Methodenartikel

Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

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DOI:

10.3791/54017

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31. Mai 2016

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1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Gefäßverkalkung ist ein wichtiger Prädiktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen und trägt dazu bei. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Induktion der Verkalkung von kultivierten primären vaskulären glatten Muskelzellen und zur Quantifizierung der Verkalkung und Makrophagenbelastung in tierischen Aorten mittels Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung.

Zusammenfassung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in der Welt. Atherosklerotische Plaques, bestehend aus lipidbeladenen Makrophagen und Verkalkungen, entwickeln sich in den Koronararterien, der Aortenklappe, der Aorta und den peripheren Leitungsarterien und sind das Kennzeichen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Beim Menschen ermöglicht die Bildgebung mit Computertomographie die Quantifizierung der Gefäßverkalkung; Das Vorhandensein von Gefäßverkalkung ist ein starker Prädiktor für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse. Die Entwicklung neuartiger Therapien bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen hängt entscheidend von der Verbesserung unseres Verständnisses der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Atherosklerose ab. Die Erweiterung unseres Wissens über atherosklerotische Mechanismen stützt sich auf murine und zellbasierte Modelle. Hier wird ein Verfahren zur Abbildung von Aortenverkalkung und Makrophageninfiltration unter Verwendung von zwei spektral unterschiedlichen Nahinfrarot-Fluoreszenzsonden beschrieben. Die Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung ermöglicht die ex vivo-Quantifizierung von Verkalkung und Makrophagenakkumulation in der gesamten Aorta und kann verwendet werden, um unser Verständnis der mechanistischen Beziehung zwischen Entzündung und Verkalkung bei Atherosklerose zu erweitern. Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von glatten Muskelzellen der tierischen Aortengefäße und ein Protokoll zur Induktion der Verkalkung in kultivierten glatten Muskelzellen entweder aus murinen Aorten oder aus menschlichen Koronararterien beschrieben. Diese In-vitro-Methode zur Modellierung der Gefäßverkalkung kann verwendet werden, um die Signalwege zu identifizieren und zu charakterisieren, die wahrscheinlich für die Entwicklung von Gefäßerkrankungen wichtig sind, in der Hoffnung, neue Ziele für die Therapie zu entdecken.

Einleitung

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in der Welt, einschließlich der Vereinigten Staaten , wo es mehr als 780.000 Todesfälle entfallen jährlich. 1 Koronargefäßverkalkung und Aortaverkalkung sind Markenzeichen von atherosklerotischen Erkrankungen und dienen als starke Prädiktoren für kardiovaskuläre Ereignisse. 2- Intima - Verkalkung, im Zusammenhang mit Atherosklerose und medial (auch bekannt als Mönckeberg) Verkalkung, im Zusammenhang mit chronischer Nierenerkrankung und Diabetes 5 intimale Verkalkung tritt bei der Festlegung der Lipidakkumulation und Makrophagen. 4 Zwei Arten von Gefäßverkalkungen wurden bei Erwachsenen berichtet Infiltration in die Gefäßwand. 5,6 Medial Wand Verkalkung erfolgt unabhängig von Intima Verkalkung, lokalisiert zu Elastinfasern oder glatte Muskelzellen, und ist nicht mit Lipidablagerung oder Makrophagen - Infiltration verbunden. 5,7,8 Untersuchungen über die molekularen Mechanismen derGefäßverkalkung haben auf zellbasierten und Tiermodellsysteme verlassen. Nagermodelle für atherocalcific Krankheit gehören Mäuse einen Mangel an entweder Apolipoprotein E (ApoE) 9,10 oder Low-Density - Lipoprotein - Rezeptor (LDLR) 11 zugeführt , eine fettreiche Diät, während Modelle für mediale Verkalkung gehören Mäuse mit Matrix - Gla - Protein (MGP) -Mangel 12 oder Ratten , die Urämie entweder in der Nähe von insgesamt Nephrektomie (die 5/6. Nephrektomie - Modell) oder durch Bestrahlen mit einem High-Adenin - Diät zu entwickeln. 13

