Summary
Dit werk beschrijft een protocol dat gebruik maakt van een component-opgeloste aanpak om sensibilisatie te bestuderen bij grasspollenallergene in een cohort van patiënten uit zuidelijk China met allergische rhinitis en / of astma.
Abstract
Sensibilisatie aan gras pollen legt een wereldwijd risico op allergische luchtwegziekten op. Hoewel preventie afhankelijk is van lokaal onderzoek van de pollenallergene, zijn gegevens over dit onderwerp beperkt in Zuid-China. Eventuele beschikbare gegevens werden verkregen door middel van zelfrapporten vragenlijsten, huidprikproeven en totale of specifieke IgE-tests met behulp van ruwe extracten. Om vele redenen zijn deze methoden onbetrouwbaar. Serum zieke reactiviteit tegen Bermuda gras, Timothy gras en Humulus scandens allergenen in een cohort van patiënten uit Greater Guangzhou (zuidelijke China's grootste stad en haar buitenwijken) met allergische rhinitis en / of astma werden onderzocht met behulp van een volledig geautomatiseerde immunoassay analysator als een component -resolved diagnostics (CRD) tool.
Voor de eerste keer werd een aanzienlijk hoge prevalentie van Bermuda grass sIgE positiviteit aangetoond in Chinese zuiders met allergische rhinitis en / of astma. Bij deze patiënten is een subtiele prevalentie van sensibilisatieNaar Timothy gras en Humulus scandens werd ook genoteerd, die kan voortvloeien uit cross-reactiviteit, aangezien de laatste twee niet in de regio gebruikelijk zijn. Dit werd ook ondersteund door de detectie van allergeencomponenten.
Volledig geautomatiseerde immunoassayanalysatoren kunnen over de tijd bevredigende consistentie bieden tussen regio's, laboratoria en instellingen. De automatisering van het instrument kan een gestandaardiseerde detectie mogelijk maken die niet voor de komst van CRD gemakkelijk zou zijn geopenbaard.
Dit is een studie die gebruik maakt van een CRD-benadering om sensibilisatie te onderzoeken naar grass pollen allergenen in Zuid-China. Het voegt toe aan actueel bewijs in de literatuur. Toekomstige studies zijn nodig om deze bevindingen te valideren. Hoewel CRD een nuttig hulpmiddel is, moeten de bevindingen die zijn gemaakt met de volledig geautomatiseerde immunoanalysator niet vervangen worden door andere laboratoriumonderzoeken, klinische evaluaties en deskundigheid van de arts.
Introduction
Gras pollen staat voor bijna 50% van de immunoglobuline E (IgE) -gerelateerde allergieën en veroorzaakt door haar luchtgehalte een globaal risico op allergische luchtwegziekten, met name astma en allergische rhinitis 1 , 2 , 3 , 4 . Preventie tegen graspollenallergieën in een regio is gebaseerd op informatie over de lokale verdeling van de pollenallergenen. Helaas varieert het spectrum van de sensibiliserende allergenen van plaats tot plaats - een waarneming die algemeen bekend staat als regionale specificiteit.
In China is een omvangrijk Oost-Aziatisch grondgebied, de regionale specificiteit van graspollenensensibilisatie, ingewikkelder door beperkte gegevens die momenteel in het zuidelijke deel van dit land beschikbaar zijn in de afgelopen decennia 5 . Zo'n peil in gegevens heeft ertoe geleid dat het moeilijk is om de algemene gras pollen sensi te tonenIn dit grote land 6 . Bovendien werden de zeer beperkte gegevens over Chinese zuiders grotendeels verkregen uit zelfrapportage vragenlijsten, huidprikproeven (in plaats van laboratorium serum tests), totale IgE-metingen (in plaats van allergeen-specifieke IgE (sIgE)) en sIgE detectie op allergenen ( In plaats van allergeen componenten moleculen).
De zelfrapportering van allergische symptomen kan onbetrouwbaar zijn bij specifieke allergenen. Skin prick tests, hoewel algemeen toegankelijk, betreffen het gebruik van niet-gestandaardiseerde, ruwe allergeen extracten, die zelf andere sensibiliserende componenten kunnen bevatten die de uitkomst interpretatie confronteren. De betrouwbaarheid van de huidpricketest hangt ook kritisch af van de vaardige manipulatie door allergisten of specialistische verpleegkundigen, recent gebruik van histamine en patiënt compliance (soms erg moeilijk voor jonge kinderen). Totaal IgE is nuttig voor het screenen van een allergie, maar stelt het niet verstandig vastE-allergene in een patiënt. Bovendien bevatten bijna alle allergenen een aantal allergeencomponentmoleculen. Sensibilisatie van de hoofdcomponenten ( dat wil zeggen Der p 1 en Der p 2 uit huisstofmijten) kan een "echte" allergie voorstellen (allergie tegen een specifiek allergeen, in plaats van valse positiviteit door kruisreacties met andere allergenen), maar sensibilisatie Naar bepaalde ( dwz de kruisreactieve Der p 10, een tropomyosine) mag niet 7 .
