Name: 使用液相色谱-串联质谱分析原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi Rhizoma样品 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 了解使用超高效液相色谱-串联质谱技术比较分析生香附与醋制香附在原发性痛经大鼠模型中的代谢差异，揭示中药炮制对药效的影响机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到重庆市卫生健康委员会中医药科技项目（项目编号：ZY201802297）、重庆市自然科学基金面上项目（项目编号：cstc2019jcyj-msxmX065）、重庆市现代山地特色高效农业技术体系创新团队建设计划2022[10]以及重庆市卫生健康委员会中药炮制学重点学科建设项目的支持。

所有动物相关实验均经重庆市中医院实验伦理委员会批准。本实验选用24只8至10周龄、体重为200克±20克的雌性Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）。
1. 提取物的制备
<ol>
	<li>计算
	<ol>
		<li>计划向六只Sprague-Dawley大鼠（10 g/[kg&#8729;天]，连续3天。使用浓度为1 g/mL的CR或CRV提取物（每1 mL提取物由1 g药材制得）。 
		注：CR 的用量为 6–10 g。本研究采用最大用量 10 g 作为给药剂量。由于成年人平均体重为 60 kg，成人剂量为 0.1667 g/kg。根据体重换算算法24，由于人与大鼠之间的剂量转换系数为6.3，大鼠的给药剂量为1.05 g/kg。为增强药效，大鼠剂量提高10倍至10.5 g/kg。为便于计算和实际操作，实验中设定剂量为10 g/kg。例如，按计算若共需36 g的CR或CRV，则中药至少需制备两次。因此，共需200 g的CR——其中100 g作为CR使用，另100 g经醋制备成CRV。</li>
		<li>使用公式（计算每只大鼠应给予的 CR 或 CRV 体积1): 
		V = 10 g/(kg&#8729;天 &#215; 200 g/(1 g/mL) = 2 mL&#160; &#160;(1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CRV的炮制
	<ol>
		<li>将100 g CR与20 g醋混合（&#62;5.5 g 乙酸/100 mL）充分混合，孵育 12 小时。 
		注意：为确保12小时后醋能润透莎草根内部，需将莎草根与醋混合，充分搅拌，之后再次搅拌，直至内部湿润。</li>
		<li>在铁锅中将混合物炒制10分钟，温度控制在110–120 &#176;C. 然后，取出混合物，在室温下冷却。 
		注意：为防止 Cyperi rhizoma（CR）焦化，加热时需持续搅拌。若炮制后的 CRV 过湿，可在 60 °C 下干燥。 &#176;C. 当醋制香附表面呈棕褐色时，可停止炒制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取
	<ol>
		<li>CR提取物
		<ol>
			<li>加入10倍量（药材量）的纯化水至CR中，浸泡2小时。浸泡时需确保药材完全浸没于液面以下。 
			注意：CR 在提取前仅需切成两半。浸泡的目的是更有效地提取活性成分，该步骤至关重要。</li>
			<li>将水与药材的混合物用大火煮沸后，改用小火保持沸腾20分钟。用滤布（100目）过滤，收集滤液。 
			注意：煎煮时，先用武火加热至沸腾，后用文火维持沸腾。</li>
			<li>重复步骤 1.3.1.2 一次，并合并滤液。</li>
			<li>使用旋转蒸发仪将提取物浓缩至1 g/mL（以原药材计，浓缩温度须低于60℃）。 &#176;C）。 
			注意：CR 中的活性成分具有挥发性，因此浓缩温度不应高于 60 &#176;C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>CRV提取物
		<ol>
			<li>执行与CR提取方法相同的步骤（1.3.1.1–1.3.1.3）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用于测试的 CR 提取物
		<ol>
			<li>移液500 &#181;L 的 CR 提取物和 500 &#181;将甲醇加入1.5 mL离心管中，涡旋振荡30秒以混匀。 
			注意：甲醇与水的混合液可更好地提取活性成分。提取物不应直接过滤后用于检测。</li>
			<li>每个样品在1,650 × g下离心15分钟 &#215; g 在 4 &#176;C. 过滤上清液，然后转移至样品瓶中用于检测。 
			注意：甲醇与提取物的混合物经高速离心后，上清液可直接转移至进样瓶进行测定，无需过滤。由于离心过程中会产生热量，建议使用冷冻离心机。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用于测试的CRV提取物
		<ol>
			<li>执行步骤 1.3.3.1–1.3.3.2 以制备用于检测的 CRV 提取物。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物
<ol>
	<li>计算
	<ol>
		<li>取50 mg苯甲酸雌二醇，加入50 mL橄榄油中，配制成1 mg/mL的溶液。取50 mg催产素，加入50 mL生理盐水中，配制成1 mg/mL的溶液。 
		注意：苯甲酸雌二醇和催产素腹腔注射的剂量为 10 mg/(kg&#8729;天）。苯甲酸雌二醇溶于橄榄油，催产素溶于生理盐水。苯甲酸雌二醇在橄榄油中不易溶解，可采用超声处理以加速溶解。苯甲酸雌二醇溶液和催产素溶液均需每日新鲜配制。</li>
