Name: 高级别浆液性卵巢癌患者来源类器官的生成和培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学习从高级别浆液性卵巢癌患者样本中生成和培养类器官的方法，用于研究新型治疗药物和预测性生物标志物。该技术可长期扩增并模拟肿瘤生理特性，为癌症研究提供理想模型。

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我们感谢 Ron Bose 医学博士、哲学博士的指导，以及 Barbara Blachut 医学博士在建立本方案过程中提供的帮助。我们还要感谢圣路易斯华盛顿大学医学院妇产科及妇科肿瘤学部、华盛顿大学院长学者项目以及生殖科学家培养项目对本研究工作的支持。

所有用于研究的人类组织标本均根据机构审查委员会批准的方案获取。下述方案在无菌的人类组织培养环境中进行。已获得人类受试者的书面知情同意。符合条件的患者需确诊或疑似诊断为卵巢癌，愿意且能够签署知情同意书，且年龄至少为18岁。在患者手术时，从同意参与的患者处获取肿瘤组织（恶性原发肿瘤或转移灶）、腹水和胸腔积液。这些标本立即运送至实验室，并按照下述方法进行处理以用于类器官的生成。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>完全类器官培养基制备
	<ol>
		<li>根据已发表文献的方法制备R-spondin 1/Noggin条件培养基7. 
		注意：R-spondin-1/Noggin 条件培养基是市售重组蛋白的一种更具成本效益的替代品。稳定分泌 R-spondin-1 和 Noggin 的 HEK293T 细胞 通过 慢病毒介导的转导载体由圣路易斯华盛顿大学医学院的Ron Bose和纽约长老会/哥伦比亚大学欧文医学中心的Anil Rustgi慷慨馈赠。8,9,10. 商业化的条件培养基可作为替代品使用（参见 材料列表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为配制完整的类器官培养基，需混合以下组分：10% R-spondin 1/Noggin 条件培养基、50 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF-10、10 ng/mL FGF2、1x B27、10 mmol/L 烟酰胺、1.25 mmol/L N乙酰半胱氨酸， 1 &#181;mol/L 前列腺素 E2, 10 &#181;mol/L SB202190、500 nmol/L A83-01 和 10 &#181;M ROCK 抑制剂（参见 材料列表. 
	&#8203;注意：培养基可储存于 4 &#176;C 最长可达3个月。该培养基改编自Hill等人的方法。11培养基的浓度与成分保持不变，仅额外添加ROCK抑制剂。</li>
	<li>制备类器官基础培养基：将 500 mL 高级配方 DMEM/F12 与 1% 青霉素-链霉素、1x 二肽 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺及 1x HEPES（10 mM）混合（参见 材料列表).</li>
</ol>
2. 从腹水和胸水中收获类器官
注意：为获得最佳类器官产量，必须尽快处理腹水和胸水。将先前分装的基底膜提取物、DNase I 和 DNase I 反应缓冲液（参见材料表）置于冰上解冻，直至内容物液化。
<ol>
	<li>在标准护理手术或操作期间，从知情同意的患者处获取腹水和胸水，并在室温下使用运输容器运送至实验室。 
	注意：所有腹水或胸水处理均应在无菌环境中进行。</li>
	<li>将 50 mL 腹水或胸水转移至 50 mL 锥形管中（所需管数取决于所获腹水体积）。在 4 °C 下以 1,650 × g 离心 5 分钟。离心后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。</li>
	<li>继续向先前离心的沉淀物中加入 50 mL 腹水或胸水，并在 4 °C 下再次以 1,650 × g 离心 5 分钟。使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。重复此步骤，直至所有腹水或胸水均处理完毕。</li>
	<li>通过混合 1,000 µL 无核酸酶水、100 µL DNase I 反应缓冲液和 10 µL DNase I，制备 100 µg/mL 的 DNase I 溶液。 
	注意：无论某些患者样本中是否存在细胞聚集体，所采用的 DNase I 处理足以制备单细胞悬液12。</li>
	<li>用 1 mL 100 µg/mL DNase I 溶液重悬每个细胞沉淀。逐滴轻柔地加入 DNase I 溶液，并将试管在室温下孵育 15 分钟。 
	注意：至少加入 1 mL DNase I 溶液。若 1 mL 不足以打散沉淀，则额外加入 1 mL。</li>
	<li>孵育后，向细胞中加入 25 mL 类器官基础培养基（步骤 1.3），轻柔颠倒混匀。然后，在 4 °C 下以 1,650 × g 离心 5 分钟。离心后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。</li>
	<li>用预热的 5 mL 1× 红细胞裂解液重悬新形成的细胞沉淀（参见材料表）。将涡旋振荡器设置为 458 × g，涡旋振荡每个锥形管中的溶液。待溶液均一后，使用血清学移液器将所有锥形管中的内容物合并至一个 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>将含有涡旋振荡后溶液的锥形管在室温下孵育 5 分钟。孵育完成后，在 4 °C 下以 1,650 × g 离心 5 分钟。 
	注意：检查沉淀。粉红色/红色沉淀表明存在红细胞，此时需要重复红细胞裂解液步骤，直至沉淀不再呈红色。</li>
