zPDX-Analyse der Invasivität: Untersuchung des invasiven Verhaltens metastasierender Krebszellen in Zebrafisch-Embryo-Xenografts

Overview

Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode zur Verabreichung von Brustkrebszellen in den Perivitelline-Raum transgener Zebrafischembryonen. Nach der Inkubation visualisieren wir den Embryo unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Invasion, Verbreitung und Metastasierung von Krebszellen zu beobachten.

Protocol

1. Bild und Analyse des metastasierenden Prozesses

1. Sammeln Sie mehrere anästhesierte Embryonen mit einer Breitspitzen-Pasteur-Pipette und übertragen Sie sie auf den Glasboden einer Polystyrolschale.
2. Entfernen Sie überschüssiges Wasser und halten Sie eine begrenzte Menge an Eiwasser. Manipulieren Sie den Embryo in Position mit einem Haarschleifenwerkzeug und legen Sie eine Abdeckung auf das Glas.
3. Verwenden Sie ein invertiertes konfokales Mikroskop in Kombination mit Wasser-Immersion oder Trockenobjektiven über weite Strecken. Positionieren Sie den Embryo so, dass die Interessenregion so nah wie möglich am Ziel ist.
4. Führen Sie eine Bildgebung unmittelbar nach der Anästhesie durch, um das Sterberisiko durch Flüssigkeitsverdunstung zu reduzieren.
   1. Erfassen Sie Signale von EGFP-markierten Vaskulaturen und mCherry-markierten Tumorzellen an der gleichen Position an den Embryonen, um injizierte Zellen mit Blutgefäßen zu registrieren, indem sie die beiden bildgebenden Kanäle verschmelzen.
   2. Sammeln Sie für jeden Zebrafisch-Embryo zwei verschiedene Bildersätze aus dem Kopf- und Schwanzbereich.
5. Quantifizieren Sie die Anzahl der verteilten Zellen.
   1. Bei Perivitelline-Rauminjektionen die Anzahl der Zellen in jedem Fisch zählen, die sich von der Zellmasse in Richtung des embryonalen Fischkörpers innerhalb der Kopf- und Schwanzregionen 4,15 verbreitet haben; die Regionen liegen über die Grenzen der Herzhöhle frontal, auf der Schwimmblase dorsal und jenseits der urogenitalen Öffnung kauarisch.
   2. Für die Doc-Injektion zählen Sie die Anzahl der einzelnen Zellen, die in die Kollagenfasern der Schwanzflosse aus dem Kreislauf eingedrungen sind (MDA-MB-231) oder die Anzahl der Cluster, die von Zellen kollektiv (M2) im kaudalen hämatopoetischen Gewebe (CHT) jedes Zebrafisches gebildet werden19.
6. Untersuchen Sie Invasion und Metastasierung im Detail mit konfokaler Mikroskopie (sehr zu empfehlen).
   1. Verwenden Sie eine geringe Vergrößerung (4X Objektiv), um den ganzen Körper abzubilden und einen Überblick über das Verbreitungsmuster der Tumorzelle zu erhalten.
      HINWEIS: Eine höhere Vergrößerung (20X und 40X Objektive) eignet sich für die Untersuchung der intra- und peritumoralen Angiogenese und die genaue Lokalisierung von disseminierten Zellen im Embryokörper.
   2. Verwenden Sie einen 488 nm-Laser, um die Zebrafisch-Embryo-Vaskulatur zu scannen, und einen 543 nm-Laser, um implantierte Tumorzellen mit roter Fluoreszenz zu scannen. Erhalten Sie ein hochwertiges Bild, indem Sie jeden Embryo in acht bis zehn Schritten scannen. Scannen und durchschnittlich jeden Schritt sechs Mal.
7. Legen Sie den Embryo vorsichtig wieder in das Eiwasser, wenn er für weitere Experimente benötigt wird.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040