斑 旸 （香蒲）的栽培和微生物生物增强的优化方法

我们的工作解决了缺乏从种子种植香蒲的相关规范问题。我们开发了可重复的种子发芽、早期生长和微生物生物增强方法，以支持未来的植物微生物研究。很少有研究从种子开始种植蒲草或追踪其成熟，但蒲草在湿地修复研究中被广泛使用。

大多数香蒲研究涉及购买根茎用于实验室繁殖。很少有研究从种子种植香蒲，没有标准化的方法。实现引入微生物的稳定发芽和持续定殖一直是一大挑战。

我们开发了可重复的种子发芽和微生物生物增强方法，展示了早期接种如何支持长期定植。首先，使用园艺剪刀将一株Typha latifolia植物的茎部剪断，距离花序基部约两厘米。将种子从花序上取下，将种子转移到实验室搅拌机中，直到搅拌机约有四分之一的容量，即约250毫升未压实的种子。

现在将500毫升自来水注入搅拌机，确保保持10厘米的缸盖间隙。以中低速搅拌混合物20秒，然后立即将粘稠内容物转移到一升烧杯中。将大约100毫升的种子水混合物重新倒入搅拌机。

然后加入400到600毫升新鲜自来水，在中高速下搅拌20秒。把里面的液体倒进一个新的一升烧杯里。现在用自来水装满烧杯，水量最高达800毫升。

静置60秒后，从顶部舀起漂浮的泥泥，不扰动底部沉积的种子。慢慢倒出剩余水，将种子转移到100毫升的烧杯中。对剩余的种子水泥重复搅拌过程。接着将装有分离种子的烧杯放在搅拌盘上。

搅拌后，舀起烧杯表面上漂浮的植物残渣。将种子倒入带有滤纸的布赫纳漏斗中，吸尘器中放置，晾干一夜。将干燥种子存放在50毫升的锥形聚丙烯管中，温度为20摄氏度。

准备半浓度的村重和斯库格介质板，并加入1%植物琼脂。将大约一毫克的干种子转移到一个15毫升的锥形聚丙烯管中。然后往管子里加入10毫升无菌双蒸馏水。

将发射管放置在轨道摇臂上，以中高速运行10分钟。现在将管子中的水取出，加入5毫升0.1%聚山梨酸酯20号溶液，该溶液在无菌双蒸馏水中制成。以中高速摇晃管子10分钟。

去除聚山梨酯20号溶液。所有后续步骤均在火焰罩或层流罩前完成。用5毫升30%商用漂白剂和0.025%聚山梨酸酯20溶液，在无菌双蒸馏水中制备溶液替代溶液。

用无菌的双重蒸馏水替换上清液。然后以中高速摇晃管子五分钟。第三次冲洗后，低速旋转管子24小时以诱发发芽。

第二天，去除多余的水分，并确保管内留有三毫升液体。现在，用无菌方式切断一个1000微升塑料移液器吸头的尖端。用剪好的移液器头用力移液，并将种子悬浮在吸头内。

将种子和液体装在半浓度的Murashige和Skoog琼脂培养皿上。轻轻旋转盘子，均匀分布种子。用实验室密封膜包裹这些培养板，然后放入一个16小时光照和8小时暗夜循环的生长室，温度为23摄氏度，湿度为70%。

要给香蒲种子接种，如图所示，使用聚山梨酯20漂白剂和双倍蒸馏水消毒种子。测量600纳米隔夜培养的黄尾藻分离物的光学密度。通过在培养基中稀释，将菌株归一化为1.0的吸收值。

现在用9,300克离心机离心1毫升培养液，离心两分钟。去除上清液，将沉淀液重新注入一毫升PBS中。离心并再次去除上清液后，将细菌沉淀重新悬浮在一毫升无菌双蒸馏水中。

使用灭菌种子，然后在同一管中稀释接种剂，稀释度为0.025%有机硅面活性剂。在种子发芽前，以低速摇晃悬浮液24小时。首先，在无菌植物生长室中填充一种预先用自来水浸湿的土壤。

用铝箔覆盖Luer锁头，用液循环高压灭菌器20分钟。接着，在无菌条件下，将0.2微米的滤芯连接到生长室的Luer锁连接器上。打开箱子，向土壤中添加500微升消毒后的1%20乘20×20肥料。

用无菌刮刀混合土壤，同时加入无菌双蒸馏水，以保持水分，同时避免土壤过饱和。现在，用无菌剃须刀片将含有一株脆弱老幼苗的木板上，将村重和斯库格琼脂切成四份。用无菌刮刀将一块带幼苗的琼脂切片转移到生长室的预备土壤中。

将生长室转移到植物生长孵化器，该培养箱设定为16小时光照和8小时暗夜循环，温度23摄氏度，湿度70%。完全剥离的种子部分可见分离，而不完全剥离则喙部附着，未被剥离的种子保持完整。无菌水培系统已被证明支持香蒲和Juncus物种的生长，这里图像中称为Juncus，它们在无菌系统内被维持长达一年。

使用30%漂白剂和聚山梨酯20方法观察到的最高种子发芽率为20.8%，显著高于除1小时氯气法外的所有其他灭菌方法，后者未能实现完全的种子灭菌。在疤痕化后七天，发芽的Typha幼苗在非无菌的Petri板环境中出现了可见的自由基和枝条组织。移植到土壤后，Typha的部分幼苗在一到两周内成功建立并产生新芽组织。

接种携带DsRed质粒的Luteimonas属后，接种后16天观察到红荧光细菌在整个Typha幼苗根部定殖。