Voordat component-opgeloste diagnostiek (CRD) werd geïntroduceerd, belemmerden deze teleurstellende tegenslagen allergene studies in China. CRD detecteert precies de componenten van een allergeen door gebruik te maken van recombinante of gezuiverde allergeenmoleculen, waardoor de meting gemakkelijk te kwantificeren en karakteriseerbaar is 8 . In de afgelopen decennia hebben allergie studies vaak ruwe extracten van allergenen gebruikt die onvermijdelijk een aantal irrelevante componenten bevatten. Veel van deze coMponenten zijn inert, maar soms kunnen sommige positieve reacties verstoren. Het gebruik van recombinante of gezuiverde allergeenmoleculen in CRD kan dit omzeilen en daarom een betere testnauwkeurigheid bieden. Wanneer deze in microarrays wordt verwerkt, scherpt of onderscheidt een CRD-aanpak de sensibilisatie van honderden allergeenmoleculen in individuele vakken. Een goed ontworpen CRD-studie over sensibilisering van graspollen in Zuid-China ontbreekt momenteel. Ideaal gezien zou een dergelijk onderzoek een lokale bevolking met een aanzienlijke geografische dekking moeten omvatten, rekening houden met gras pollen die algemeen in China worden gerapporteerd en de hierboven genoemde technische aspecten aanpakken. Om een praktisch niveau van klinische relevantie te bereiken en de aanwerving van serummonsters te vergemakkelijken, kan vroegtijdig onderzoek naar sensibilisatie van gras pollen als inhalerende allergenen zich ook richten op patiënten met allergische ademhalingsstoornissen, in plaats van op de algemene bevolking.
Dit werk beschrijft een methodeGebruikt om de serum-reactiviteit van Bermuda gras, Timothy gras en Humulus scandens te testen bij patiënten uit Greater Guangzhou (de grootste stad van Zuid-China en haar buitenwijken) met allergische rhinitis en / of astma met behulp van de CRD-aanpak 5 . Deze bevindingen over sensibilisatie voor deze subtropische en gematigde gras pollen in Zuid-China voegen belangrijke bewijzen aan die momenteel in de literatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het studieprotocol, inclusief het gebruik van menselijk serummonster, werd goedgekeurd door het Ethiekcomité, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University. Alle deelnemers bood schriftelijk geïnformeerde toestemming, onafhankelijk of via hun ouders (in het geval van kinderen). Het protocol is online geregistreerd (Chinese Clinical Trial Register, Reg.nr .: ChiCTR-DCC-13004003, zie http://www.chictr.org/cn/).
1. Identificatie van de studiebevolking
OPMERKING: De Allergie Informatie Repository of State Key Laboratory of Respiratory Disease (AIR-SKLRD) is de primaire bron van werving van patiënten, omdat AIR de meest goed gedocumenteerde grote database van patiënten voor allergeen-tests in Zuid-China 9 , 10 is . AIR heeft al bijna een decennium serummonsters van patiënten opgeslagen. In het kort werden deze opgeslagen monsters eerder bereid door centrifugeren van 5 ml oF gefotototiseerd veneus bloed gedurende 10 minuten bij 3000 xg en het herstellen van de supernatant. De serummonsters werden geplaatst in -80 ° C koelkasten voor langdurige opslag. Monsters die voldoen aan de criteria voor de insluiting van patiënten waren klaar om te gebruiken voor alle tests in de huidige studie.
- Van de AIR-database, haal gegevens over patiënten met allergische rhinitis en / of astma die tussen januari 2013 en juni 2015 serumonderzoeken uitvoeren voor gras allergeen sIgE, de vooraf ontworpen studieperiode.
- Selecteer patiënten met lichte tot matige allergische rhinitis en / of astma volgens de Allergische Rhinitis en de Impact op Astma (ARIA) 11 en de Globale Initiatief voor Astma (GINA) 12 richtlijnen. Toewijzen ze als de "studiegroep."