	<li>离心后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。然后，用 10 mL PBS 洗涤沉淀，在 458 × g 下涡旋振荡溶液，并在 4 °C 下以 1,650 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>若形成较大的细胞沉淀，使用玻璃巴斯德吸管吸弃 PBS，并在沉淀上方加入 1 mL 类器官基础培养基（步骤 1.3）。在 458 × g 下涡旋振荡溶液，并将 300-400 µL 转移至微量离心管中。在 4 °C 下以 1,650 × g 离心微量离心管 5 分钟。 
	注意：未放入微量离心管的那部分细胞沉淀可冷冻保存以备将来使用（500 µL 细胞加入 1 mL 含 10% DMSO 的 FBS）。冷冻的细胞沉淀可在 −80 °C 下保存数周，若置于液氮中则可保存数年13。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃类器官基础培养基（步骤 1.3），并使用预冷的枪头在 BME 中重悬细胞（参见材料表）。 
	注意：BME 的用量取决于沉淀的大小。建议使用 25% 的类器官基础培养基（步骤 1.3）与重悬细胞混合，再加入 75% 的 BME。</li>
	<li>将重悬的细胞溶液以 40 µL 等分试样铺于 6 孔板中。每孔最多可铺五个等分试样（图 1）。</li>
	<li>立即将培养板置于 37 °C 培养箱中 20 分钟，使 BME 凝固。孵育后，向每孔轻柔加入 2 mL 完全类器官培养基（步骤 1.2）。</li>
</ol>
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig01.jpg" /> 
图 1：患者来源卵巢癌类器官的铺板。 类器官铺板的代表性图像。小心铺板类器官混合物等分试样，确保不产生气泡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的更大版本。</a>
3. 从组织中收获类器官
注意：必须尽快处理组织以获得最佳的类器官产量。
<ol>
	<li>收集肿瘤组织，置于装有 PBS 的运输容器中冰上转运。</li>
	<li>将样本置于 10 cm 组织培养皿中（图 2）。使用一次性手术刀将组织切碎。接着，使用一次性注射器的钝端碾压组织，直至形成均质混合物。</li>
	<li>使用镊子将均质化的组织混合物移入解离管中。每 1-2 mL 均质化组织，加入 7-8 mL 器官样基础培养基（步骤 1.3）配制的 1 mg/mL II 型胶原酶溶液（参见材料表）以及 1 mL DNase I 溶液。以 458 x g 的转速涡旋溶液。 
	注：组织量将决定所需胶原酶溶液的体积及解离管数量。</li>
	<li>使用解离仪（参见材料表）在胶原酶溶液中液化组织。运行程序 37C_h_TDK3（1 小时），直至形成单细胞悬液。 
	注：若所得混合物不均一（即混合物中仍存在组织块），则需要重新运行该程序。若组织已消化但溶液粘稠，可使用器官样基础培养基（步骤 1.3）进行稀释。</li>
	<li>将均质化混合物转移至新的 50 mL 锥形管中，加入 20-40 mL 器官样基础培养基（步骤 1.3）。然后，将溶液通过 100 µm 细胞筛网过滤至新标记的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>将过滤后的混合物在 4 °C 下以 1,650 x g 离心 5 分钟。随后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。</li>
	<li>通过混合 1,000 µL 无核酸酶水、100 µL DNase I 反应缓冲液及 10 µL DNase I，配制 100 µg/mL DNase I 溶液。 
	注：无论某些患者样本中是否存在细胞聚集体，所采用的 DNase I 处理足以制备单细胞悬液12。</li>
	<li>用 1 mL 100 µg/mL DNase I 溶液重悬细胞。逐滴轻柔加入 DNase I 溶液，并将试管在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>孵育后，向细胞中加入 25 mL 器官样基础培养基（步骤 1.3），轻柔颠倒混匀。随后，在 4 °C 下以 1,650 x g 离心 5 分钟。离心后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。</li>
	<li>用 5 mL 预热的 1x 红细胞裂解液重悬新形成的细胞沉淀。以 458 x g 的转速涡旋每个锥形管中的溶液。</li>
	<li>将含有重悬于红细胞裂解液中的细胞沉淀的锥形管孵育 5 分钟。孵育完成后，在 4 °C 下以 1,650 x g 离心 5 分钟。 
	注：检查沉淀。粉红色/红色沉淀表明存在红细胞，此时需要重复红细胞裂解液步骤，直至沉淀呈现白色。</li>
	<li>离心后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。随后，用 10 mL PBS 洗涤沉淀，以 458 x g 的转速涡旋溶液，并在 4 °C 下以 1,650 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>若形成较大的细胞沉淀，使用玻璃巴斯德吸管吸弃 PBS，并在沉淀上方加入 1 mL 器官样基础培养基（步骤 1.3）。以 458 x g 的转速涡旋溶液，并转移 300-400 µL 至微量离心管中。在 4 °C 下以 1,650 x g 离心 5 分钟。 