Hier wird das Modell der medialen Gefäßverkalkung im Zusammenhang mit MGP Mangel konzentriert sich auf. MGP ist ein extrazelluläres Protein , das Arterienverkalkung hemmt. 12 Mutationen im MGP - Gens in Keutel Syndrom, eine seltene Krankheit beim Menschen gekennzeichnet durch diffuse Knorpelverkalkung neben brachytelephalangy, Hörverlust und periphere Pulmonalstenose identifiziert worden. 14-18 Obwohl nicht oft beobachtet, 19konzentrischer Verkalkungs mehrerer Arterien wurde in Keutel Syndrom beschrieben. 20 Gemeinsame Polymorphismen im menschlichen MGP - Gens sind mit einem erhöhten Risiko für koronare Arterienverkalkung zugeordnet, 21-23 während höhere Blutspiegel von nicht - carboxyliertem, biologisch inaktive MGP kardiovaskuläre Mortalität vorherzusagen. 24 Im Gegensatz zum Menschen mit Keutel Syndrom, MGP-defiziente Mäuse eine schwere vaskuläre Phänotyp bei zwei Wochen alte spontan weit verbreitet , bestehend aus Startarterienverkalkung entwickeln und 6-8 Wochen nach der Geburt aufgrund Aortenruptur sterben. 12

Im Gegensatz zu ApoE - / - und LDLR - / - Mäuse gefüttert eine fettreiche Diät, die mit zugehörigen Makrophagen-induzierte Entzündung der Intima Gefäßverkalkung entwickeln, MGP - / -. Mäuse in Abwesenheit von Makrophagen - Infiltration medial Gefäßverkalkung entwickeln 11,25 Obwohl diese Ergebnisse legen nahe, verschiedene zugrunde liegende Reize für intimal und mediale Verkalkung ist es eine Überlappung in den Signalisierungsmechanismen , die beide Formen der Verkalkung vermitteln. 26 Multiple Signalwege identifiziert wurden, die zu Gefäßverkalkung einschließlich entzündlicher Mediatoren, wie Tumornekrosefaktor-α und IL-1 und pro-osteogenen Faktoren tragen Diese signal~~POS=TRUNC erhöhen die Expression der Transkriptionsfaktoren , wie beispielsweise Notch, Wnt und bone morphogenetic protein (BMP) signalisiert. 27,28 runt bezogenen Transkriptionsfaktor 2 (Runx2) und osterix, die wiederum die Expression von Knochen-verwandte Proteine ​​erhöhen ( . zB Osteocalcin, Sclerostin und alkalische Phosphatase) in den Gefäßen , die Verkalkung vermitteln 28-30 Wir und andere haben gezeigt , dass die Gefäßverkalkung in ApoE beobachtet - / - und LDLR - / - Mäuse eine fettreiche Ernährung und die spontane gefüttert Gefäß beobachtet Verkalkung in MGP - / - Mäuse hängen alle von Knochen - morphogenetischen Protein (BMP) signaling, und es ist dieser Weg, der hier konzentriert. 11,25,31 BMPs sind potente osteogenen Faktoren für die Knochenbildung erforderlich ist, und sind dafür bekannt , eine erhöhte Expression in humanen Atherosklerose zu zeigen. 32-34 In vitro Studien haben impliziert BMP - Signalgebung bei der Regulierung die Expression von osteogenen Faktoren wie Runx2. 35-37 Überexpression des BMP - Liganden, BMP-2, beschleunigt die Entwicklung von Gefäßverkalkung in ApoE-defiziente Mäuse eine fettreiche Diät gefüttert. 38 darüber hinaus die Verwendung von spezifischen BMP - signal~~POS=TRUNC Inhibitoren, als LDN-193189 (LDN) 39,40 und / oder ALK3-Fc verhindert die Entwicklung von Gefäßverkalkungen in beiden LDLR - / - Mäuse eine fettreiche Ernährung und MGP-defizienten Mäusen gefüttert 11,25.

Vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) bei der Entwicklung von Gefäßverkalkung eine kritische Rolle spielen. 30,41,42 der medialen Gefäßverkalkung , die in MGP-defizienten Mäusen entwickelt ist Eigenschaftedurch eine transdifferentiation von VSMCs zu einem osteogenen Phänotyp gekennzeichnet. Der Verlust der MGP führt zu einer verminderten Expression von VSMC Markern einschließlich myocardin und alpha Glattmuskelaktin, mit einer damit einhergehenden Anstieg der osteogenen Marker wie Runx2 und Osteopontin. Diese Veränderungen stimmen mit der Entwicklung von Gefäßverkalkung. 25,43,44

