Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Summary

Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.

Abstract

Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, die von Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark abgeleitet sind. Ihrer einzigartigen Fähigkeit, sowohl die organischen und anorganischen Matrices von Knochen resorbieren, bedeutet, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Skelettumbau spielt. Gemeinsam sind Osteoblasten und Osteoklasten für die dynamische Kopplung Prozess, der sowohl die Knochenresorption und gemeinsam handeln, um den normalen Skelett während Gesundheit und Krankheit pflegen Knochenbildung beinhaltet verantwortlich.

Als Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper, können Änderungen in der Osteoklastendifferenzierung oder Funktion in tiefgreifende Wirkungen im Körper führen. Krankheiten mit veränderter Osteoklasten-Funktion verbunden sind, können im Schweregrad von letalen neonatalen Erkrankung aufgrund eines Fehlers einen Markraum für Hämatopoese bilden reichen, um mehr häufigsten beobachteten Pathologien wie Osteoporose, bei denen eine übermäßige Knochenresorption durch Osteoklasten prädisponiert Formation zu brechen. ent "> Eine Fähigkeit, Osteoklasten in hoher Anzahl in vitro zu isolieren hat für bedeutende Fortschritte im Verständnis der Knochenumbauzyklus erlaubt und hat den Weg für die Entdeckung neuer therapeutischer Strategien, die Bekämpfung dieser Krankheiten geebnet.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zu isolieren und zu kultivieren Osteoklasten aus Knochenmark der Maus, die eine große Zahl von Osteoklasten ergeben wird.

Introduction

Knochenumbau ist dynamisch und umfasst die Kopplung von Knochenbildung mit Knochenresorption ^1. Diese stark regulierten Prozess ist für die Aufrechterhaltung der Skelett während normaler Homöostase verantwortlich ist und in Reaktion auf eine Verletzung und Krankheit.

Osteoklasten sind einzigartig, mehrkernige Zellen, die fähig resorbierenden sowohl die organischen und anorganischen Matrizen von Knochen sind. Osteoklasten sind aus der Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark ^2-5 abgeleitet. Anomalien in der Funktion oder Bildung von Osteoklasten in einer Vielzahl von klinischen Erkrankungen, einschließlich gemeins....

Protocol

HINWEIS: Ethische Aussage: Alle Forschungs mit Wirbeltieren wurde nach Protokollen von der Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) zugelassen geführt.

1. Vorbereitung

1. Geben Sie 10 ml des im Handel erhältlichen Dichtegradienten Zellentrennmedium (das Polysaccharose und Natriumdiatrizoat enthält, auf eine Dichte von 1,077 g / ml eingestellt) auf RT in einem 50 ml konischen Röhrchen kommen.
2. Vorbereitung Durchflusszytometrie (FACS) mit Puffer 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 2% fötalem Kälberserum (FCS). Nehmen Sie ein 50 ml Aliquot und dieses aliquoten bei RT für den Einsatz zu halten während des Dichte....

Results

Das Ziel dieses Verfahrens war die einfache Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten in vitro, typischerweise in einer Woche. Erfolgreiche Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten wurde mit Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung (1A) bestätigt. Große Osteoklasten werden als große, violette Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise ≥ 3 Kerne) visualisiert. Unter Verwendung dieses Protokolls ist es üblich, Osteoklasten mit nicht weniger als 30 Keime pro Osteoklasten (.......

Discussion

Eine Fähigkeit, leicht zu isolieren und zu kultivieren eine große Zahl von Osteoklasten in vitro wurde für die Hilfe, Verständnis für Knochenbiologie und Osteoklasten-vermittelten Krankheiten voranzutreiben verantwortlich. Es war die Identifizierung von RANKL, die zu diesem führen, als es vor kurzem als Hauptregulator der Osteoklastenbildung, Differenzierung und das Überleben ^{von 16 bis 18} identifiziert.

Es ist unsere Erfahrung, dass die in vitro-Kultivierung von.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM, kein Glutamin, kein Phenolrot	Gibco	51200-038
M-CSF, rekombinante Maus	Gibco	PMC2044
rekombinante Maus TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli exprimiert)	R& D Systems	462-TEC-010
Prostaglandin E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Saure Phosphatase, Lekozyten (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A
Osteoassay Knochenresorptionsplatten, 24-Well-Platten	Corning Life Sciences	3987