		<li>计算每只大鼠所需应用的苯甲酸雌二醇溶液体积（即 V = 10 mg/[kg&#8729;天 &#215; 200 g/[1 g/mL] = 2 mL）。计算每只大鼠所需应用的催产素溶液体积（即 V = 10 mg/[kg&#8729;天 &#215; 200 g/[1 g/mL] = 2 mL</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物分组与给药 
	注：给药周期设定为10天25,26在治疗期间，大鼠可自由摄取标准饲料和水。在给予催产素后30分钟内，记录每只大鼠的扭体反应。通过模型大鼠出现的扭体反应，包括子宫收缩、单肢旋转、后肢伸展、躯干凹陷及腹部收缩，证实痛经大鼠模型构建成功。26.
	<ol>
		<li>选取24只雌性Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠，8–10周龄，体重200 g） &#177; 将20 g随机分为对照组、模型组、CR组和CRV组，喂养7天。</li>
		<li>动物给药
		<ol>
			<li>对模型组、CR组和CRV组大鼠每日腹腔注射2 mL苯甲酸雌二醇溶液。对对照组大鼠每日腹腔注射2 mL生理盐水。</li>
			<li>从第8天开始，完成步骤2.2.2.1。随后，向CRV组大鼠灌胃给予2 mL CRV提取物，向CR组大鼠灌胃给予2 mL CR提取物，向对照组和模型组大鼠灌胃给予2 mL生理盐水。</li>
			<li>第10天，完成步骤2.2.2.2。然后，向模型组、CR组和CRV组大鼠腹腔注射2 mL催产素溶液，向对照组大鼠腹腔注射2 mL生理盐水。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>记录注射催产素后30分钟内大鼠的扭体次数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品采集
	<ol>
		<li>采集腹主动脉血液样本，迅速且完整地切除子宫，并仔细分离附着在子宫壁上的结缔组织和脂肪。 
		注意：血液在末次给药后尽可能接近1小时内采集。</li>
		<li>使用微量离心管保存子宫组织并转移至液氮中。将组织样本储存在−80℃ &#176;C.</li>
		<li>将血液样本在4,125 ×g 条件下离心10分钟 &#215; g. 移除含血清的上清液，于16,502 × g离心 &#215; g 4℃下离心10分钟 &#176;C. 离心血清，然后将其置于−80 °C的离心管中保存 &#176;C 用于储存。 
		注意：血液样本必须在室温下放置1小时以进行后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品处理
	<ol>
		<li>血清样品
		<ol>
			<li>加入400 &#181;毫升甲醇和200 &#181;将血清L加入微量离心管中，涡旋振荡30秒以混匀。每个样品在16,502 × g下离心15分钟 &#215; g 在 4 &#176;C. 收集并过滤后，用上清液填充样品瓶。将每份样品的上清液等体积混合，制备用于检测的质量控制样品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>子宫组织样本
		<ol>
			<li>取同侧子宫组织100 mg，加入9倍体积的生理盐水研磨。将匀浆在4,125 ×g离心10 min &#215; g，收集上清液。将上清液置于4℃冰箱中保存。 &#176;用于测试或在 −80 &#176;若非当天进行测试，则需如此处理。</li>
			<li>将生理盐水、组织和钢珠放入2 mL 微型离心管中，将微型离心管置于液氮中3-5 s，然后将组织放入组织研磨器中进行研磨。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品检测
	<ol>
		<li>使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测PGF2&#945; 和 PGE2 大鼠样本子宫组织中的含量 
		注意：大鼠 PGE2 采用ELISA试剂盒检测PGE2 含量，以及大鼠PGF2&#945; 采用ELISA试剂盒检测PGF水平2&#945; 水平。详细步骤可参见试剂盒说明书。该试剂盒的具体信息如下 材料表.</li>
		<li>采用超高压液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测血清样本、CR提取物和CRV提取物。
		<ol>
			<li>对于超高效液相色谱，使用C18色谱柱（2.6 &#181;m，2.1 mm × 100 mm）及双梯度洗脱方法，流动相A含0.1%甲酸，流动相B为乙腈。洗脱梯度设置如下：0 min至1 min，15% B；1 min至8.5 min，15%至85% B；8.5 min至11.5 min，85% B；11.5 min至11.6 min，99%至1% B；11.6 min至15 min，15% B。流速设为0.35 mL/min，进样量为2 &#181;L.</li>
			<li>对于质谱（MS），将温度设置为 600 &#176;C，将帘气（CUR）流速设为0.17 MPa，鞘气和辅助气流速均设为0.38 MPa。正离子模式和负离子模式的离子喷雾电压分别设为5.5 kV和−4.5 kV，去簇电压（DP）设为80 V或−80 V，碰撞能量（CE）设为40 eV或−25 eV，碰撞能量叠加（CES）设为35 eV &#177; 15 eV</li>