	注：未放入微量离心管的部分细胞沉淀可冷冻保存以备将来使用（500 µL 细胞加入 1 mL 含 10% DMSO 的 FBS）（步骤 5.1）。冷冻的细胞沉淀可在 −80 °C 保存数周，若置于液氮中则可保存数年13。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃器官样基础培养基，并使用预冷的枪头以 BME 重悬细胞。 
	注：BME 的用量取决于沉淀大小。建议将含有重悬细胞的 25% 器官样基础培养基（步骤 1.3）与 75% BME 混合。</li>
	<li>将重悬的细胞溶液以 40 µL 等份接种至 6 孔板中。每孔最多接种五份等份液。</li>
	<li>立即将孔板放入培养箱中孵育 20 分钟。孵育后，向每孔轻柔加入 2 mL 完全器官样培养基（步骤 1.2）。</li>
</ol>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig02v2.jpg" /> 
图 2：解剖前的肿瘤组织。 用于类器官生成的肿瘤组织代表性图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的更大版本。</a>
4. 类器官传代
注意：如果样本已长满，每个类器官孔每周可传代至两个新孔。
<ol>
	<li>使用 1 mL 移液器，向每个孔中加入 1 mL 类器官基础培养基（步骤 1.3），并直接在类器官组织块上反复吹吸培养基以使其解离。将所有含有重悬沉淀的培养基收集到一个 15 mL 锥形管中。</li>
	<li>将含有混合物的 15 mL 锥形管在 4 °C 下以 1,650 × g 离心 5 分钟。然后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 1 mL 无动物源重组酶（参见材料表），在 458 × g 下涡旋溶液，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。将管子置于 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。</li>
	<li>孵育后，在 4 °C 下以 1,650 × g 离心 5 分钟。然后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸弃上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于基底膜提取物中。 
	注意：基底膜提取物的用量取决于沉淀的大小。建议将含有重悬细胞的 25% 类器官基础培养基（步骤 1.3）与 75% 基底膜提取物混合使用。</li>
	<li>将重悬的细胞溶液以 40 µL 等分试样铺板到 6 孔板中。每孔最多可铺五个等分试样。所有等分试样铺板后，立即将培养板放入培养箱中孵育 20 分钟。孵育后，向每孔中轻轻加入 2 mL 完全类器官培养基（步骤 1.2）。</li>
</ol>
5. 类器官的冻存与复苏
<ol>
	<li>类器官的冻存
	<ol>
		<li>从步骤 4.1-4.4 开始。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 0.5-1 mL 复苏细胞培养冻存培养基（参见材料表），并将 1 mL 转移至每个冻存管。</li>
		<li>然后，将冻存管置于装有异丙醇的容器中，在 −80 °C 下保存最多 2 周，之后转移至液氮罐进行长期储存13。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官的复苏
	<ol>
		<li>从液氮罐中取出样品，在 37 °C 水浴中解冻。</li>
		<li>解冻后，转移至 15 mL 锥形管中，在 4 °C 下以 1,650 x g 离心 5 分钟。离心后，使用玻璃巴斯德吸管小心吸除上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于 BME 中。 
		注意：BME 的用量取决于沉淀的大小。建议将含有重悬细胞的 25% 类器官基础培养基（步骤 1.3）与 75% BME 混合。</li>
		<li>将重悬的细胞溶液以 40 µL 等分试样铺板到 6 孔板中。每孔最多放置五个等分试样。</li>
		<li>立即将培养板放入培养箱中孵育 20 分钟。孵育后，向孔中轻柔加入 2 mL 完全类器官培养基（步骤 1.2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 包埋与制备福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 切片以评估类器官组成
<ol>
	<li>类器官培养至少10天以确保尺寸足够后，从孔中移除完全类器官培养基，并加入1 mL 2%多聚甲醛固定液。室温孵育5-10分钟。</li>
	<li>孵育后，用1 mL PBS将培养的类器官等分样品洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>从每个孔中移除PBS，并向每个孔中加入1 mL温热的2%琼脂糖（溶于去离子H2O）。添加琼脂糖时，用刮刀将培养的类器官等分样品从培养板中挑起。 
	注意：务必注意勿让琼脂糖在挑起培养的类器官等分样品前凝固。
	<ol>
		<li>让琼脂糖在孔中室温凝固。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用小刮刀，将凝固的琼脂糖从孔中取出，并置于组织盒中，在4°C的70%乙醇中保存最多48小时（参见材料表），以待后续处理14。</li>
	<li>将样品包埋于石蜡中15，将切片厚度切至5 µm，并使用标准方案15对切片进行苏木精和伊红（H&#38;E，参见材料表）染色。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