Aorten - Verkalkung und Entzündung bei Mäusen typischerweise beurteilt werden für frühe Verkalkung histochemischen Techniken wie alkalische Phosphatase - Aktivität unter Verwendung von und die osteogene Aktivität, von Kossa und Alizarin - Rot - Färbung für späte Verkalkung, und immunhistochemische Protokolle , die Makrophagen - Proteinmarker Ziel (z. B. CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 jedoch erfordern diese Standard - Bildgebungstechniken Verarbeitung von Aorten Gewebe in Querschnitten, die zeitaufwendig und unvollständig aufgrund Probenahme Vorspannung und sind begrenzt in ihrer Fähigkeit, Entzündung und calcificat zu quantifizierenIons in der gesamten Aorta. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung und ganzen Aorten und mittleren Arterienverkalkung und Makrophagen - Akkumulation quantifizieren Verwendung Nah-Infrarot - Fluoreszenz (NIR) molekulare Bildgebung ex vivo. Auch ein Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären Aorten VSMCs von Mäusen zur Verfügung gestellt ist und die Induktion der Verkalkung von murinen und humanen VSMCs in vitro , um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Gefäßverkalkung zu bestimmen. Diese Techniken bieten die Ermittler mit in vivo und in vitro - Methoden für atherocalcific Krankheit zu studieren.

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Protokoll

Alle Studien mit Mäusen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Gehäuse und alle Verfahren an Mäusen in dieser Studie beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Komitees vom Massachusetts General Hospital (Unterausschuss für Forschung Animal Care) zugelassen. Alle Verfahren wurden mit Sorgfalt durchgeführt Leiden zu minimieren.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging von Whole Aorten
    Hinweis: a . Bisphosphonat-derived, Nah-Infrarot - Fluoreszenz - Bildgebung Sonde verwendet werden , können durch Bindung an Hydroxyapatit osteogene Aktivität in den Gefäßen zu markieren 46,47 A Cathepsin-aktivierte Fluoreszenz - Imaging - Sonde kann für Makrophagen proteolytischen und elastolytische Aktivität als Marker dienen in das Gefäßsystem. 9 die gleichzeitige Verwendung beider Fluoreszenzsonden zu ermöglichen, ist es wichtig ,zu verwenden, Sonden, die spektral verschieden sind. Die Notation Kalzium NIR wird die Verkalkung spezifische Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-Sonde und Cathepsin NIR, um anzuzeigen, die Cathepsin tätigkeitsspezifischen Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-Sonde, um anzuzeigen, verwendet werden.
    1. Bereiten Sie die Lösungen von Calcium NIR und Cathepsin NIR. mit 24 nmol Kalzium NIR oder Cathepsin NIR und leicht schütteln Wie pro Protokolle des Herstellers 1,2 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in das Fläschchen hinzuzufügen.
      Anmerkung: Nach Angaben des Herstellers, einmal mit PBS rekonstituiert, bleiben die Calcium NIR und Cathepsin NIR Lösungen für 14 Tage stabil, wenn sie im Dunkeln bei 2-8 ° C gelagert.
  2. Isolation und Verkalkung von Murine Aortic VSMCs
    1. Aortic Aufschlußlösung:
      1. Eine frische Lösung (~ 3-5 ml pro Aorta geerntet) mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), enthaltend 175 U / ml Typ-2-Kollagenase und 1,25 U / ml Elastase. Sterilisieren Sie die Lösung with ein 0,22 um Vakuum-driven-Filtersystem und halten Sie die Lösung auf Eis bis zum Gebrauch.
    2. Zellmedien:
      1. Supplement 500 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Erwärmen die Medien auf 37 ° C vor der Verwendung.
    3. Verkalkungen Medium:
      1. Verkalkungen Medien A (NAPHOS, in Maus-Zelllinien verwendet werden):
        1. Ergänzung 100-500 ml DMEM (Volumen nach Bedarf) mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM Natriumphosphat, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Erwärmen die Medien auf 37 ° C vor der Verwendung.

          ODER
      2. Verkalkungen Medien B (βGP / asc / DEX, verwendet entweder Maus oder menschlichen Zelllinien):
        1. Ergänzung 100-500 ml DMEM (Volumen nach Bedarf) mit 10% fötalem Rinderserum, 10 mM β-Glycerophosphat Dinatriumsalz, 50 ug / ml L-Ascorbinsäure, 10nM Dexamethason, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Erwärmen die Medien auf 37 ° C vor der Verwendung.