			<li>按照制造商的说明，使用UPLC-MS/MS进行检测。质谱检测的质量扫描范围为50–1,000 m/z。</li>
			<li>使用匹配的工作站程序，结合检测模式的信息依赖性采集、多重质量缺陷过滤和动态背景扣除功能，获取UPLC-MS/MS结果。采用混合血清质控样品检测UPLC-MS/MS设备的重复性和稳定性，以验证常规方法的可靠性。在分析研究样品前，连续进样质控样品四次，随后每分析五个血清样品后进样一次质控样品。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据处理
<ol>
	<li>数据准备
	<ol>
		<li>使用转换软件将原始数据转换为 mzXML 格式。对每个样本的总离子流（TIC）数据进行归一化处理。 
		注：采用基于 XCMS 构建的内部 R 语言应用程序（www.lims2.com）对积分、对齐、提取和峰检测信息进行分析27。</li>
		<li>使用专有的 MS2 数据库（www.lims2.com）进行代谢物注释。将注释阈值设为 0.328。 
		注：在各组中鉴定了内源性代谢物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主成分分析与正交偏最小二乘判别分析
	<ol>
		<li>使用分析软件进行主成分分析（PCA）建模。将代谢物的标准化数据导入分析软件，然后使用 autofit 建立分析模型，最后使用 score 获得 PCA 的得分散点图。 
		注：通过 PCA 得分散点图获得各组的聚类情况。PCA 是一种无监督分析模式，主要通过降维对样本进行分组，无需人为干预。</li>
		<li>使用分析软件进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。
		<ol>
			<li>将 CR 组和 CRV 组中代谢物的标准化数据导入分析软件。</li>
			<li>将 CR 组的数据导入已创建的 CR 组，将 CRV 组的数据导入已创建的 CRV 组。 
			注：OPLS-DA 是一种有监督的分析模式，必须对样本进行分组。</li>
			<li>然后使用 autofit 建立分析模型，使用 score 获得 OPLS-DA 的得分散点图，最后使用 VIP 获得 OPLS-DA 中的投影变量重要性（VIP）值。 
			注：通过 OPLS-DA 获得了 CR 组和 CRV 组中代谢物的投影变量重要性（VIP）值。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>潜在差异代谢物的筛选
	<ol>
		<li>筛选出第 3.2.2.3 步中 VIP 值大于 1 的代谢物。</li>
		<li>使用统计软件通过 Student's t-检验计算第 3.3.1 步筛选出的代谢物的 P 值。 
		注：通过 Student's t-检验确定 CR 组与 CRV 组中潜在差异代谢物的显著性差异。潜在差异代谢物定义为 Student's t-检验 P 值 &#60; 0.05 且投影变量重要性（VIP）值大于 1 的代谢物。结果通过火山图进行展示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>差异代谢物的鉴定
	<ol>
		<li>对第 3.3 步中的潜在差异代谢物进行筛选，并结合第 3.1.2 步的结果对这些差异代谢物进行鉴定。 
		注：少数潜在差异代谢物被成功鉴定，成为候选差异代谢物。</li>
		<li>筛选出需在 KEGG 数据库中匹配的差异代谢物，并通过绘制热图展示 CR 组与 CRV 组中差异代谢物的变化情况。 
		注：少数候选差异代谢物在数据库中成功匹配，最终确认为差异代谢物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>潜在代谢通路的分析
	<ol>
		<li>将差异代谢物上传至 Metaboanalyst 数据库（www.metaboanalyst.ca）。</li>
		<li>使用 Pathways Analysis 功能获取潜在的代谢通路。 
		注：在 CR 组和 CRV 组中获得了潜在的代谢通路。其中 P 值和影响值是筛选关键通路的两个重要指标，P 值更为重要。显著性定义为 P 值 &#60; 0.05；影响值越大，相关性越强。</li>
		<li>通过将差异代谢物上传至 KEGG 数据库（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）进一步分析潜在代谢通路。 
		注：还需考虑代谢通路功能与 PD 之间的关系，最终确定关键代谢通路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>入血成分的鉴定
	<ol>
		<li>利用内部 MS2 数据库（www.lims2.com）、人类代谢组数据库（HMDB）、Massbank 和 Chemspider 数据库鉴定 CR 和 CRV 提取物中的化学成分。</li>
		<li>确定 CR 组和 CRV 组中入血的成分，并比较两组之间的成分差异。 
		注：入血成分必须在 CR 或 CRV 组中检测到，但在对照组中无法检测到。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析
	<ol>
		<li>采用单变量分析（UVA）和多变量统计方法（包括方差分析（ANOVA）和 Student's t-检验）对数据进行分析。 
		注：实验数据以统计软件输出的均值 ± 标准差（±SD）表示。P &#60; 0.01 视为极显著差异，P &#60; 0.05 表示显著差异28。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

