访问MetaboAnalyst数据库。使用途径分析上传不同的代谢物以获得潜在的代谢途径。将不同的代谢物上传到KEGG数据库，以分析潜在的代谢途径。
分析的痛经模型实验显示前列腺素水平存在显著差异。模型CR组和CRV组的大鼠在注射催产素后表现出大量的扭动反应。PCA分析结果表明，在正负离子模式下，CR组和CRV组与模型组的团簇均有显著分离。
采用OPLS-DA筛查代谢差异，散点图结果表明CR组和CRV组是分开的。进行单变量统计分析以确定代谢变化。显示了火山图，其中每个点对应于不同的代谢物。
在阳性模式下观察到63种代谢物和阴性模式下的30种代谢物发生显着变化。使用KEGG和HDMB数据库测定差异代谢物，并列出精确匹配的化合物。计算CR组和CRV组间差异代谢物的定量值并进行聚类。
色块表示每种代谢物相对于其他代谢物的表达方式。与CR组相比，CRV组4种差异代谢物水平升高，11种代谢物水平在正离子模式下下降。在负离子模式的情况下，四种差异代谢物增加，七种代谢物减少。
KEGG通路分析结果表明，差异代谢产物在正负模式下与9个通路相关。差异代谢物越多，结果越好，因此可以链接足够的代谢途径，筛选的关键代谢途径将更准确。
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概述
本研究通过超高效液相色谱-高分辨率串联质谱（UPLC-MS/MS）对原始和经加工的小茅根（CR）样本进行了比较分析，并将其应用于原发性痛经大鼠。它考察了CR处理的大鼠与醋加工的CR（CRV）处理的大鼠之间的代谢物和样品成分的血液水平变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 代谢组学
- 中医药学
背景
- 代谢组学测量动态代谢反应。
- 它有助于确定中医药（TCM）的功效。
- 可以使用此技术筛选中医药的活性成分。
- 它允许同时确定内源性代谢物和外源性成分。
研究目的
- 分析原始和经加工CR的代谢反应。
- 比较CR和CRV对血液代谢物水平的影响。
- 通过代谢分析增强对中医药功效的理解。
使用的方法
- 超高效液相色谱-高分辨率串联质谱（UPLC-MS/MS）。
- 大鼠模型中代谢物水平的比较分析。
- 对经过处理的大鼠的血液样本进行评估。
- 评估样品成分的变化。
主要结果
- 识别CR和CRV处理之间代谢物水平的显著差异。
- 了解受CR和CRV影响的代谢途径。
- 支持经加工CR在管理原发性痛经中功效的证据。
- 通过代谢分析为中医药的理解做出贡献。
结论
- 代谢组学是评估中医药的宝贵工具。
- 经加工的CR在代谢反应中显示出比原始CR潜在的益处。
- 需要进一步的研究来探索这些发现的含义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Metabonomics-driven profiling of Cyperi rhizoma (CR) and its vinegar-processed form (CRV) in a dysmenorrhea rat model enables precise mapping of metabolic pathway modulation and constituent bioavailability. This approach supports mechanistic de-risking and target validation for botanical therapeutics, informing early discovery and translational research decisions. Quantitative metabolite analysis enhances predictive confidence for portfolio triage and prioritization in natural product drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping metabolic pathway shifts after CR and CRV administration.
- Supports biological de-risking through identification of differential metabolites and pathway associations.
- Provides functional target validation by linking constituent changes to analgesic and anti-inflammatory pathways.
- Facilitates predictive confidence for advancing botanical leads in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Delivers validated quantitative metabolite profiles for downstream screening workflows.
- Standardizes measurement of exogenous and endogenous metabolites for reproducibility.
- Enables robust comparison of raw versus processed botanical extracts in assay development.
- Supports reliable evaluation of compound efficacy and mechanistic impact.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic pathway modulation with disease-relevant mechanisms in dysmenorrhea models.
- Provides continuity from discovery-stage metabolic profiling to preclinical biomarker identification.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying pathway-specific effects of botanical processing.
- Enhances predictive de-risking for natural product-based therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This UPLC-MS/MS-based metabonomics workflow integrates from early discovery through preclinical validation, supporting lead identification and mechanistic de-risking for botanical therapeutics.
- Discovery Biology: Quantitative metabolite profiling clarifies pathway engagement and constituent bioavailability.
- Screening: Standardized metabolite measurements enable reproducible comparison of extract efficacy.
- Analytics: Multivariate and univariate statistical outputs (PCA, OPLS-DA, VIP, volcano plots) facilitate condition comparison and differential metabolite identification.
- Translational Research: Pathway analysis links metabolic changes to disease-relevant mechanisms, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for other botanical extracts and disease models, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in botanical drug discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable metabolite analysis workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management for natural product leads.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of botanical candidates based on quantitative pathway data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in UPLC-MS/MS operation and metabolomics data analysis.
- Demands access to advanced analytical instrumentation and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data processing protocols.
- Adaptation across botanical sources and disease models may require pathway-specific validation.
- Interpretation of metabolic pathway data must be grounded in robust statistical analysis and database annotation.
