zPDX-Analyse de l’invasivité : Étude du comportement invasif des cellules cancéreuses métastatiques chez les xénogreffes embryonnaires zebrafish

Overview

Cette vidéo décrit une méthode de microinjection pour l’administration de cellules cancéreuses du sein dans l’espace périvitelline des embryons transgéniques de poisson zèbre. Après incubation, nous visualisons l’embryon sous un microscope fluorescent pour observer l’invasion, la diffusion et la métastase des cellules cancéreuses.

Protocol

1. Image et analyse du processus métastatique

1. Recueillir plusieurs embryons anesthésiés à l’aide d’une pipette Pasteur à bout large et les transférer au fond de verre d’un plat en polystyrène.
2. Retirer l’excès d’eau et garder une quantité limitée d’eau d’œuf. Manipulez l’embryon en position avec un outil de boucle de cheveux et placez un couvercle sur le dessus du verre.
3. Utilisez un microscope confocal inversé en combinaison avec des objectifs d’immersion d’eau ou de sécheresse à longue distance. Positionnez l’embryon de telle sorte que la région d’intérêt soit aussi proche que possible de l’objectif.
4. Effectuez l’imagerie immédiatement après l’anesthésie pour réduire le risque de décès dû à l’évaporation liquide.
   1. Capter les signaux des cellules tumorales étiquetées EGFP et mCherry à la même position sur les embryons pour co-enregistrer les cellules injectées avec les vaisseaux sanguins en fusionnant les deux canaux d’imagerie.
   2. Pour chaque embryon de poisson zèbre, recueillir deux ensembles différents d’images de la région de la tête et la région de la queue.
5. Quantifier le nombre de cellules disséminées.
   1. Pour les injections d’espace périvitelline, compter le nombre de cellules dans chaque poisson qui se sont disséminées de la masse cellulaire vers le corps embryonnaire des poissons dans les régions de la tête et de la queue 4,15; les régions sont au-delà des limites de la cavité cardiaque frontally, sur le dessus de la vessie natatoire dorsalement, et au-delà de l’ouverture urogène caudally.
   2. Pour l’injection doc, compter le nombre de cellules individuelles qui ont envahi les fibres de collagène du tailfin de la circulation (MDA-MB-231) ou le nombre de grappes formées par les cellules collectivement (M2) dans le tissu hématopoïétique caudal (CHT) de chaque poisson zèbre19.
6. Étudier l’invasion et la métastase plus en détail en utilisant la microscopie confoccale (fortement recommandée).
   1. Utilisez un faible grossissement (objectif 4X) pour l’image de l’ensemble du corps et pour obtenir une vue d’ensemble du modèle de diffusion des cellules tumorales.
      REMARQUE: Un grossissement plus élevé (objectifs 20X et 40X) convient à l’étude de l’angiogenèse intra et péri-tumorale et à la localisation précise des cellules disséminées dans le corps embryonnaire.
   2. Utilisez un laser de 488 nm pour scanner la vascularisation embryon zebrafish et un laser de 543 nm pour scanner les cellules tumorales implantées étiquetées avec fluorescence rouge. Obtenez une image de haute qualité en scannant chaque embryon en huit à dix étapes. Numérisez et moyennez chaque étape six fois.
7. Remettre soigneusement l’embryon dans l’eau de l’œuf s’il est nécessaire pour d’autres expériences.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040