由于中药种类繁多且性质各异，这些草药在临床实践中有时疗效不佳，这可能与中药的炮制和煎煮方法不当有关。随着现代科学技术的应用，中药的作用机制正变得日益清晰29,30。本研究表明，制川乌（CR）和醋制川乌（CRV）均对帕金森病模型大鼠具有治疗作用，且CRV的治疗效果更为显著。CRV的作用机制可能与醋制炮制工艺影响了CR中被吸收入血的化学成分有关，也可能涉及亚油酸代谢及不饱和脂肪酸的生物合成。图10展示了CRV在镇痛作用中的潜在通路。
<img alt="脂肪酸代谢图解；COX酶，花生四烯酸通路，促炎与抗炎过程" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64691/64691fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图10"...

原发性痛经（PD）是妇科临床最常见的病症，其特征是在无生殖系统盆腔病理改变的情况下，于月经来潮前或经期出现腰痛、肿胀、腹痛或腹部不适1。一项关于其患病率的报告显示，85.7%的女性学生患有原发性痛经2。低剂量口服避孕药是目前的标准治疗方法，但其不良反应（如深静脉血栓）日益受到关注3。口服避孕药使用者中深静脉血栓的发生率&#62;每1,000名女性中超过1例，且风险在用药最初的6–12个月以及年龄超过40岁的使用者中最高4。
长久以来用于传统中医的莎草根茎（CR）来源于干燥的莎草科植物莎草的根茎 香附子 L. 的 莎草科 家族。CR 调节月经失调，并缓解抑郁和疼痛5. CR 在妇科中被广泛应用，并被视为一种治疗女性疾病的通用药物6醋制川芎（CRV）在临床上通常被使用。与生川芎（CR）相比，CRV在调经和镇痛方面表现出更强的调节作用。现代研究表明，CR通过抑制环氧化酶-2（COX-2）及其后续前列腺素（PGs）的合成，从而发挥抗炎作用。同时，CR具有无副作用的镇痛效果。7，因此CR是治疗痛经患者的理想选择。然而，CRV调节月经和缓解疼痛的潜在机制尚不清楚。目前关于CR的研究主要集中在其中活性化学成分的变化及其药理活性，例如抗炎、抗抑郁和镇痛作用8,9,10,11,12.
尽管中药成分复杂，但其成分需被吸收进入血液，并达到特定的血药浓度才能发挥疗效13通过采用血中成分测定策略，可缩小中药活性成分的筛选范围，避免在化学成分研究中的盲目性。 体外，且在研究各个组分时可避免片面性14通过比较血液中CR与CRV的成分，可有效且快速地检测出炮制后CR中活性成分的变化。药物疗效是指药物对机体产生的影响过程。借助代谢组学，可确定因机体代谢反应所导致的药物成分变化，这些变化可能与药物的作用机制相关。代谢组学旨在测量整体且动态的代谢响应，这与确定中药整体疗效的目标相一致。15此外，代谢物是基因表达的最终产物，与表型关系最为密切。16因此，代谢组学可能适用于探索CR与CRV在治疗帕金森病（PD）过程中代谢通路的差异。基于液相色谱-高分辨串联质谱（LC-MS/MS）的非靶向代谢组学具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，可用于检测多种不同的小分子代谢物。17,18该方法可同时测定内源性代谢物及吸收入血的外源性成分。代谢组学已广泛应用于中医药研究中19药物毒理学20，健康管理21，体育22，食物23以及其他领域。
本研究采用基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的非靶向代谢组学方法，测定CR治疗组与CRV治疗组痛经模型大鼠血液中外源性成分的吸收情况及内源性代谢物的差异，以揭示CRV镇痛作用的机制。