卵巢癌由于在诊断时通常已处于晚期，且常出现化疗耐药，因此致死率极高。尽管研究人员通过使用癌细胞系和PDX模型在卵巢癌研究中取得了诸多进展，但仍明显缺乏更具代表性且成本较低的模型 体外 模型。PDOs 已被证实能够准确代表其原发肿瘤的肿瘤异质性、肿瘤微环境以及基因组和转录组特征，因此是多种研究方法的理想临床前模型，例如将类器官模型应用于药物治疗研究。16.
本文所述方案非常有效且可靠，成功率达到97%。需要特别指出的是，本方案中存在若干关键步骤，需格外注意。首先，在从组织中收获类器官时，必须确保样品完全均质化；必要时可多次运行解离程序。如果样品不均匀，残留的组织碎片可能会影响类器官的生长。其次，由于基底膜提取物（BME）的工作温度为2–8 °C，因此所有涉及该试剂的操作均需在冰上进行，以防止其发生聚合。此外，在用BME重悬和铺板时，必须避免产生气泡，否则会导致铺好的类器官分装物不稳定，从而从培养板上脱落。最后，本方案中使用的BME来源于Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肿瘤，因此不同批次之间可能存在成...

2021年，美国约有21,410名女性新被诊断为上皮性卵巢癌，其中12,940名女性死于该疾病1。尽管在外科手术和化疗方面已取得一定进展，但超过70%的晚期患者会出现化疗耐药，并在确诊后5年内死亡2,3。因此，迫切需要开发治疗这种致命疾病的新策略，以及适用于临床前研究的代表性且可靠的模型。
来源于原发性卵巢肿瘤的癌细胞系和患者来源的异种移植模型（PDX）是卵巢癌研究中使用的主要工具。癌细胞系的主要优势在于其可快速扩增。然而，长期培养会导致其表型和基因型发生改变，从而使癌细胞系偏离原始的原发性肿瘤样本。由于癌细胞系与原发性肿瘤之间存在差异，在细胞系中显示有效果的药物试验往往在临床试验中无法取得相同的效果2。为了克服这些局限性，研究人员采用PDX模型。这些模型通过将新鲜的卵巢癌组织植入免疫缺陷小鼠体内而建立。由于属于in vivo模型，它们能更准确地模拟人类生物学特征，因而对药物疗效的预测性也更强。然而，这些模型也存在显著的局限性，包括构建过程所需的成本、时间和资源4。
PDOs 为临床前研究提供了一种替代模型，克服了肿瘤细胞系和PDX模型的局限性。PDOs 能够重现患者的肿瘤及其肿瘤微环境，从而提供一种 体外 适用于临床前研究的可操作模型2,3,5这些三维模型具有自我组织能力，能够模拟原发性肿瘤，这是其二维（2D）细胞系所不具备的特征。此外，研究表明这些模型在基因和功能上均能真实反映其来源肿瘤，因此是研究新型治疗手段和生物学过程的可靠模型。简而言之，它们既具备类似于细胞系的长期扩增和保存能力，又包含了小鼠模型中固有的微环境和细胞间相互作用。4,6.
本方案描述了从患者来源的肿瘤、腹水和胸腔积液样本中建立类器官（PDO）的方法，成功率超过97%。所获得的PDO培养物可长期传代扩增，并用于药物治疗敏感性及预测性生物标志物的检测。该方法代表了一种可根据PDO的治疗反应实现个体化治疗的潜在技术。