2. Schwanzveneninjektion

  1. Vor dem Schwanz Injektion, erwärmen Sie die Mäuse unter einer milden Wärmelampe für 5 min.
  2. Begrenze die Maus in einem Rohr Nagetier Halter. Desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer.
  3. Nutzen Sie eine 30 G-Nadel für Schwanzveneninjektion. Schwanzvenen sind seitlich angeordnet.
    1. Anwenden eines sanften Betrag der Vorwärtsdruck auf die Spritze, wenn die Nadel in die Schwanzvene vorgeschoben wird. Die Vene wird zugegriffen, wenn der Widerstand der Injektion nicht mehr vorhanden ist.
    2. Spritzen mit einem Volumen von 100 ul Calcium-NIR und / oder 100 & mgr; l von Cathepsin NIR mit einer konstanten Rate. Am Ende der Einspritzung nach einer 5 Sekunden Pause, ziehen Sie die Nadel.
  4. Ernten Sie die Aorten (siehe Abschnitt 3) 3-24 Stunden nach der Injektion.

3. Maus Dissection

  1. Euthanize Maus mit 200 mg / kg intraperitoneal mit Pentobarbital-Injektion.
  2. Legen Sie das Tier liegt auf dem Rücken der Dissektion Bord und zu stabilisieren, indem jeder Pfote auf dem Brett Taping. Mit einem Binokular und eine kleine Schere, machen einen Einschnitt Mittellinie vom Unterbauch auf den oberen Brustkorb verläuft.
  3. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette zurück und das Peritoneum zu entfernen, die Bauchorgane enthüllt. Entfernen Sie die Magen-Darm-Organe, dabei nicht die Aorta transect.
  4. Machen Sie einen seitlichen Einschnitt in der vorderen Membran und weiterhin den Schnitt über den Bauch. Mit Dissektion Schere, lassen Sie die ribcage, indem es durch die Seiten der Rippen schneiden und das weiche Gewebe verwachsen dem oberen Teil des Brustbeins zu entfernen. Entfernen Sie den Brustkorb und enthüllt die Lunge.
  5. Lassen Sie das Herz an Ort und Stelle nach dem (zu Hilfe bei der Identifizierung und der proximalen Aorta seziert) und vorsichtig in die Lunge zu entfernen. Entfernen Sie den Thymus, Luftröhre, Speiseröhre und mit Sorgfalt, ensuring, dass die Aorta intakt bleibt.
  6. Mit gerade feinen Pinzette und Mikro-Präparierscheren, entfernen Sie das weiche Gewebe der Aorta aus dem Becken Gabelung zu den Aortenbogen umgibt, achten Sie dabei besonders , wenn die peri-Aorten - Fett (Abbildung 1A) zu entfernen. Entfernen Sie die restlichen Fett und Weichgewebe , die großen Zweige des Aortenbogen umgebenden (dh brachiocephalic, A. carotis communis und subclavia, 1B).
    Hinweis: Es ist wichtig, das Fett aus der Aorta zu entfernen, weil Fett das Hintergrundsignal erhöhen kann, wenn Fluoreszenz-Bildgebung durchgeführt wird.
  7. Entfernen Sie das Herz aus der Brusthöhle, vorsichtig von der proximalen Aorta Abnehmen und entsorgen. TRANSECT die distale Aorta an der iliakalen Bifurkation. Verwendung eines Insulin-Nadel injizieren normaler Kochsalzlösung in die Aorta vom Aortenbogen verbleibenden Blutzellen auszuwaschen. Nehmen Sie die Aorta zusammen mit den Aortenbogen Gefäße, sie vollständig zu entfernenaus dem Körper.
  8. Legen Sie die Aorta in normaler Kochsalzlösung auf Eis, bis sie bereit für die Bildgebung.

4. Aorten Imaging

  1. Bild Aorten ex vivo unmittelbar nach der Ernte durch Nah-Infrarot - Fluoreszenz - Reflexions Bildgebung. 25
    1. Stellen Sie die Fluoreszenz - Imager an den entsprechenden mehrkanaligen Wellenlängen Fluoreszenzsignalintensitäten aus den Aorten von Calcium NIR und Cathepsin NIR-injizierten Mäusen zu quantifizieren, wie zuvor beschrieben. 25 nach Angaben des Herstellers, Calcium NIR mit von ~ 650-678 nm Licht angeregt werden , eine maximale Emission im ~ 680-700 nm-Bereich. Cathepsin NIR kann durch ~ 745-750 nm Licht mit einer maximalen Emission bei ~ 770 nm angeregt werden.