<table><tbody><tr><td>乙腈&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国</td><td>197164</td><td></td></tr><tr><td>BECKMAN COULTER Microfuge 20</td><td>Beckman&amp;nbsp;库尔特公司</td><td>MRZ15K047</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸雌二醇</td><td>上海麦克林生化有限公司</td><td>C10042616</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国</td><td>177799</td><td></td></tr><tr><td>LC 30A 系统</td><td>岛津，日本京都</td><td>228-45162-46</td><td></td></tr><tr><td>橄榄油</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>H25A11P111909</td><td></td></tr><tr><td>催产素合成</td><td>浙江肽类生物学有限公司&amp;nbsp;</td><td>2019092001</td><td></td></tr><tr><td>大鼠PGF&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sub&gt;&amp;alpha;&lt;/sub&gt; ELISA试剂盒</td><td>上海逸迈生物工程有限公司</td><td>202101</td><td></td></tr><tr><td>大鼠前列腺素E&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ELISA试剂盒</td><td>上海逸迈生物工程有限公司</td><td>EDL202006217</td><td></td></tr><tr><td>SPF级Sprague-Dawley大鼠</td><td>湖南赛佳实验动物有限公司</td><td>证书编号 SCXK (湖南) 2019-0004</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH, Austria</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>Triple TOF 4600 系统</td><td>SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉</td><td>BK20641402</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国</td><td>152720</td><td></td></tr></tbody></table>

使用液相色谱-串联质谱法分析原生及炮制过 cyperi rhizoma 样品在原发性痛经大鼠中的应用

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

莎草根（CR）在中国广泛用于妇科，是治疗女性疾病的一种常用药物。由于醋制后莎草根的镇痛作用增强，临床上通常使用醋制莎草根（CRV）。然而，醋制增强其镇痛作用的机制尚不明确。本研究采用超高压液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测痛经大鼠经CR与CRV治疗后外源性成分及其代谢物在血液中的水平变化。结果表明，这两组大鼠血液中15种成分和2种代谢物的水平存在差异。其中，CRV组中(-)-桃金娘醇和[(1R,2S,3R,4R)-3-羟基-1,4,7,7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸的含量显著高于CR组。CRV通过调节花生四烯酸和亚油酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成，降低具有促炎、血小板聚集和血管收缩活性的2系列前列腺素和4系列白三烯水平，从而发挥镇痛作用。本研究揭示了醋制可增强莎草根的镇痛效果，有助于进一步理解CRV的作用机制。

痛经模型实验分析 
对照组大鼠在30分钟内未出现扭体反应，因为这些大鼠未接受腹腔注射催产素和苯甲酸雌二醇以诱发疼痛。模型组、CR组和CRV组大鼠在注射催产素后表现出明显的扭体反应。这些结果表明，苯甲酸雌二醇与催产素联合使用在诱导痛经方面具有显著效果。模型组与对照组之间在PGF2α、PGE2以及PGF2α/PGE2水平上的差异具有统计学意义（P &lt; 0.001，P &lt; 0.05），进一步验证了该模型的有效性（图1）。
<img alt="对照组与模型组中PGF2α、PGE2、PGF2α/PGE2比值及扭体次数的箱线图比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64691/64691fig01.jpg" data-altupda...

