Name: 在 体外调整基于活性肌动蛋白组装体的收缩性和变形模式：从二维活性网络到液晶滴 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T16:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 了解准二维肌动蛋白组装体的制备方法，用于探索软生物材料的物理机制与形状调控。该方案通过交联和液晶特性提高实验可重复性，为生物仿生材料研究提供新途径。

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在开发本方法的过程中，我们感谢 Todd Thorenson、Mike Murrell、Jennifer Ross、Patrick McCall 以及芝加哥大学 Gardel 实验室和 Kovar 实验室的其他成员提供的有益讨论。M.A.C. 和 S.R. 的研究部分得到了克莱姆森大学工程与计算应用科学学院本科生研究机会资助项目的支持；V. J. A. 的研究得到了美国国家科学基金会（NSF）资助项目 #2349368（由 DBI 和 EPSCoR 项目资助）支持的克莱姆森大学生物物理学本科生研究体验项目（REU）的支持。本研究还部分得到了美国国家科学基金会 EPSCoR 项目资助 #OIA-1655740 以及克莱姆森大学创新探究与本科生研究项目的支持。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

要获得可重复的肌动蛋白组装结果，有许多因素需要考虑。其中，对获得可重复且可分析的数据最为关键的因素之一是样品腔的盖玻片表面。样品腔中的蛋白质在 体外 肌动蛋白样品，尤其是肌球蛋白，具有极强的黏附性，会黏附于未经处理或处理不当的玻璃表面，导致样品无法使用（图 5A）。我们讨论了一种标准的表面处理方法，即通过在硅烷化盖玻片上添加油-表面活性剂层进行钝化，以获得可重复的样品。然而，该样品制备方法可根据可用资源进行多种调整。样品可制备在未经紫外/臭氧处理的硅烷化盖玻片上，或使用普通玻璃盖玻片并添加油-表面活性剂层（样品池选项#2）。这些方法制备过程更简便，但可能导致样品的油表面不均匀图5B），这可能导致难以找到样品中较大且平坦的区域进行分析。所述的聚四氟乙烯（PTFE）掩膜/紫外/臭氧法可减轻这一问题，从而获得一个中心具有较大平面区域的半球形表面。必须去除过量的表面活性剂，以尽量减少意外形成乳液的可能性图5C). 支持性脂双层通常会比此处所述的表面活...

<a href="https://app.jove.com/t/6643">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68127">10.3791/68127</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68127">Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops</a>. The Affiliations&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops

活性生物材料在多种生理过程中起着关键作用，包括细胞内运输、细胞迁移、细胞形态调控以及生物力的产生1,2,3。体外构建的细胞骨架系统由纯化并经过工程改造的蛋白质组分在缓冲液中自组装而成，是表征基本生物物理和生化过程的成熟工具4,5,6,7。这些简化的模型系统使研究人员能够在排除细胞环境复杂性的条件下研究蛋白质，从而明确各个组分的功能。除了支持基础生物学研究外，体外细胞骨架组装系统也被广泛开发为实验平台，用于研究液晶态材料以及活性或非平衡态材料8,9,10,11,12,13,14,15。
肌动蛋白是一种关键的生物聚合物，通过分子马达和聚合驱动的力来调控细胞力学和动态过程3,16。荧光显微镜实验能够可视化肌动蛋白网络在分子马达驱动收缩以及交联蛋白介导的肌动蛋白束化等过程中的结构变化。对三维肌动蛋白网络在嵌入式分子马达重塑过程中的成像，揭示了肌动蛋白交联蛋白在网络收缩和模式形成中的作用12,17,18,19。然而，准二维肌动蛋白网络克服了在足够时空分辨率下成像以捕捉网络结构变化的技术挑战。此外，高密度的准二维肌动蛋白结构更接近于细胞内的组装结构，例如细胞中致密的肌动蛋白皮层20。构建准二维肌动蛋白结构的策略包括将肌动蛋白成核蛋白固定在盖玻片上21,22、通过连接分子将肌动蛋白偶联至表面10,23,24、在盖玻片表面形成附着于微珠的致密肌动蛋白束25,26，以及利用分子拥挤剂在盖玻片表面富集肌动蛋白丝10,27。
本文详细介绍了一种构建可重复的基于肌动蛋白的组装模型的方法，并阐述了如何对该方法进行修改，以制备从活性网络到准二维液晶及向列相液滴等多种变体结构。我们此前已采用类似方法研究了在加入交联蛋白后短肌动蛋白丝形成相分离液晶液滴的现象11，肌球蛋白II诱导的肌动蛋白网络形变模式（例如丝状体屈曲或相对滑动）随肌动蛋白丝交联程度和网络连通性的变化规律28，不同间距和顺应性条件下肌球蛋白II在肌动蛋白束上产生作用力的差异29，以及肌球蛋白II的运输行为30。利用交联蛋白和肌动蛋白封端蛋白，可系统性地调控肌动蛋白丝的长度及其组装结构。