5. Isolierung von primären Murine Aortic glatten Gefäßmuskelzellen

  1. Die Schritte 3,1-3,7, wie oben beschrieben.
  2. Legen Sie die Aorten in kaltem HBSS, bis die Dissektionen abgeschlossen sind. Schneiden Sie vorsichtig jede rem wegaining periaortalen Fett und Weichgewebe, nur die Aorta zu verlassen.
  3. Unter einer sterilen Gewebekultur Kapuze, übertragen Sie die Aorten auf die Aortic Aufschlußlösung in 35 mm x 10 mm Gewebekulturschalen. Platz in einem Inkubator bei 37 ° C für 30 min unter leichtem intermittierenden rocking. Nach der Verdauung zeigen die Aorten eine gestreckte oder ausgefransten Aussehen.
  4. Mit dem Präpariermikroskop und einer sterilen Pinzette entfernen Sie die äußere Adventitialschicht der Aorta, während die Mittelschicht intakt zu halten. Eine Technik für die Adventitia zu entfernen, ist die äußere Schicht der Aorta an einem Ende abzulösen und entfernen Sie sie von der darunter liegenden Mittelschicht wie eine Socke wieder abgezogen werden konnte und entfernt.
  5. Sobald die Adventitialschicht entfernt wurde, legen Sie die restlichen Aorta in eine neue Gewebekulturschale mit Zellkulturmedien und lagern bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2-4 Std.
  6. Unter einer sterilen Haube und mit sterilen 3 mm Mikro-Dissektion Schere, schneiden Sie die Aorta in 1-2 mm breitRinge.
  7. Zeigen diese Ringe in einer neuen Gewebekulturschale mit Aortic Aufschlußlösung und Inkubation bei 37 ° C unter sanftem intermittierende für 120 min rocking. Pipette, um die Lösung nach oben und unten mehrere Male während dieser Inkubation Zellen erneut zu suspendieren.
  8. 5 ml warmem Zellkulturmedium zu der Aufschlußlösung und in ein 15 ml konischen Röhrchen.
  9. Zentrifuge das Röhrchen 5 min bei 200 x g.
  10. Anzusaugen , die Medien und resuspendieren Zellen in dem gewünschten Volumen von Zellkulturmedien (beispielsweise 5 ml).
  11. Platte die gesamte Menge von isolierten Zellen aus jeder Aorta in eine 25 cm 2 Zellkulturflasche und inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2. Propagieren Zellen unter Verwendung von Standardtechniken, wie zuvor beschrieben. 25,48 In den ersten 7-10 Tagen Inkubation verändern die Medien jeden 72-96 Stunden. Da die Zellen Konfluenz nähern, wieder aufzufüllen Medien häufiger (alle 48 h).
    Hinweis: Es kann viele Wochen dauern, um eine ausreichende qua wachsenntity von Zellen.
  12. Sobald konfluent, passage Zellen mit Trypsin , das auf 37 ° C erwärmt.
    1. In 0,5-1,0 ml Trypsin zu jeder Kulturflasche und Inkubation für 3-5 min; sanft tippen Sie auf die Seite des Kolbens alle 30-60 sec nach Bedarf Zellen von der Oberfläche zu lösen.
    2. Sobald die Zellen vom Boden des Kolbens zu lösen, 10 ml Zellmedium zu den Zellen in Trypsin. Zentrifugieren der Zellen bei 200 xg für 5 min. Aspirieren die Medien und Trypsin aus dem Zellpellet. Resuspendieren der Zellen in der gewünschten Menge an frischen Zellmedien (beispielsweise 5-10 ml) aufnehmen und in einen neuen Kolben (mit einigen zu einer Kammer Träger übertragen Zellen).
  13. Bei der ersten Passage von Zellen, bestätigen die glatte Muskelzelllinie mit Standardtechniken Immunzytochemie, wie zuvor beschrieben, 49 unter Verwendung eines Antikörpers gegen α-smooth muscle actin.