本文采用超高效液相色谱-高分辨串联质谱法（UPLC-MS/MS），对原生及经醋制处理的莎草根（CR）在原发性痛经大鼠模型中的样本进行了比较分析。研究考察了经CR与醋制莎草根（CRV）处理的大鼠体内代谢物及其样本成分在血液中水平的变化。

使用液相色谱-串联质谱法分析原生及炮制过 Cyperi Rhizoma 样品在原发性痛经大鼠中的应用

香附（Cyperi rhizoma，CR）在妇科中广泛应用，是中国治疗女性疾病的一种常用药物。由于香附的镇痛作用……

代谢组学可检测整体且动态的代谢响应，这与评价中药整体疗效的理念相一致。通过代谢组学可以确定药物组分在机体代谢反应作用下的变化，从而利用该技术缩小中药活性成分的筛选范围。通过研究各个组分可以避免片面性。该方法可同时检测内源性代谢物以及被吸收进入血液的外源性成分。代谢组学已广泛应用于中药、药物毒理学、健康管理、运动、食品及其他领域的研究。首先，确定治疗六只Sprague Dawley大鼠连续三天所需的莎草根提取物（CR）或醋制莎草根（CRV）的用量。使用以下公式计算每只大鼠所需的CR或CRV体积。制备CRV时，将100克莎草根与20克醋（每100毫升含超过5.5克乙酸）充分混合，并孵育12小时。孵育后，将混合物放入铁锅中，在110至120摄氏度下翻炒10分钟。然后取出混合物，于室温下冷却。制备CR提取物时，取CR药材，加入其重量10倍的纯化水浸泡2小时，并确保药材完全浸没于液面以下。接下来，将水与药物的混合物用大火加热至沸腾，然后转小火保持沸腾20分钟。随后，用100目滤布过滤溶液，收集滤液。再使用旋转蒸发仪将收集的滤液浓缩成每毫升含1克药材的提取物。为制备CRV提取物，按照CR提取所示的方法进行浸泡、煮沸和浓缩步骤。在测试CR和CRV提取物时，将500微升提取物加入含有500微升甲醇的1.5毫升微量离心管中，涡旋振荡30秒以混匀。在4摄氏度、16,500 g条件下离心样品15分钟。然后，移除上清液，并将其转移至样品瓶中用于检测。样品检测完成后，使用分析软件进行主成分分析（PCA）及建模。将代谢物的标准化数据导入软件，然后使用Autofit构建分析模型。最后，利用得分生成主成分分析（PCA）的得分散点图。为了进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），将代谢物的标准化数据以及CR组和CRV组信息导入软件中，随后将CR和CRV的数据分别导入其对应的分组中。然后，使用Autofit构建分析模型，并通过得分获得OPLS-DA的得分散点图。最后，利用VIP获取OPLS-DA中投影变量重要性（VIP值）。为鉴定潜在的差异代谢物，筛选出VIP值大于1的代谢物。然后，使用统计学软件通过学生t检验计算筛选出的代谢物的P值。接着，利用已注释的代谢物鉴定差异代谢物，并筛选出需在KEGG数据库中进行匹配的差异代谢物。通过绘制热图展示CR组和CRV组中差异代谢物的变化情况。为了研究潜在的代谢通路，请访问 MetaboAnalyst 数据库。使用通路分析功能上传差异代谢物，以获取潜在的代谢通路。将差异代谢物上传至 KEGG 数据库，以分析其潜在的代谢通路。分析痛经模型实验显示，前列腺素水平存在显著差异。模型CR组和CRV组大鼠在注射催产素后表现出明显的扭体反应。PCA分析结果表明，在正离子和负离子模式下，CR组和CRV组与模型组的聚类均显著分离。采用OPLS-DA分析筛选代谢差异，散点图结果显示CR组与CRV组之间实现了分离。通过单变量统计分析鉴定代谢物的变化。图中显示了火山图，其中每个点代表一种不同的代谢物。在正离子模式下观察到63种代谢物发生显著变化，在负离子模式下有30种代谢物发生显著变化。利用KEGG和HDMB数据库确定差异代谢物，并列出准确匹配的化合物。计算并聚类分析了CR组与CRV组之间差异代谢物的定量数值。颜色色块表示各代谢物相对于其他代谢物的表达情况。与CR组相比，在正离子模式下，CRV组中有4种差异代谢物水平升高，11种代谢物水平降低。在负离子模式下，有4种差异代谢物水平升高，7种代谢物水平降低。KEGG通路分析结果表明，差异代谢物在正离子模式和负离子模式下与九条通路相关。差异代谢物越多，结果越理想，因此能够关联足够的代谢通路，筛选出的关键代谢通路也将更加准确。

