Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Zusammenfassung

Durch die ektopische Expression von vier Transkriptionsfaktoren, Oct4, Klf4, Sox2 und cMyc können menschliche Körperzellen zu einer pluripotenten Zustand umgewandelt werden, erzeugen so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) ^1-4. Patienten-spezifischen iPS fehlen die ethischen Bedenken, die embryonalen Stammzellen (ESC) umgeben und möglich wäre Immunabwehr zu umgehen. So haben iPSCs große Aufmerksamkeit für die Krankheit Modeling-Studien, das Screening von pharmakologischen Verbindungen und regenerative Therapien ⁵ angezogen.

Wir haben die Erzeugung von Transgen-freien menschlichen iPS von Patienten mit unterschiedlichen Lungenerkrankungen mit einer einzigen verbrauchsteuerpflichtiger polycistronischen lentiviralen Stem Cell Kassette (STEMCCA) Codieren der Yamanaka Faktoren ⁶ gezeigt. Diese Linien wurden iPSC aus Hautfibroblasten, die häufigste Zelltyp zum Umprogrammieren verwendet erzeugt. Normalerweise erfordert ein Erhalten Fibroblasten Haut Stanzbiopsie gefolgt durch Expansion der Zelles in der Kultur für ein paar Passagen. Wichtigerweise haben eine Anzahl von Gruppen die Umprogrammierung von menschlichen peripheren Blutzellen in IPSCs ^7-9 berichtet. In einer Studie wurde eine induzierbare Tet Version des STEMCCA Vektor ⁹ verwendet, welche erforderlich ist, um die Blutzellen gleichzeitig mit einem konstitutiv aktiven Lentivirus Codieren des Reverse Tetracyclin-Transaktivator-infiziert. Im Gegensatz zu Fibroblasten, kann peripheren Blutzellen mittels minimal-invasive Verfahren gesammelt werden, stark reduziert die Beschwerden und Leiden des Patienten. Eine einfache und effektive Protokoll zur Reprogrammierung Blutkörperchen Verwendung eines konstitutiven einzigen verbrauchsteuerpflichtiger Vektor kann die Anwendung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen. Darüber hinaus Umprogrammierung der Zellen des peripheren Blutes ermöglicht die Erzeugung von iPS von Einzelpersonen in der Hautbiopsien vermieden werden (dh. Aberrante Narbenbildung) oder sollten aufgrund bereits bestehenden Krankheitszuständen preventing Zugang zu Stanzbiopsien.

Hier zeigen wir, ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung eines einzigen floxed-verbrauchsteuerpflichtigen Lentivirusvektor konstitutiv exprimieren die 4 Faktoren. Frisch gesammelten oder aufgetaute PBMCs werden für 9 Tage wie beschrieben in Medium enthaltenden ^10,11 Ascorbinsäure, SCF, IGF-1, IL-3 und EPO bevor es mit dem STEMCCA Lentivirus transduziert erweitert. Die Zellen werden dann auf MEFs ausplattiert und ESC-ähnliche Kolonien visualisiert werden kann 2 Wochen nach der Infektion. Schließlich werden selektierten Klone expandiert und auf die Expression der Marker Pluripotenz SSEA-4, Tra-1-60 und Tra-1-81. Dieses Protokoll ist einfach, robust und sehr konsistente, eine zuverlässige Methode zur Herstellung von menschlichen IPSCs aus leicht zugänglichen 4 ml Blut.

Protokoll

Ein. Isolation und Expansion von peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMCs)

DAY 0

1. Zeichnen 4 ml peripheres Blut in einen BD Vacutainer CPT Zellpräparation Tube mit Natriumcitrat. Das Röhrchen 8 bis 10 Mal und zentrifugieren bei 1.800 xg für 30 min bei Raumtemperatur. Idealerweise sollte dieser Schritt innerhalb von 2 h der Entnahme erfolgen.
2. Sammeln Sie die mononukleären Zellen (MCs) durch Pipettieren der Buffy-Coat (Zellschicht zwischen Gelbarriere und Plasma) in ein steriles 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Bringt Gesamtvolumen auf 10 ml mit sterilem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Invertzucker mehrmals un....

Ergebnisse

Wir demonstrieren eine einfache und effektive Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus PBMCs unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektor. 1A zeigt eine schematische Darstellung des Protokolls. Das Blut wird in einen BD Vacutainer CPT Zellpräparation Tube mit Natriumcitrat gesammelt, und nach Zentrifugation, mononukleären Zellen können von der Schnittstelle zwischen dem Polyester Gel und dem Plasma (buffy coat) (1B) gesammelt werden. Die isolierten PBMCs werden da.......

Diskussion

Wir beschreiben hier die Verwendung des STEMCCA Lentivirusvektor die menschliche IPSCs aus mononukleären Zellen von einigen ml frisch gesammelten peripheren Blut isoliert erzeugen. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um gefrorene PBMCs (direkt aus dem Buffy-Coat) erhalten ein Detail erhebliche praktische Auswirkungen umzuprogrammieren bei der Nutzung Spenderzellen von einem entfernten Standort erworben werden. Vor der Induktion von Umprogrammierung muss isolierten PBMCs durchlaufen eine kritische Expansionsstufe, .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube mit Natriumcitrat	BD Biosciences	362760
QBSF-60 Stem Cell Medium	Quality Biological	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Atlanta Biologicals	S10250
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Pen / Strep	Invitrogen	15140
L-Glutamin	Invitrogen	25030
Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140
β-Mercaptoethanol	MP Biomedicals	190242
Ascorbinsäure	Sigma	A4544
IGF-1	R & D Systems	291-G1
IL-3	R & D Systems	203-IL
SCF	R & D Systems	255-SC
EPO	R & D Systems	286-EP
Dexamethasone	Sigma	D4902
Polybrene	Sigma	H-9268
bFGF	R & D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES Cell Marker Sample Kit	Millipore	SCR002