6. Inducing Verkalkung von Cultured glatten MuskulaturZellen

  1. Platten Zellen von 5,12 in einer 6-Well-Format erhalten. Hinweis: Ab 1 x 10 5 Zellen / Well in einem Gesamtvolumen von 2,0 ml Zellmedium pro Well empfohlen.
  2. Lassen Sie Zellen in Kalzifizierung Medien A oder B für mindestens 7 Tage in einer 6-Well-Plattenformat zu wachsen. Inkubiere Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  3. Ändern Zellmedien alle 48 Stunden.

7. Beurteilung der VSMC Verkalkungen Mit der von Kossa Färbemethode

. Hinweis: Der von Kossa Verfahren zum Messen extrazellulären Matrix Kalzifizierung von Geweben oder kultivierten Zellen beruht auf der Substitution des Phosphat-gebundenen Calciumionen mit Silberionen 50 In Gegenwart von Licht und organischen Verbindungen, die Silberionen reduziert und als metallisches visualisiert Silber. Jegliches nicht umgesetztes Silber wird durch Behandlung mit Natriumthiosulfat entfernt 50 Das Protokoll für die von Kossa - Färbung ist wie folgt.:

  1. Absaugen Medien von Zelle culture Platten.
  2. Fix-Zellen, indem sie in 1 ml 10% iges Formalin bei Raumtemperatur für 20 min platziert.
  3. Entfernen Sie die Formalin und waschen Sie die fixierten Zellen mit destilliertem Wasser für 5 min.
  4. Inkubieren Zellen in 1 ml 5% Silbernitratlösung unter einem 60-100-W-Glühlampe für 1-2 Std.
  5. Saugen Sie das Silbernitratlösung und Waschen mit destilliertem Wasser für 5 min.
  6. Entfernen nicht umgesetzten Silber durch die Zellen in 1 ml von 5% Natriumthiosulfat Plazieren (w / v) Lösung in destilliertem Wasser für 5 min.
  7. Spülen Zellen mit destilliertem Wasser für 5 min. Wiederholen Sie wäscht 3x. Die von Kossa-Färbung ist für die Bildgebung mit Standard-invertierte Lichtmikroskopie bereit.
  8. Optionaler Schritt: Gegenfärbung mit 1 ml Kernechtrot für 5 min. Folgen Sie dieser mit drei Waschungen mit destilliertem Wasser (jeweils 5 min).

ODER

8. Beurteilung der VSMC Verkalkungen mit Near-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging

Anmerkung: Ähnliche seiner FähigkeitVerkalkungen innerhalb Maus Aorten, Calcium NIR bindet leicht calcific mineral abgeschieden durch gezüchtete Zellen zu identifizieren. Unter Verwendung dieser Technik Fluoreszenzmikroskopie und Plattenleser mit langen Wellenlängenfiltern Bild kann und in vitro Kalzifizierung quantifizieren, respectively. Die langwellige Emission des Calcium NIR ermöglicht die gleichzeitige Nutzung der niedrigeren Wellenlänge emittierenden Fluorophore andere Merkmale zu erkennen. Das Protokoll für Calcium NIR-Färbung ist wie folgt:

  1. Wie in Abschnitt 1.1.1 beschrieben, mit 24 nmol Kalzium NIR 1,2 ml 1x PBS in das Fläschchen hinzuzufügen.
  2. Man verdünnt das Calcium NIR Lager 1: 100 in den entsprechenden Verkalkung oder Kontrollmedien.
  3. Absaugen Zellmedien aus Kulturplatten und ersetzen mit dem Calcium-Kulturmedien-NIR enthält.
  4. Inkubieren der Kulturplatten mit Calcium NIR Medien über Nacht bei 37 ° C.
  5. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit PBS.
    Hinweis: An dieser Stelledas ursprüngliche Kulturmedium kann in die Vertiefungen gegeben werden, und die Zellen können lebende abgebildet werden. Andernfalls gehen Sie auf die folgenden Schritte aus.
  6. Fix-Zellen, indem sie in 1 ml 10% iges Formalin bei Raumtemperatur für 20 min platziert.
  7. Entfernen Sie die Formalin und waschen Sie die fixierten Zellen mit destilliertem Wasser für 5 min. Wiederholen Sie wäscht 3x.
  8. Optionaler Schritt:. Führen Sie Immunfluoreszenzanfärbung oder andere Gegenfarben für Proteine ​​von Interesse 8,9
  9. Bild oder detektieren die Calcium NIR stain geeignete Fluoreszenzanregungswellenlängen und Emissionsfiltern (~ 680-700 nm) (zB NIR Calcium kann durch 650-678 nm Licht angeregt werden).