<table><tbody><tr><td>1% HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1% 青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>30002CI</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>14125</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿&amp;nbsp;</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞滤膜</td><td>MidSci</td><td>100ICS</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 冻存管</td><td>Simport Scientific</td><td>T301-2</td><td></td></tr><tr><td>2% 多聚甲醛固定液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴箱&amp;nbsp;</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>3dGRO R-脊椎蛋白-1 条件培养基补充剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCM104</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R31541GA</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM/F12 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Lamda Biotech</td><td>C121</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Type 2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3533-010-02</td><td>基底膜提取物</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Bio Labs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 反应缓冲液</td><td>New England Bio Labs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 管</td><td>Miltenyi BioTech</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>带加热模块的 gentleMACS Octo 组织解离器</td><td>Miltenyi BioTech</td><td>130-096-427</td><td>我们使用厂商提供的操作方案。</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>二肽，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>苏木精和伊红染色试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1470670</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast 石蜡</td><td>Fisher Scientific</td><td>22900700</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冻存容器</td><td>Fisher Scientific</td><td>07202363S</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>p1000 移液器及吸头&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 移液器及吸头&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; 帕斯特移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21031CM</td><td></td></tr><tr><td>移液控制器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>前列腺素 E2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 Noggin 蛋白</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recovery 无血清细胞冻存液</td><td>Invitrogen</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 (Y-27632)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养超净台&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>无动物来源，重组酶</td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高级别浆液性卵巢癌患者来源类器官的建立与培养

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

类器官是一种三维动态肿瘤模型，可成功地从患者来源的卵巢肿瘤组织、腹水或胸腔积液中培养获得，有助于发现卵巢癌的新疗法和预测性生物标志物。这些模型能够重现克隆异质性、肿瘤微环境以及细胞间和细胞-基质间的相互作用。此外，研究已表明，类器官在形态学、细胞学、免疫组织化学和遗传学特征上均与原发性肿瘤相匹配。因此，类器官为肿瘤细胞及肿瘤微环境的研究提供了有力工具，优于传统的细胞系模型。本实验方案描述了从患者肿瘤组织、腹水和胸腔积液样本中建立患者来源性卵巢癌类器官的多种方法，成功率超过97%。患者样本通过机械和酶消化方法分离为单细胞悬液，随后将细胞接种于基底膜提取物（BME）中，并使用含有特定补充成分的优化培养基进行培养，以支持高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）类器官的生长。在初始类器官形成后，这些患者来源性类器官（PDOs）可实现长期培养，并可通过传代扩增用于后续实验。

为生成患者来源类器官，样本经机械与酶消化处理为单细胞悬液。随后将细胞重悬于基底膜提取物中，并补充特定配制的培养基。图 3）。类器官的建立通常需要10天时间，此后培养体系中可观察到离散的类器官结构。图 4).
<img alt="图 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig03.jpg" /> 
图 3患者样本构建为类器官的示意图。 患者组织、腹水或胸腔积液通过机械或酶消化处理。随后将单细胞悬液接种于基底膜提取物中，在针对高级别浆液性卵巢癌定制的专用生长培养基支持下进行培养增殖。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig03la...

