拟南芥种子表面灭菌的高通量、稳健性和高时间灵活性方法

该协议改善了种子表面灭菌，这是拟南芥模型物种功能基因组学的基本步骤。该技术的主要优点是简单易用且通量高，每天可处理数百个样品。通过一些简单的修改，这种方法可以应用于许多其他模型和非模型植物物种。

对于首次使用的用户，请注意培养基的温度和离心速度，因为它们对种子存活都至关重要。首先，通过将95%工业乙醇加入蒸馏水中并充分混合来制备70%乙醇。接下来，通过将5毫升家用漂白剂加入95毫升无菌蒸馏水中来制备5%漂白剂溶液。

然后，在漂白剂溶液中加入几滴非离子洗涤剂，并充分混合。接下来，通过在800毫升蒸馏水中加入2.2克MS培养基粉末（包括维生素和10克蔗糖）来制备半强度的Murashige和Skoog培养基。使用一摩尔氢氧化钾将培养基的pH值调节至5.7，然后使用蒸馏水将体积调高至一升。

将500毫升培养基等分到一升瓶中，并加入四克琼脂以制备固体培养基。高压灭菌后，让培养基在水浴中冷却至50至53摄氏度。然后将其倒入层流罩下的培养皿中。

要制备选择性培养基，将卡那霉素加入培养基中，并如前所述将其倒入培养皿中。要设置吸气器，请将真空泵入口连接到合适尺寸的聚乙烯管的一端。然后将管的另一端连接到倾析瓶双向盖的出口。

用密封膜紧紧包裹管道的连接处，以确保气密连接。接下来，将第二个聚乙烯管连接到倾析瓶上螺旋盖的入口。然后将管子的另一侧连接到装有薄聚乙烯管的水族箱阀的出口。

如有必要，用密封膜包裹连接处，以消除漏气。在用渐进式数字标记两批48个1.5毫升微量离心管后，将100至200个拟南芥种子添加到96个无菌微量离心管中的每一个中，大约在管锥形末端的底部上方一到两毫米。接下来，使用10毫升无菌血清学移液器，向每个管中加入约1毫升70%乙醇，并小心地合上盖子。

在振荡器中以八赫兹的振荡频率摇动管三分钟。然后从摇摇杯中取出适配器，并将其转移到台式微量离心机的篮子中，以使用脉冲功能旋转种子。将管子转移到机架后，打开层流罩下的所有管子。

请勿触摸盖子中适合管子的部分，以免污染。然后，在层流罩下，将无菌的200微升黄色尖端安装到自制吸气器的水族箱阀门入口处，然后打开泵。将尖端插入种子水平上方，以避免在吸吮液体时接触种子。

接下来，使用10毫升无菌血清学移液管，将一毫升5%漂白剂溶液等分到每个管中。在将管子放回摇摇杯适配器之前，请先盖上盖子，然后如前所述摇动管子。使用台式离心机的脉冲功能旋转种子后，将新的无菌200微升黄色尖端安装到水族箱阀上，然后打开泵。

将尖端插入种子水平上方，以避免在吸入漂白剂溶液时接触种子。接下来，使用10毫升无菌血清学移液管，将一毫升无菌水等分到每个管中。将新的无菌200微升黄色尖端安装到水族箱阀门上后，打开泵。

将尖端插入种子水平上方，以避免在吸水时接触种子。最后，将500微升无菌水等分到每个管中，并关闭层流罩中的所有盖子。种子现在已经准备好播种了。

如果需要，将管子保持在室温下长达几个小时或四摄氏度过夜。使用一毫升移液器，将种子与300至400微升无菌水转移到培养皿中。转移10管后，将1.5至2毫升融化的半强度Murashige和Skoog培养基（不含抗生素）倒入每个板中。

快速旋转板以分配种子，并将板粘在相对的两侧。用塑料或铝箔包裹盘子，并在黑暗中将其放入冰箱中三天，以获得均匀发芽。在第二天、第三天、第四天和第七天进行的发芽分析表明，用70%乙醇灭菌10至40分钟之间没有显着差异。

然而，当灭菌时间超过40分钟时，发芽率下降。相应地，绿色子叶的出现率也有所下降。根据该研究，选择3分钟用于70%乙醇和3分钟用于5%漂白剂作为灭菌种子的最短时间。

为了证明最初使用的种子被微生物污染，将非无菌种子直接播种在盘子上。与无菌种子相比，非无菌种子在两天后显示出真菌外观，在发芽七天后扩散到整个盘子上。使用单个无菌移液器尖端处理不同种子样品的交叉污染测定表明，在用卡那霉素播种的Columbia-0基因型种子中未观察到绿色子叶。

同时，在Columbia-0种子中播种在没有卡那霉素的盘子中，所有子叶在发芽后都呈现绿色。这些结果表明，尽管使用单个移液器吸头去除无菌溶液，但样品之间没有残留的污染物。该程序是许多其他功能基因组学方法的基础，如基因过表达，基因组编辑，亚细胞定位，启动子活性以及蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - DNA相互作用。