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Ergebnisse

Aortic Kalzifizierung in MGP - / - und Wildtyp - Mäusen wurde unter Verwendung von Imaging von Calcium NIR Fluoreszenz gemessen. Kein Calcium NIR - Signal wurde in den Aorten von Wildtyp - Mäusen, was das Fehlen von Verkalkungen (Abbildung 2) nachgewiesen. Ein starkes Kalzium NIR-Signal wurde in den Aorten von MGP-defizienten Mäusen nachgewiesen, die mit fortgeschrittenen Gefäßverkalkung im Einklang steht. Gewebeschnitte von Aorten von Wildtyp und MGP - /...

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Diskussion

Arterienverkalkung ist ein wichtiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen bei Menschen und kann direkt an der Pathogenese von kardiovaskulären Ereignissen beitragen. 1,5,52 Intimale Kalkablagerung in den dünnen faserigen Kappen von atherosklerotischen Erkrankungen vorgeschlagen lokalen biomechanischen Stress zu erhöhen und dazu beitragen, Plaque - Bruch. 53,54 Medial Verkalkung Auswirkungen der klinischen Ergebnisse durch arterielle Steifigkeit zu erhöhen, was Herzhypertrophie induzieren k...

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Offenlegungen

Das Massachusetts General Hospital hat Patente im Zusammenhang mit niedermolekularen Inhibitoren von BMP-Typ-I-Rezeptoren und der Anwendung von ALK3-Fc zur Behandlung von Arteriosklerose und Gefäßverkalkung angemeldet, und MD, PBY, KDB und RM haben möglicherweise Anspruch auf Lizenzgebühren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB und TET), dem Howard Hughes Medical Institute (TM), dem Ladue Memorial Fellowship Award der Harvard Medical School (DKR), dem START-Programm der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (MD), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DE 1685/1-1, MD), dem National Eye Institute (R01EY022746, ESB), der Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Exucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in der Pathogenese von Lungen- und systemischen Gefäßerkrankungen, PBY, KDB und DBB), das National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB und DBB), das American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM) und das National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 und R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 ml konisches RöhrchenFalcon352096
30 G NadelBD305106
Alpha glatte Muskulatur Aktin AntikörperSigmaSAB2500963
Chamber SlideNunc Lab-Tek154461
Kollagenase, Typ 2 WorthingtonLS004176
DexamethasonSigmaD4902
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-084
Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung, kein CalciumGibco14190-144
ElastaseSigmaE1250
Fötales RinderserumGibco16000-044
Pinzette, feine SpitzeRobozRS-4972
Pinzette, volle Kurve gezahntRobozRS-5138
Formalin (10%)Elektronenmikroskopie Sciences15740
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14025-092
Menschliche Koronararterien glatte MuskelzellenPromoCellC-12511
Insulinspritze mit NadelTerumoSS30M2913
L-AscorbinsäureSigmaA-7506
Mikro-Präparier-Federschere (13 mm)RobozRS-5676
Mikro-Präparier-Federschere (3 mm)RobozRS-5610
NIR, Cathepsin (ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIR, osteogen (OsteoSense-680EX)Perkin ElmerNEV10020EX
Normal KochsalzlösungHospira0409-4888-10
Nuclear Fast RedSigma-AldrichN3020
Odyssey Imaging SystemLi-CorOdyssey 3.0
Penicillin/StreptomycinCorning30-001-CI
Silbernitrat (5%)Ricca Chemical Company6828-16
Natriumphosphat zweibasisches HeptahydratSigma-AldrichS-9390
NatriumthiosulfatSigmaS-1648
ß-Glycerophosphat DinatriumsalzhydratSigmaG9422
Gewebekulturkolben, 25 cm2Falcon353108
Gewebekultur Platte (35 mm x 10 mm)Falcon353001
Gewebekulturplatte, SechswelligeFalcon353046
TrypsinCorning25-053-CI
Röhrchenhalter für NagetiereKent ScientificRSTR551
Vakuumbetriebenes FiltersystemMilliporeSCGP00525

Referenzen

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
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