- Uitsluiten patiënten met onvolledige medische dossiers, degenen die verloren zijn om op te volgen, diegenen die weigeren om geïnformeerde toestemming te geven met betrekking tot het gebruik van hun serummonsters voor wetenschappelijke doeleinden, die met geïdentificeerde IMmunodeficiency, die momenteel op immunotherapie of immunomodulerende middelen, of die gevonden hebben parasitaire infecties.
- Selecteer een hedendaagse cohort van patiënten met niet-ademhalingsallergieën (bijvoorbeeld eczeem, allergische dermatitis en voedselallergie) volgens dezelfde uitsluitingskriteria en toewijzen ze als de "controlegroep."
- Zorg ervoor dat de serummonsters werden verzameld voordat er voorschriften of behandelingen werden gegeven om de confounding effecten op de laboratorium bevindingen te minimaliseren. Uitsluitend serummonster uitsluiten die niet aan deze eis voldoet.
- Zorg ervoor dat alle onderwerpen permanent verblijven van alle delen van Greater Guangzhou ( dwz geboren of daar al meer dan 10 jaar wonen).
2. Studie Flow en metingen van belangstelling
- Haal de serummonsters van in aanmerking komende patiënten uit de bio-bank. Om een allergeen / allergeencomponent te testen, gebruik 140 μL serum (inclusief 100 μl om te vullenUp de dode ruimte).
OPMERKING: Het maximale totale serumvolume dat nodig is voor elke patiënt in deze studie is: 3 specifieke allergenen en 8 allergeencomponenten, sIgE = 140 μL * 11 = 1.540 μL. - Bij het gebruik van dit instrument testen de serummonsters voor sIgEs voor alle allergenen van Bermuda grass, Timothy grass en Humulus scandens voornamelijk . Volg de instructies in sectie 3.
OPMERKING: Deze pollen werden geselecteerd voor de metingen, omdat Bermuda grass 13 , 14 , 15 en Humulus scandens 16 in China alom bekend zijn, terwijl het Timothy gras 17 , 18 , 19 een typische plantensoort is die in tropische en gematigde omgeving leeft. Zones en is wereldwijd best onderzocht. - Tenslotte test de serummonsters die in stap 2.3 zijn geïdentificeerd, te hebbenZorgt voor allergenen voor de aanwezigheid van SIgEs op allergeenbestanddelen van Bermuda [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p4 (g208), Phl p5 (g215), Phl p6 (g209) ), Phl p7 (g210), Phl p11 (g211) en Phl p12 (g212)] en kruisreactieve koolhydraatdeterminanten [CCD (o214)]. Volg de instructies in sectie 3.
3. Volledig geautomatiseerde testprocedure met behulp van het Immunoassay Analysesysteem
OPMERKING: De gehele procedure van allergeen sIgE-test, dat volledig geautomatiseerd is en elders 7 , 8 , 9 , 10 is beschreven, volgt het protocol van de fabrikant.
- Start de volledig geautomatiseerde immunoassay analysator ( bijv. ImmunoCAP1000) en gebruik deze om de immunoassay gedurende de studie uit te voeren. Schakel de ingebouwde computer Data Data Management (IDM) in.
OPMERKING: De immunoassay analYzer is routinematig in de stand-by modus. - Met de "Primary Power" aan, schakel de "System Power" in en wacht 3 minuten totdat de ingebouwde software start. Klik op 'Loin Rinse Solution' en 'Load Washing Solution'.
- Voeg 140 μl serum toe aan een injectieflacon voor elke allergeen / allergeen component test. Merk elke injectieflacon met 140 μl serum met een identificatienummer dat uniek is voor elke patiënt.
- Uit de IDM-interface voert u de volgende stappen uit door op het menu te klikken.
- Controleer het venster "Request List" op de IDM om ervoor te zorgen dat "sIgE" de test methode van keuze is.
- Laad de monsterbuizen in de steekprofielen en de kwaliteitscontrolebuizen in de kwaliteitscontroles, met streepjescodes.
OPMERKING: Voor elke patiënt werd het testen oorspronkelijk gepland voor sIgE tot 3 specifieke allergenen en 8 allergencomponenten, of 346 * 11 (3,806) monsterbuizen. Voor elke monsterbuis, 3 kwaliteitscontrolebuizenDie laag, medium en hoog niveaus van sIgE controle bevatten (zie de Tabel van Materialen voor details) werden aangepast. Uiteindelijk werden slechts 58 patiënten die positief werden getest in de primaire test (stap 2.3) verder onderzocht in de secundaire test (stap 2.3). Het laden van buizen kan automatisch op de computerconsole worden ingesteld. - Selecteer 'Reagents laden' in het scherm 'Assay Processing'. Voltooi de laad van de steekproef en de kwaliteitsbeheersingstangen, ontwikkelingsoplossing, conjugaat, kalibratoren, drager, pipet tips, stopoplossing en wasoplossing volgens de "laadlijst" (zie de tabel van de materialen voor details).
- Druk in "Load and Start" op "OK".
OPMERKING: Aan het einde van de meting verschijnen de resultaten op de IDM. - Selecteer uit de IDM-interface de gegevens die u wilt exporteren. Klik op 'Menu', 'Goedkeur' en 'Opslaan als' en voer de sIgE-meetresultaten uit als een spreadsheetbestand. Importeer het spreadsheetbestand naar een statistische software (bijvoorbeeld SPSS) 10 . Met behulp van een specifieke module voor Spearman's coëfficiënten uit het SPSS menu, analyseer de correlaties in sensibilisatie tussen deze grass pollen (positieve sIgE tot heel allergeen) en pollencomponenten (positieve sIgE tot allergeenmoleculen).
4. Definitie van zieke reactiviteit
OPMERKING: Voor een onverdund serumproef is het bereik van specifieke IgE-meting 0,35 tot 100 kU / L.
- Verdun de monsters met sIgE-waarden> 100 kU / L 1: 5 en opnieuw analyseren. Wanneer de waarde hoger is dan 100 kU / L, ga verder met verdere verdunningen tot een eindpunt tot 1000 kU / L is bereikt.
- Op basis van de drempelwaarde van 0,35 kU / L, overwegen een sIgE-niveau van meer dan 0,35 kU / L om positief 5 , 7 , 10 te zijn . Beoordeel de reactivKlasse 2 (≥0,70 en <3,50 kU / L), klasse 3 (≥3,50 en <17,50 kU / L), klasse 4 (≥0,70 en <0,70 kU / L) 17,50 en <50,00 kU / L), klasse 5 (≥50,00 en <100,00 kU / L) en klasse 6 (≥100,00 kU / L).
5. Statistische analyse
- Analyseer de gegevens met statistische software (bijvoorbeeld SPSS) 10 . Meld de kwantitatieve gegevens als de gemiddelde en standaardafwijking, de kwalitatieve data als de midden- en interkwartielbereik (IQR) en de categorische data als het percentage positieve resultaten.
- Gebruik een chi-vierkant test voor de tussen-groep vergelijking van de verhoudingen, een ongepaarde t-test voor kwantitatieve data en een rang-sum test voor kwalitatieve data.
- Gebruik Pearson's test voor correlatieanalyses tussen parametrische data, met de correlatiecoëfficiënten uitgedrukt als "r" en Spearman's test voor niet-parametrische waarden, met tHij correlatiecoëfficiënten uitgedrukt als " r s ." Beschouw statistische betekenis om te zijn wanneer P- waarden <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volledig geautomatiseerde immunoassayanalysator die in dit onderzoek wordt gebruikt, heeft een vaste fase structuur bedekt met covalente koppeling allergenen of allergeen componenten die reageren met de belangenmoleculen (sIgE) in serummonsters van de patiënt. Met een automatisch programma wast de analysator alle niet-specifieke IgE's af met 150 μL spoeloplossing en herhaalt dit 5 keer. Daarna voegt het enzymplakt anti-IgE antilichamen (50 μL) toe om een complex te genereren. Het enzymgemerkt anti-IgE-antilichaam (conjugaat) is een secundair antilichaam dat bindt aan een specifiek IgE. Onbonden anti-IgE antilichamen worden geëlimineerd door wassen met 150 μl wasoplossing (herhaaldelijk 3 keer). Het gebonden complex wordt gedurende 9 min bij 37 ° C behandeld met een ontwikkelingsmiddel (50 μl). Het ontwikkelende middel is een enzym-verteringsmiddel dat alle gebonden anti-IgE-antilichamen afsnijdt. De laatste emitteert fluorescentie onder alkalische conditie. De reactie wordt gestopt metDe toevoeging van alkalische stopoplossing. Daarna comprimeert het instrument de vaste-fase structuur om het eluaat uit te drukken en de fluorescentie van het resulterende eluaat bij een golflengte van 470 nm te meten. De fluorescentie is lineair gecorreleerd met het absolute gehalte van de analysemoleculen van belang in het eluaat. Een hogere fluorescentiewaarde betekent meer sIgE in het serummonster. Om de testresultaten te interpreteren, transformeert het systeem automatisch de reacties voor monsters naar concentraties met behulp van een kalibratiekromme. De meetgegevens worden elektronisch overgedragen aan de IDM software, die functies integreert voor de berekening van analytische resultaten, de berekening van statistieken en resultaatrapportage.
Naar aanleiding van de inclusie- en uitsluitingskriteria, onderzocht de onderhavige studie serum uit 346 patiënten. De studiegroep omvatte 78 personen met alleen allergische rhinitis, 92 met astma alleen en 88 gelijktijdigLijdt aan astma en rhinitis. De controlegroep omvatte 88 patiënten met allergieën zonder ademhaling. Deze patiënten waren 1-87 jaar oud en werden bevestigd permanente bewoners uit alle delen van Greater Guangzhou, de doelgroep van studie te zijn. Alle studiegroepen en de controlegroep waren vergelijkbaar in demografische en maatschappelijke kenmerken, waaronder geslacht, leeftijd en familiegeschiedenis. Van de patiënten in de studiegroep, 22,5% positief getest op Bermuda gras, 13,6% naar Timothy gras en 7,0% naar Humulus scandens . In de studiegroep was de gevoeligheid voor elke grasspollen veel hoger dan in de controlegroep ( tabel 1 ). Alle Bermuda-gras-negatieve patiënten waren ook negatief voor Timothy grass en Humulus scandens . Het is interessant om op te merken dat patiënten met allergische rhinitis en / of astma een opmerkelijk hogere sensibiliseringsgraad voor Bermuda-gras (n = 58, 22,5%) hebben aangetoond dan die met andere allergieën (n = 4, 4,5%).
Humulus scandens of CCD lager dan 30%. In tegenstelling hiermee hadden patiënten met Bermuda grass-IgGE reactiviteit een 67-100% kans op gelijktijdige positiviteit bij Cyn d 1, Timothy-grassallergene, Humulus-scandens of CCD ( Figuur 1 ). Bermuda-gras-achtige reactiviteitsniveaus aangetoond een significante correlatie, met kans op positiviteit voor andere grasspollen-IgE's ( r s = 0.669, P <0.001).
Timothy gras sensibilisatie werd verder beoordeeld door sIgE naar Timothy grass componenten. Onder de 35 Timothy-gras-positieve patiënten was het meest voorkomende allergencomponent Phl p 4 (100%, 35/35), gevolgd door Phl p 1(17,1%, 6/35). Drie patiënten elk (3/35, 8,6%) waren positief voor elk van Phl p 5, 6, 7, 11 en 12 ( tabel 2 ). Serum Phl p 4 sIgE niveaus correleren sterk met het totale Timothy gras allergeen en CCD sIgE niveaus (respectievelijk r s = 0.941 en 0.928, P <0.001; Tabel 3 ). 41,4% (24/58) van Bermuda gras positieve patiënten en 68,6% (24/35) van Timothy grasgevoeligte patiënten waren zwaar positief tegen CCD. Spearman's rangcorrelatie analyse liet een significante associatie zien bij sensibilisatie tussen CCD en andere grassallergene ( Tabel 3 ).
Figuur 1: Co-sensibilisatie onder patiënten die positief zijn voor Bermuda Grass SIgE.
Dit cijfer toont het percentage patiënten met verschillende klassen van ziGE reactiviteit tegen Bermuda gras (n = 58) en een gecombineerdeMier sensibilisatie voor Timothy gras, Humulus scandens , CCD, en andere gras allergeen componenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Aantal positieve testen [% (n / patiënten)] | |||
| Bermuda gras | Timoteus gras | Humulus scandens | |
| Patiënten met AR en / of AS | 22,5% (58/258) †† ‡ | 13,6% (35/258) † | 7,0% (18/258) |
| Patiënten met AR | 21,8% (17/78) †† | 10,2% (8/78) | 7,7% (6/78) |
| Patiënten met AS | 22,8% (21/92)†† | 14,1% (13/92) † | 5,4% (5/92) |
| Patiënten met AR en AS | 22,7% (20/88) †† | 15,9% (14/88) | 8,0% (7/88) |
| Leeftijd | |||
| <14 jaar of jonger | 18,6% (8/43) | 14,0% (6/43) | 7,0% (3/43) |
| > 4 jaar | 23,3% (50/215) | 13,5% (29/215) | 7,0% (15/215) |
| Seks | |||
| Mannetje | 25,7% (35/136) | 13,9% (19/136) | 7,4% (10/136) |
| Vrouw | 18,8% (23/122) | 13,1% (16/122) | 6,6% (8/122) |
| Patiënten met andere allergie | 4,5% (4/88) ** | 1,1% (1/88) ** | 0 * |
Tabel 1: Patiënten met sIgE-positieve testen voor Bermuda Grass, Timothy Grass en Humulus scandens op basis van ziekte-entiteit en demografische details. Een hoger percentage patiënten met allergische ademhalingsziekten waren positief voor Bermuda gras (χ 2 = 14,35, P <0,001), Timothy gras (χ 2 = 10,88, P <0,001) en Humulus scandens (x 2 = 5,14, P = 0,02 ) Ten opzichte van de andere allergische controles ( ** P <0,01, * P <0,05). Het percentage patiënten met een positieve Bermuda gras test was opvallend hoger dan het percentage voor Timothy gras ( ‡; P <0,05) en Humulus scandens ( †† P <0,01). Het percentage patiënten met een positieve Timothy gras test was hoger dan die van Humulus scandens ( † P <0,05). Het percentage positieve tests op Bermuda gras, Timothy gras en Humulus scandens sIgE varieerde niet significant tussen de kleine en volwassen groepen (x 2 = 0,07, P = 0,79; x 2 = 0,06, P = 0,80; x 2 = 0,11, P = 0,74). De percentages van graspollen waren niet statistisch verschillend tussen mannen en vrouwen (χ2 = 1,338, P = 0,25; χ2 = 0,063, P = 0,80; χ2 = 0,38, P = 0,54). Evenzo werden geen significante verschillen in gevoeligheidsgraden aangegeven tussen de rhinitis- en astmapatiënten (χ 2 = 0,030, P = 0,985; χ 2 P = 0,558; X2 = 0,528, p = 0,768; respectievelijk).
| Patiënten (%) | Phl p 4 | Phl p 1 | Phl p 5 | Phl p 6 | Phl p 11 | Phl p 7 | Phl p 12 | |
| 28 (80,0%) | + | |||||||
| 4 (11,4%) | + | + | ||||||
| 1 (2,9%) | + | + | + | + | + | + | ||
| 2 (5,7%) | + | + | + + | + | + | + | ||
| Totaal | 35 (100%) | 6 (17,1%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | |
| ZIgE a (kU / L) | 0,52, 0,06-2,02 | 0,02, 0,01-0,10 | 0,04, 0,03-0,24 | 0,12, 0,03-0,34 | 0,05, 0,02-0,27 | 0,03, 0,02-0,36 | 0,10, 0,04-0,28 |
Tabel 2: Gevoeligheid van Timothy Gras volgens de positieve eigenschappen en niveaus van Timothy Grass Components (N = 35). +, Positieve testen; A , SIgE levels (kU / L) worden weergegeven als de median en IQR. Van de 35 Timothy gras sIgE-positieve patiënten waren 80,0% uitsluitend Phl p4-positief, terwijl 11,4% positief waren voor Phl p4 of Phl p1.
| allergeen | Bermuda | Timothy | Humulus schandalen | CCD |
| Bermuda | - | 0,709 ** | 0,682 ** | 0,565 ** |
| Cyn d 1 | 0,583 ** | 0.787 ** | 0.751 ** | 0.865 ** |
| Timothy | 0,709 ** | - | 0,921 ** | 0.856 ** |
| Phl p 4 | 0,645 ** | 0,941 ** | 0.886 * | 0.928 ** |
| Phl p 1 | 0,616 ** | 0,681 ** | 0,712 ** | 0,507 ** |
| Phl p 5 | 0.46 | 0,273 | 0.590 * | 0.624 * |
| Phl p 6 | 0.445 | 0.306 | 0,583 * | 0,569 |
| Phl p 7 | 0,681 * | 0,481 | 0,632 * | 0,531 |
| Phl p 11 | 0.589 * | 0,372 | 0.620 * | 0,568 |
| Phl p 12 | 0,671 * | 0,411 | 0,565 | 0.446 |
| Humulus schandalen | 0,682 ** | 0,921 ** | - | 0.853 ** |
Tabel 3: Correlatiecoëfficiënten † voor de positiviteit tussen CCD en de grasspollenallergene. † wordt gepresenteerd als de correlatiecoëfficiënt r s ; Spearman's correlatieanalyses werden uitgevoerd voor deze niet-parametrische dataset. * P <0,05, ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volledig geautomatiseerde immunoassayanalysatoren kunnen over de tijd bevredigende consistentie bieden tussen regio's, laboratoria en instellingen. Zo'n automatische procedure is gebleken dat het onderzoek naar het onderzoek en de klinische studies substantieel ondersteunt, de gestandaardiseerde detectie van veel allergenen en / of allergeencomponenten mogelijk maakt en waarschijnlijke allergene kruisreactiviteit identificeert die niet gemakkelijk zou zijn onthuld voor de komst van CRD's. Bovendien kan de gehele testprocedure worden afgerond met strikte kwaliteitscontrole, waardoor door middel van een overzicht van een grote geografische regio hoge-doorvoermethoden kunnen worden uitgevoerd. Hoewel de testprocedure meestal wordt uitgevoerd door een computerconsole, moeten er enkele kritische problemen op de hoogte worden gebracht. Het is verplicht dat het instrument wordt gebruikt in nauwkeurige naleving van de gebruikershandleiding; Elke afwijking kan leiden tot onnodige testfouten, mechanische schade of persoonlijk ongeval van laserstraal of hoge elektrische spanning. Altijd enZeker dat er een juiste en juiste kalibratiecurve in het systeem is opgeslagen, aangezien dit gekoppeld is aan de nauwkeurigheid van de test. Anders moet de sIgE-concentratie van een gespecificeerde kalibrator worden gemeten voorafgaand aan de serummonsterproeven. Daarna kan het systeem de kalibratiekromme automatisch berekenen en opslaan voor later gebruik. Net als bij andere laboratoriumtechnieken is het ook belangrijk om de veiligheid van menselijke serummanipulatie in acht te nemen om technici te beschermen tegen infecties en om het milieu te verontreinigen.
Voor de eerste keer, door gebruik te maken van een volledig geautomatiseerde immunoassay analysator als een CRD benadering, vertoonde deze studie een aanzienlijke prevalentie van Bermuda grass sIgE positivity (22,5%) bij patiënten met allergische rhinitis en / of astma in Guangzhou, Zuid-China. Aangezien Timothy gras en Humulus scandens niet vaak zijn, zelfs niet bestaand, in Guangzhou, de positiviteit van het Timothy gras (13,6%) en Humulus scandens sIgE (7,0%) mKan worden toegeschreven aan kruisreactiviteit onder gras pollen.
Door het analyseren van grasspollenallergenen bleek duidelijk dat alle Timoteus-gras IgE-positieve patiënten ook positief waren aan het specifieke Timothy-grasantigeen Phl p 4. Er waren weinig (17,1%) positief getest op Phl p 1, die verrassend verschilt van data In Europa, waar de positiviteit van Phl p 1 veel hoger is dan die van Phl p 4 18 , 20 , 21 . Aangezien Phl p 1 het belangrijkste bestanddeel van Timothy gras is, kan het overheersende percentage van Phl p4 positiviteit over Phl p1 in deze studiepopulatie ook waarschijnlijke kruisreactiviteit voorstellen, anders dan "echte" sensibilisatie, omdat Phl p 4 een structurele gelijkenis deelt Met CCD en een aantal andere allergenen, waaronder bomen, groenten en tropische vruchten 19 , 22 , 23, 24 . De klinische relevantie van deze waarneming zou kunnen zijn dat de meerderheid van de Timothy-gras-positieve patiënten in deze studie nooit geadviseerd zou zijn om Timothy-grasimmunotherapie te ontvangen, die momenteel Phl p 1 25 gebruikt .
Verschillende beperkingen van de studiemethoden en technieken moeten worden vermeld. Ten eerste kunnen maximaal 3 verschillende kalibratorstrips in een pipet / reagensbak in de immunoassay analysator geplaatst worden, op maximaal drie testpartijen tegelijk kunnen worden uitgevoerd. Wanneer een zware werklast nodig is, zoals in een groter regionaal onderzoek, neemt het nog steeds een aanzienlijke hoeveelheid tijd in beslag. Ten tweede, de kruisreactiviteit met menselijk IgA, IgD, IgM en IgG is niet aanwezig bij fysiologische concentraties bij gebruik van de analysator uit deze studie, dus andere onderzoeksbenaderingen zijn nodig wanneer kruisreactiviteit met deze immunoglobulinen betreft. Ten derde, ondanks de verfijning van de devicusE, de bevindingen die zijn gemaakt met de volledig geautomatiseerde immunoassay analysator mogen niet vervangen worden door andere laboratoriumonderzoeken, klinische evaluaties en deskundigheid van de arts wanneer een definitieve diagnose wordt gemaakt. Ten vierde, als gevolg van de late introductie van allergeen CRD in China, zijn verscheidene commerciële producten van subtropische grasspollencomponenten niet beschikbaar of zijn pas onlangs goedgekeurd voor onderzoek. Daarom is het gebruik van deze techniek als een CRD-benadering voor allergenen sterk afhankelijk van de commerciële beschikbaarheid van productbenodigdheden van de fabrikant voor specifiek gebruik in een regio. In tropische en subtropische gebieden met een alomtegenwoordige complexiteit van plant pollen kan een CRD-studie onvoldoende en moeilijk zijn door het ontbreken van overeenkomstige allergeenproducten voor de tests. Een dergelijk dilemma zou de efficiëntie van deze techniek zeer in gevaar kunnen brengen.