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 微型离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-123</td><td></td></tr><tr><td>008-氟化表面活性剂</td><td>RAN Biotechnologies</td><td>00115081361-6525</td><td>替代预混溶液</td></tr><tr><td>008-FluoroSurfactant 在 HFE7500 中</td><td>RAN Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td>预混溶液</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（&amp;beta;-巯基乙醇)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689</td><td>CAS编号：60-24-2&lt;br/&gt; 储存液：25 mM，溶于MilliQ水，4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>CAS编号：7365-45-9</td></tr><tr><td>5 分钟环氧树脂</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>AKL99-A</td><td>&gt;99% 纯度的兔骨骼肌&lt;br/&gt; （纯化的替代方法）</td></tr><tr><td>肌动蛋白（罗丹明标记）</td><td>细胞骨架公司</td><td>AR05-A</td><td>兔骨骼肌&lt;br/&gt; （纯化的替代方法）</td></tr><tr><td>三磷酸腺苷5&amp;prime;三磷酸腺苷（ATP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td>CAS编号：34369-07-8&lt;br/&gt; 储存液：25 mM，溶于MilliQ水，-20℃保存 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 保持冷冻以避免水解</td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl₂）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>CAS编号：10043-52-4</td></tr><tr><td>加帽蛋白（小鼠）</td><td></td><td></td><td>过表达纯化而来 &lt;em&gt;E.coli &lt;/em&gt;带有 HisTag&lt;br/&gt; 储备液：20 mM，溶于加帽蛋白缓冲液，-80 ℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>牛肝过氧化氢酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9322</td><td>CAS编号：9001-05-2&lt;br/&gt; 储存液：85 ku/mL，与葡萄糖氧化酶分装后于 -20 保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12544C</td><td>硼硅酸盐，#1.5，24 mm × 40 mm&lt;br/&gt; Fisherbrand，非 Fisher Finest</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>CAS编号：50-99-7&lt;br/&gt; 储存液：225 mg/mL，溶于MilliQ水，-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3860-OP</td><td>CAS编号：3483-12-3&lt;br/&gt; 储备液：1 M，溶于MilliQ水，-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>3M</td><td>3136</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 200 Proof</td><td>PHARMCO</td><td>111000200</td><td>CAS编号：64-17-5&lt;br/&gt; 200 proof</td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>CAS 号：67-42-5</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td>CAS编号：60-00-4</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>345386</td><td>CAS编号：9001-37-0&lt;br/&gt; 储存液：135 mg/mL，溶于MilliQ水，分装后与过氧化氢酶一同于-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>356352M</td><td>CAS 号：56-81-5</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Fisher Bioreagents&amp;nbsp;</td><td>BP305-50</td><td>CAS编号：288-32-4</td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Bioreagents&amp;nbsp;</td><td>BP214</td><td>CAS编号：7786-30-3，7791-18-6</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0512</td><td>CAS编号：9004-67-5&lt;br/&gt; 15 厘泊</td></tr><tr><td>显微镜载玻片 普通</td><td>Electron Microscopy Sciences/Gold Seal</td><td>63710-05</td><td>&amp;nbsp;3&quot;x1&quot;，1 mm 厚</td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td>Millipore</td><td>CUFBI001</td><td>超纯水</td></tr><tr><td>Novec-7500 工程流体</td><td>3M</td><td>7100134816</td><td>替代预混溶液</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>CAS 号：7447-40-7</td></tr><tr><td>磷酸钾（KPO）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>CAS 号：7758-11-4</td></tr><tr><td>兔骨骼肌丙酮粉</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>41995-1</td><td>用于肌动蛋白纯化时（替代购买）&lt;br/&gt; 在-80℃下，将约30 mM的样品储存于G缓冲液中 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289</td><td>CAS编号：26626-22-8</td></tr><tr><td>四甲基罗丹明-C6-马来酰亚胺</td><td>AnaSpec</td><td>AS-81445</td><td>CAS编号：174568-68-4，用于肌动蛋白纯化（替代购买方式）&lt;br/&gt; 在-80℃下，将约30 mM的样品储存于G缓冲液中 &amp;deg;C. 标记肌动蛋白时使用（购买的替代方法）</td></tr><tr><td>Tris 盐酸（Tris HCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648317</td><td>CAS编号：1185-53-1</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Emerson Branson&amp;nbsp;</td><td>CPX2800H</td><td></td></tr></tbody></table>

