En fremgangsmåte for hurtig isolering av mitokondrier fra pattedyr vevsbiopsier er beskrevet. Rottelever, eller skjelettmuskelpreparater ble homogenisert med en kommersiell vev dissociator og mitokondrier ble isolert ved filtrering gjennom nylon differensial mesh filter. Mitokondrie isolasjon tid er <30 min sammenlignet med 60 – 100 min ved hjelp av alternative metoder.
Tidligere beskrevne mitokondrielle isoleringsmetoder ved hjelp av differensialsentrifugering og / eller Ficoll gradientsentrifugering krever 60 til 100 minutter å fullføre. Vi beskriver en fremgangsmåte for rask isolering av mitokondrier fra pattedyr biopsier ved hjelp av en kommersiell vev dissociator og differensial filtrering. I denne protokollen, er manuell homogenisering erstattet med vevet dissociator standardiserte homogenisering syklus. Dette sørger for en enhetlig og konsistent homogenisering av vevet som ikke er lett oppnås med manuell homogenisering. Etter vev dissosiasjon, blir homogenat ble filtrert gjennom nylon mesh filter, som fjerner gjentatt sentrifugering trinn. Som et resultat, kan mitokondriell isolering utføres i mindre enn 30 min. Denne isolasjonen protokollen gir ca 2 x 10 10 levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier fra 0,18 ± 0,04 g (våtvekt) vevsprøve.
Mitokondrier eksistere i hver eneste celle i kroppen, bortsett fra røde blodceller og er involvert i et stort antall viktige cellulære og metabolske prosesser 1-4. På grunn av disse mange funksjoner, kan mitokondrieskade ha skadelige effekter tre. For å undersøke mitokondriefunksjon og dysfunksjon flere mitokondrielle isoleringsmetoder har blitt beskrevet. De tidligste publiserte kontoer mitokondriell isolasjon dato til 1940-tallet 5-8. Den første dokument forsøk demonstrerte mitokondriell isolert ved maling av levervev i en morter, etterfulgt av sentrifugering i en saltoppløsning ved lav hastighet 5,8. Senere, andre grupper utvidet på den opprinnelige prosedyren og demonstrert vev fraksjonering basert på differensialsentrifuge 6-8. Disse tidlige metoder dannet basis av dagens teknikker, som benytter ofte homogenisering, og / eller differensialsentrifuge 9-15. Antallet homogenizatipå og sentrifuge trinn varierer mellom protokoller. Disse repeterende trinn øke tiden for mitokondriell isolasjon og til slutt redusere levedyktighet. I tillegg kan manuell homogenisering forårsake mitokondriell skade og inkonsistente resultater hvis ikke skikkelig kontrollert 10,16.
Nylig brukte vi homogenisering og differensialsentrifugering for å isolere mitokondrier for transplantasjon til hjerteinfarkt vev 17,18. Denne omstendelige isoleringsprosedyre kreves omtrent 90 min, og den kliniske anvendbarheten av denne metoden var derfor begrenset. For å tillate for akutt terapeutisk bruk i kliniske og kirurgiske behandlingen har vi utviklet en hurtig mitokondriell isolasjon prosedyre som kan utføres i mindre enn 30 min.
De store fordelene med denne protokollen er at standardiserte vev dissosiasjon gir jevn og konsistent homogenisering av vev som ikke er enkelt å oppnå med manuell homogenisering. I addition, bruk av differensial filtrering i stedet for differensialsentrifugering eliminerer tidkrevende og gjentatt sentrifugering fremgangsmåte som muliggjør hurtig isolering av mer høyrensede, levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier.
Evnen til å isolere levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier på mindre enn 30 min muliggjør klinisk anvendbarhet. Denne isolasjonen protokollen har potensial for bruk i koronarkirurgi (CABG) og andre terapeutiske prosedyrer.
Å kunne isolere mitokondrier ved hjelp av denne protokollen er det viktig å holde alle løsninger og vevsprøver på is for å bevare mitokondrie levedyktighet. Selv når det holdes på is, vil det isolerte mitokondrier utviser en reduksjon i funksjonell aktivitet over tid 19. Vi anbefaler at alle løsninger og tillegg være forhånds forberedt. Vi pre-veie og lagre subtilisin A i 4 mg porsjoner i 1,5 ml mikrofugerør og lagre dem ved -20 ° C. Tilsvar BSA er pre-veid og lagret i 20 mg aliquoter i 1,5 ml mi…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av nasjonale hjerte, lunge og blod Institute Grant HL 103 542, og The BCH Anesthesia Research Foundation Distinguished Trailblazer Award til CAP.
Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
Equipment | |||
50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |