在 体外调整基于活性肌动蛋白组装体的收缩性和变形模式：从二维活性网络到液晶滴
July 11th, 2025
在这里，我们提出了从纯化蛋白质制备准二维 （2D） 纠缠、交联和液晶肌动蛋白组装体的方法。
本研究聚焦于软质生物材料，旨在探索调节形状和组织的潜在物理机制以及受生物细胞启发的材料。
生物和体外模型系统本质上很复杂，存在许多陷阱，样品制备对于其可重复性至关重要。该协议旨在提高这些系统的可重复性。
这些结果为检测、表征机制以及理解物理力和生物材料的功能铺平了道路。这可以推广到各种生物聚合物和细胞器。
[旁白]首先，通过在微量离心管中加入5微升10XF缓冲液来准备要上样的样品，并加入一定体积的去离子蒸馏水，使添加剩余成分后最终样品体积为50微升。将一微升 25% β-巯基乙醇、一微升 225 毫克/毫升葡萄糖、一微升葡萄糖氧化酶混合物和 85,000 单位/毫升催化剂移入溶液中。然后加入一微升25毫摩尔ATP和10微升2%、15厘泊甲基纤维素，并通过移液充分混合。要开始肌动蛋白聚合，请将未标记的肌动蛋白与标记的肌动蛋白混合，并将肌动蛋白混合物添加到制备的 F 缓冲溶液中。上下移液溶液以确保正确混合。让肌动蛋白在室温下在微量离心管中聚合。接下来，要制备流通池，请在显微镜载玻片的宽度上放置两条彼此平行的双面胶带，以形成流通池通道的边界。将盖玻片放在胶带通道上，确保其垂直于显微镜载玻片。按下与双面胶接触的盖玻片区域，以形成良好的密封并消除气穴。使用剃须刀片，从显微镜载玻片和盖玻片上修剪掉多余的胶带，使唯一可见的胶带位于样品通道内。要为两个去刨样品准备一个圆筒样品室，首先用乙醇、水和乙醇冲洗盖玻片。用过滤空气干燥。涂上一层薄薄的五分钟环氧树脂，将玻璃克隆圆柱体粘附到盖玻片上。将 3.5 微升油表面活性剂溶液加入透明或浅色微量离心管中。在不混合的情况下，将五微升肌动蛋白溶液移液到油表面活性剂层的顶部。关闭管子。握住微量离心管的顶部，轻弹底部边缘，形成带有可见乳液的初始泡沫，并继续轻弹，直到形成均匀的微乳液。在加载流通池之前，混合少量五分钟环氧树脂。要加载流通池，请将一到三微升油表面活性剂溶液移液到流通池的样品通道中，以形成一个润湿通道的小塞子。在添加样品之前，倾斜流通池以去除由于油表面活性剂弯月面后退而形成的任何气隙。立即将样品溶液乳液悬浮液移入流通池的入口以填充通道。用五分钟环氧树脂密封流通池通道的每一侧。要装入非乳液样品的圆筒样品室，请将 5 微升油表面活性剂溶液移液到玻璃圆筒室的底部。倾斜并缓慢旋转盖玻片，以在表面和下筒体上涂上表面活性剂溶液。使用移液器去除多余的油表面活性剂溶液，以获得薄层，同时防止油完全蒸发。立即将样品溶液添加到腔室中。用一小块聚四氟乙烯或 PTFE 胶带覆盖腔室，以防止蒸发和流动。将样品安装到显微镜载物台上。使用 20 倍、40 倍、60 倍或 100 倍物镜开始对肌动蛋白进行延时成像，并浸入油浸或水浸，以确保足够高的数值孔径以进行高分辨率成像。如果在样品室中聚合，请让其聚合约 30 分钟或直到没有可见的灯丝延长或运动。向样品中添加交联剂，然后通过缓慢地将总体积的大约一半移液到样品中，将肌球蛋白作为预聚合丝加入样品中。最后，开始延时成像。此处显示了纠缠肌动蛋白网络的代表性共聚焦荧光图像。纠缠的肌动蛋白网络均匀分布在表面。 此图像中的亮点表示细丝重叠，而深色区域表示肌动蛋白存在极少。热波动导致局部强度变化和肌动蛋白丝的可见弯曲。肌球蛋白II的加入导致肌动蛋白网络弯曲和重组，肌球蛋白点长期明显积累。网络收缩取决于肌球蛋白浓度和ATP浓度。在交联肌动蛋白网络中，与纠缠网络相比，肌球蛋白诱导的收缩导致在更长的长度尺度上协调运动。
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概述
本研究聚焦于柔性生物材料，旨在探索调控形态和组织的潜在物理机制。研究提出了从纯化蛋白质制备准二维（2D）纠缠、交联和液晶肌动蛋白组合的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物材料
- 软物质物理
- 蛋白质组装
背景
- 生物和体外模型系统复杂。
- 样品制备对于可重复性至关重要。
- 该协议旨在提高这些系统的可重复性。
- 理解物理机制对材料设计至关重要。
研究目的
- 探索调控生物材料的物理机制。
- 开发创建稳定的肌动蛋白组合的方法。
- 提高生物实验的可重复性。
使用的方法
- 准备准二维肌动蛋白组合。
- 肌动蛋白丝的交联。
- 利用液晶特性。
- 蛋白质纯化协议。
主要结果
- 成功制备2D纠缠肌动蛋白组合。
- 展示了组合过程的可重复性。
- 对组合的物理特性的洞察。
- 在仿生材料中的潜在应用。
结论
- 开发的方法可以增强柔性生物材料的研究。
- 提高可重复性可以带来更好的实验结果。
- 进一步的研究可以探索在各个领域的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reconstituted actin-based assemblies provide a controllable platform for dissecting the physical mechanisms underlying cellular contractility and deformation, which are central to cytoskeletal target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The ability to tune contractility and deformation modes in vitro enables predictive evaluation of cytoskeletal modulators and supports translational continuity from discovery to preclinical model development. These assemblies offer a reproducible system for quantitative analysis of force generation and shape regulation relevant to biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cytoskeletal force generation and shape regulation mechanisms.
- Supports functional target validation for actin-myosin interactions and crosslinker effects.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating physical drivers of contractility.
- Provides a quantitative platform for hypothesis testing in cytoskeletal biology.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible actin network systems for compound screening targeting cytoskeletal dynamics.
- Enables standardization of contractility and deformation assays for quantitative readouts.
- Supports scalability and platform reuse for screening modulators of actin-myosin function.
- Delivers robust, quantifiable outputs for comparative evaluation of candidate molecules.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro contractility measurements with disease-relevant cytoskeletal phenotypes.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical model validation of cytoskeletal targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative force and deformation metrics.
- Supports translational biomarker development for cytoskeletal modulation.
Pipeline & Workflow Integration
These actin-based assemblies integrate into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation, supporting both target validation and predictive analytics for cytoskeletal drug discovery.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification for actin-myosin contractility.
- Screening: Provides standardized, reproducible assay systems for quantitative contractility and deformation measurements.
- Analytics: Enables quantitative comparison of network contraction, filament sliding, and buckling under defined conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights to preclinical models of cytoskeletal dysfunction.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, reusable platform for diverse cytoskeletal research and screening needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cytoskeletal target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of actin-based assays across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistically grounded outputs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cytoskeletal targets and candidate molecules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, actin polymerization, and fluorescence microscopy.
- Demands access to high-resolution imaging and quantitative analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous sample preparation protocols for reproducibility across experiments.
- Adaptation to other cytoskeletal or biopolymer systems may require protocol optimization.
- Practical limitations include sensitivity to buffer conditions and protein quality.