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops

基于肌动蛋白细胞骨架的材料被广泛用作模型细胞材料，以阐明细胞力学中的物理机制，例如形态调控和力的产生，同时也作为一类有趣的软性聚合物材料而受到关注。本方法详细描述了基于肌动蛋白的组装体的构建过程 体外 使用纯化蛋白进行荧光显微镜研究。我们在样品腔室中聚合长链肌动蛋白丝，并利用聚合物排阻剂将肌动蛋白丝密集排列成二维（2D）缠结网络，该网络附着于经表面活性剂层钝化的表面。在存在腺苷三磷酸（ATP）的条件下加入骨骼肌肌球蛋白II丝，可诱导肌动蛋白网络收缩。通过使用交联剂将肌动蛋白丝束化，可调控组装体系的收缩性，使其从发生屈曲的材料转变为在微尺度上滑动的材料。通过在肌动蛋白共聚合过程中引入加帽蛋白以缩短肌动蛋白丝长度，可将材料性质从二维网络调控为液晶态。分散的短肌动蛋白丝经交联后可形成三维（3D）液晶液滴。

通过采用本方法中所述的一般策略，在含有修饰组装结构的辅助蛋白存在下使肌动蛋白聚合形成丝状结构，可在模型系统中利用纯化蛋白形成多种多样的肌动蛋白组装体（图1）。当肌动蛋白在无交联蛋白或封端蛋白存在的情况下聚合为丝状结构时，会形成纠缠的丝状网络（图1A）。向纠缠的网络中添加交联蛋白后，可形成准二维网络或束状网络（图1B、C）。形成的是网络结构还是束状网络，取决于添加至肌动蛋白网络中的交联蛋白的类型和浓度（例如，α-肌动蛋白抑制蛋白在低浓度时形成网络，而在较高浓度时形成束状网络，如本图所示）。交联蛋白也可在肌动蛋白聚合过程中加入，但这样可能导致形成三维结构而非准二维网络。
为了形成液晶组装结构，肌动蛋白在加帽蛋白存在下进行聚合，该蛋白可限制肌动蛋白丝的生长（图1D,E）。聚合的丝状结构...

