zPDX-analyse van invasiviteit: onderzoek naar invasief gedrag van gemetastaseerde kankercellen in zebravisembryo xenografts

Overview

Deze video beschrijft een micro-injection methode voor de levering van borstkankercellen in de perivitelline ruimte van transgene zebravis embryo's. Na incubatie visualiseren we het embryo onder een fluorescerende microscoop om kankercelinvasie, verspreiding en metastase te observeren.

Protocol

1. Beeld en analyseer het gemetastaseerde proces

1. Verzamel verschillende verdoofde embryo's met een brede Pasteur pipet en breng ze over op de glazen bodem van een polystyreenschaal.
2. Verwijder overtollig water en houd een beperkte hoeveelheid eiwater. Manipuleer het embryo in positie met een haarlusgereedschap en plaats een hoes bovenop het glas.
3. Gebruik een omgekeerde confocale microscoop in combinatie met wateronderdompeling of droge langeafstandsdoelen. Plaats het embryo zo dat de regio van belang zo dicht mogelijk bij het doel ligt.
4. Voer onmiddellijk na anesthesie beeldvorming uit om het risico op overlijden als gevolg van vloeibare verdamping te verminderen.
   1. Vang signalen van egfp-gelabelde vasculatuur- en mCherry-gelabelde tumorcellen op dezelfde positie op de embryo's om geïnjecteerde cellen samen met bloedvaten te registreren door de twee beeldvormende kanalen samen te voegen.
   2. Verzamel voor elk zebravisembryo twee verschillende sets afbeeldingen uit het hoofdgebied en het staartgebied.
5. Kwantificeer het aantal verspreide cellen.
   1. Tel voor perivitelline-ruimte-injecties het aantal cellen in elke vis dat zich vanuit de celmassa naar het embryonale vislichaam in de kop- en staartgebieden heeft verspreid 4,15; de gebieden zijn voorbij de grenzen van de hartholte frontaal, bovenop de zwemblaas dorsaal, en voorbij de urogenitale opening caudale.
   2. Tel voor de Doc-injectie het aantal individuele cellen dat de collageenvezels van de staartvin uit de circulatie is binnengedrongen (MDA-MB-231) of het aantal clusters dat collectief door cellen wordt gevormd (M2) in het caudale hematopoëtische weefsel (CHT) van elke zebravis19.
6. Bestudeer invasie en metastase in meer detail met behulp van confocale microscopie (sterk aanbevolen).
   1. Gebruik een lage vergroting (4X objectief) om het hele lichaam in beeld te brengen en een overzicht te krijgen van het verspreidingspatroon van tumorcellen.
      OPMERKING: Hogere vergroting (20X en 40X doelstellingen) is geschikt voor het bestuderen van intra- en peri-tumorale angiogenese en de precieze lokalisatie van verspreide cellen in het embryolichaam.
   2. Gebruik een 488 nm laser om de zebravis embryo vasculatuur te scannen en een 543 nm laser om geïmplanteerde tumorcellen gelabeld met rode fluorescentie te scannen. Verkrijg een beeld van hoge kwaliteit door elk embryo in acht tot tien stappen te scannen. Scan en gemiddeld elke stap zes keer.
7. Plaats het embryo voorzichtig terug in het eiwater als het nodig is voor verdere experimenten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040