analysis-raw-processed-cyperi-rhizoma-samples-using-liquid

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

使用液相色谱-串联质谱分析原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi Rhizoma样品

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

本文展示了壮医药线灸在实验动物中的标准化操作流程。为了实现壮医药线灸的可重复性和准确性，我们开发了一种模拟器以保持施灸的力度、温度和频率。我们建立了寒凝血瘀型痛经大鼠模型，用于实验验证。...

壮医药线灸疗法及其在原发性痛经寒凝证大鼠模型中的应用

我们介绍了一种将高分辨率质谱分析与分子对接相结合的通用方案，用于中药研究。...

高分辨率串联质谱法用于研究菊三七（Gynura bicolor DC）的化学成分

本文详细描述了在治疗寒凝血瘀型原发性痛经大鼠时，对脐部进行隔药灸的操作步骤及注意事项。该方法可显著改善痛经大鼠的扭体反应，缓解疼痛症状。...

基于寒凝血瘀型原发性痛经大鼠模型的神阙穴隔药灸疗法

使用左旋多巴（L-DOPA）进行多巴胺替代药物治疗是帕金森病最常用的对症治疗方法，但伴随有包括称为运动障碍的不自主异常运动等副作用1。本文介绍了一种基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI成像质谱）的实验方案，可用于检测与运动障碍相关的神经肽在大鼠脑内水平的变化。...

帕金森病中神经肽的基质辅助激光解吸电离成像质谱分析

利用临床前正电子发射断层扫描结合可注射放射性探针18F-氟脱氧葡萄糖，可对大鼠脑缺血所致的脑损伤进行无创成像和研究。此外，使用包含感兴趣区域（VOI）脑模板的现代软件工具，可显著提高从这些研究中获得的定量信息。...

使用18F-FDG进行活体大鼠脑缺血的无创成像与分析

采用细胞刷取样法从宫颈管收集淋巴细胞和单核细胞是一种微创技术，可获取用于女性生殖道免疫研究的样本。在本方案中，我们描述了细胞刷样本的采集以及用于流式细胞术检测的免疫细胞分离方法。...

人子宫颈管样本的采集、分离及流式细胞术分析

对癌细胞蛋白质组的深入分析有助于发现新的药物靶点和诊断生物标志物。本文描述了一种实验流程，用于定量分析源自液体和实体肿瘤的癌细胞亚群中的（磷酸化）蛋白质组。该方法通过将细胞富集策略与基于定量Super-SILAC的质谱技术相结合而实现。...

源自液体和实体肿瘤的癌细胞蛋白质组的定量质谱分析

早产儿脑病包含与早产所致脑损伤相关的中枢神经系统异常. 本报告描述了一种具有临床相关性的大鼠模型 在子宫内...

利用产前缺氧缺血联合羊膜内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型

本文介绍了一种结合激光捕获显微切割与液相色谱-质谱分析的技术方案，用于在肺结核肉芽肿内对药物分布进行空间定量。该方法具有广泛适用性，可实现对组织内药物浓度的高空间分辨率定量。...

利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

了解使用超高效液相色谱-串联质谱技术比较分析生香附与醋制香附在原发性痛经大鼠模型中的代谢差异，揭示中药炮制对药效的影响机制。

使用液相色谱-串联质谱法分析原生及炮制过 Cyperi Rhizoma 样品在原发性痛经大鼠中的应用

探索更多视频