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。

以肌动蛋白细胞骨架为基础的材料被广泛用作细胞模型材料，以阐明细胞力学的物理机制，例如细胞形态……

本研究聚焦于软性生物材料，旨在探索调控形态与组织结构的内在物理机制，以及受生物细胞启发的材料。生物和体外模型系统本身具有高度复杂性，并存在诸多潜在问题，而样品制备对这些系统的可重复性至关重要。本方案旨在提高这些系统的可重复性。这些结果为检测、表征物理力和生物材料的机制并理解其功能奠定了基础。该方法可推广至多种生物大分子和细胞器。[旁白] 首先，准备待上样样品：在微量离心管中加入5微升10×缓冲液，并加入适量去离子蒸馏水，使得在加入其余组分后最终样品体积为50微升。用移液器加入1微升25% β-巯基乙醇、1微升225毫克/毫升葡萄糖、1微升葡萄糖氧化酶与85,000单位/毫升催化剂的混合物至溶液中。然后加入1微升25毫摩尔ATP和10微升2%、15厘泊的甲基纤维素，通过反复吹打充分混匀。为启动肌动蛋白聚合，将未标记肌动蛋白与标记肌动蛋白混合，并将肌动蛋白混合物加入已准备好的F缓冲液中。上下吹打溶液以确保充分混匀。将肌动蛋白置于微量离心管中，在室温下静置进行聚合。接下来，准备流动池：将两段双面胶带平行地贴在显微镜载玻片的宽度方向上，形成流动池通道的边界。将盖玻片置于胶带形成的通道上方，确保其与载玻片垂直。按压盖玻片与双面胶带接触的区域，以形成良好密封并消除气泡。使用剃刀刀片修剪载玻片和盖玻片上多余的胶带，使仅在样品通道内可见胶带。为制备用于两个去平面样品的圆柱形样品室，首先用乙醇、水和乙醇依次冲洗盖玻片，并用过滤空气干燥。在盖玻片上涂一层薄薄的5分钟环氧树脂，用于将玻璃克隆圆柱体粘附于其上。向透明或浅色微量离心管中加入3.5微升油性表面活性剂溶液。不进行混合，直接将5微升肌动蛋白溶液通过移液器加至油性表面活性剂层的顶部。盖紧管盖。握住微量离心管顶部，轻弹底部边缘，形成初始泡沫并出现可见乳液，持续轻弹直至形成均匀的微乳液。在上样前，先混合少量5分钟环氧树脂。为上样流动池，将1至3微升油性表面活性剂溶液移入流动池的样品通道中，形成润湿通道的小液塞。倾斜流动池，以去除因油性表面活性剂弯月面回缩而形成的气隙，然后再加入样品。立即通过移液将样品溶液乳液悬液加入流动池入口，以填充通道。用5分钟环氧树脂密封流动池通道的两端。为非乳液样品的圆柱形样品室上样，将5微升油性表面活性剂溶液移入玻璃圆柱室底部。倾斜并缓慢旋转盖玻片，使表面活性剂溶液覆盖表面及圆柱内壁。用移液器吸除多余的油性表面活性剂溶液，保留一层薄层，同时防止油完全蒸发。立即向样品室中加入样品溶液。用一小片聚四氟乙烯（PTFE）胶带覆盖样品室，以防止蒸发和液体流动。将样品安装至显微镜载物台上。使用20倍、40倍、60倍或100倍油浸或水浸物镜开始肌动蛋白的时间序列成像，确保具有足够高的数值孔径以实现高分辨率成像。若在样品室中进行聚合，需让聚合持续约30分钟，或直至无可见的丝状结构延长或运动为止。向样品中加入交联剂，然后缓慢移取约总体积一半的肌球蛋白预聚合丝状物加入样品中。最后，开始时间序列成像。此处显示的是缠结肌动蛋白网络的代表性共聚焦荧光图像。该缠结的肌动蛋白网络在表面均匀分布。图像中的亮斑代表丝状结构的重叠区域，而暗区则表示肌动蛋白含量极少。热波动导致局部荧光强度变化及肌动蛋白丝的可见弯曲。加入肌球蛋白II后，肌动蛋白网络发生弯曲和重组，并在较长时间后可见肌球蛋白点状聚集。网络收缩程度取决于肌球蛋白浓度和ATP浓度。在交联的肌动蛋白网络中，肌球蛋白诱导的收缩导致比缠结网络更长尺度上的协调运动。

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Biology

生物学

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重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

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形成、限制与观察基于微管的活性向列相

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