患者来源的类器官（PDO）是一种三维（3D）培养体系，可在体外模拟肿瘤微环境。in vitro。在高级别浆液性卵巢癌中，PDO 为研究新型生物标志物和治疗手段提供了一种模型。

类器官是由患者来源的卵巢肿瘤组织、腹水或胸腔积液成功培养而成的三维动态肿瘤模型，有助于……

患者来源的类器官模型在基因和功能上均能准确代表其原发肿瘤，因此是研究卵巢癌中新型治疗方法和复杂生物学过程的可靠模型。通过重现克隆异质性、肿瘤微环境以及体外细胞间的相互作用，这些模型克服了传统癌细胞系和患者来源异种移植模型的局限性。患者来源的类器官具有长期扩增和保存的能力，并能模拟肿瘤的生理特性。因此，它们是研究新型治疗手段和预测性生物标志物的理想模型。通过将肿瘤样本置于10厘米的组织培养皿中，并使用一次性手术刀将组织切碎以制成均匀的混合物，开始类器官的收获。使用镊子将均匀的组织混合物放入解离管中。每1至2毫升匀浆组织，加入7至8毫升含有1毫克/毫升II型胶原酶的类器官基础培养基溶液，以及1毫升DNase I溶液。将溶液在458 ×g条件下涡旋震荡。在胶原酶溶液中使用解离仪对组织进行液化处理。运行程序37 C_H_TDK_3_1小时，直至形成单细胞悬液。操作完成后，将匀浆后的混合物转移至一个新的50毫升锥形管中。加入20至40毫升类器官基础培养基，在458 G条件下涡旋振荡溶液。随后，将溶液通过100微米细胞滤网过滤至新标记的50毫升锥形管中。接着，在4摄氏度条件下以1,650 G离心过滤后的混合物5分钟，并使用玻璃巴氏德吸管吸除上清液。配制浓度为每毫升100微克的DNase One，通过逐滴加入DNase One溶液，将细胞重悬于1毫升DNase One溶液中。室温孵育15分钟后，向细胞中加入25毫升类器官基础培养基，并轻轻颠倒混匀。随后在4摄氏度、1,650 ×g条件下离心5分钟，使用玻璃移液管小心吸除上清液。将新形成的细胞沉淀重悬于5毫升预热的红细胞（RBC）裂解缓冲液中。在每个锥形管中以458 ×g涡旋振荡溶液，并孵育5分钟。再次将悬浮于红细胞裂解缓冲液中的沉淀离心，并使用玻璃巴斯德吸管吸除上清液。用10毫升PBS洗涤沉淀，并在离心前涡旋混匀细胞。对于较大的细胞沉淀，吸除PBS，然后在沉淀上加入1毫升类器官基础培养基。涡旋混匀溶液后，将300至400微升细胞悬液转移至微量离心管中。离心5分钟后，吸除上清液，并使用预冷的枪头将沉淀重悬于基底膜提取物（BME）和类器官基础培养基中。将重悬的细胞悬液以每份40微升分装至六孔板中，每孔最多可分装五份。将培养板立即放入培养箱中孵育20分钟。孵育结束后，轻轻向每个孔中加入2毫升完全类器官培养基。向每个孔中加入1毫升类器官基础培养基，用移液器将培养基直接在类器官团块上反复吹打以进行解离。收集含有重悬类器官团块的全部培养基至15毫升锥形管中。然后，将含有混合物的15毫升锥形管离心5分钟，随后吸除上清液。向细胞沉淀中加入1毫升无动物来源的重组酶，涡旋混匀后将悬液转移至1.5毫升微量离心管中。在37摄氏度水浴中孵育15分钟，并离心5分钟后，吸除上清液。将沉淀物重悬于BME和类器官基础培养基中，并将重悬的细胞溶液以每份40

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癌症研究

高级别浆液性卵巢癌患者来源类器官的生成和培养

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本文提供了一种从患者来源的乳腺肿瘤切除组织或正常乳腺组织建立人乳腺类器官的详细方案。该方案提供了培养、冻存和复苏人源性乳腺类器官的全面分步操作指南。...

建立和培养患者来源的乳腺类器官

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探究卵巢微环境：小鼠卵巢体细胞的分离、二维培养及类器官培养方法

为了实现对播散性人结直肠癌（CRC）细胞在组织中定植的高灵敏度检测，本文展示了一种在将PDX来源的CRC类器官细胞注射到受体小鼠之前，高效转导绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒颗粒的方案，并通过立体荧光显微镜进行观察。...

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一种黑色素瘤患者来源的异种移植模型

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