Niettemin, tot de laatste van onze kennis, is dit een baanbrekende studie die gebruik maakt van de CRD-aanpak tO Sensibilisatie onderzoeken naar grass pollen allergenen in Zuid-China. Verdere studies kunnen doorgaan in deze ader en deze bevindingen valideren.
Tot nu toe zijn technieken die gebruik maken van de volledig-automatische immunoanalysator geaccepteerd als de gouden standaard voor in vitro allergeen sIgE tests 26 , 27 . Gezien de zeer beperkte gegevens over allergeengevoeligheid binnen het grote grondgebied van China, kunnen grote steekproefstudies met behulp van de volledig geautomatiseerde immunoassay als een CRD-benadering de leemten invullen en bij de beschikbare gegevens op dit gebied toevoegen. Het is belangrijk om op te merken dat dergelijke studies, meestal multi-center en nationaal samenwerkingen, het netwerken van immunoassays kunnen vereisen op basis van een protocol voor standaardisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Yueming Su voor zijn hulp bij het voorbereiden van de figuur. Deze studie werd gefinancierd door de Guangdong Science and Technology Foundation (Projectnummer: 2014A020212352), het Guangzhou Education Bureau (1201630044; 1201630393) en de National Natural Science Foundation of China (NSFC 81572063; NSFC 81601394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImmunoCAP 1000 Instrument | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia Information Data Manager Software Package | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| Software Package, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 (Bermuda grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 (Timothy grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 (Japanese Hop) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 Cross-reacting carbohydrate determinants (CCDs) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| Specific IgE Conjugate 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| Specific IgE Calibrator Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| Specific IgE Curve Control Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| Specific IgE Anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Negative Control | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control L | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control M | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control H | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| Development Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| Stop Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| Washing Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| Maintenance Solution Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
References
- Scadding, G. K. BSACI guidelines for the management of allergic and non-allergic rhinitis. Clin Exp Allergy. 38 (1), 19-42 (2007).
- Pollart, S. M., Reid, M. J., Fling, J. A., Chapman, M. D., Platts-Mills, T. A. Epidemiology of emergency room asthma in northern California: association with IgE antibody to rye grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 82 (2), 224-230 (1988).
- Wang, Q. Lower airway inflammation and hyperresponsiveness in non-asthmatic patients with non-allergic rhinitis. J Thorac Dis. 7 (10), 1756-1764 (2015).
- Ma, Y. The link between mold sensitivity and asthma severity in a cohort of northern Chinese patients. J Thorac Dis. 7 (4), 585-590 (2015).
- Luo, W. Major grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Mol Immunol. 78, 105-112 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, L. Prevalence of allergic rhinitis in china. Allergy Asthma Immunol Res. 6 (2), 105-113 (2014).
- Zeng, G., Zheng, P., Luo, W., Huang, H., Wei, N., Sun, B. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Mol Immunol. 74, 1-9 (2016).
- Kleine-Tebbe, J., Matricardi, P. M., Hamilton, R. G. Allergy work-up including component-resolved diagnosis: how to make allergen-specific immunotherapy more specific. Immunol Allergy Clin North Am. 36 (1), 191-203 (2016).
- Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, southern China. PLoS One. 9 (5), e94776 (2014).
- Zeng, G. Component-resolved diagnostic study of Dermatophagoides pteronyssinus major allergen molecules in a southern Chinese cohort. J Investig Allergol Clin Immunol. 25 (5), 343-351 (2015).
- Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA). Management of Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma Pocket Guide. , Available from: http://www.whiar.org/docs/ARIA_PG_08_View_WM.pdf (2015).
- Global Initiative for Asthma (GINA). Pocket Guide for Asthma Management and Prevention. , Available from: http://ginasthma.org/wp-content/uploads/2016/01/GINA_Pocket_2015.pdf (2015).
- Liu, J., Guo, A., Guo, H. Morphological variation and types of Cynodon dactylon. Acta Prataculture Sinica. 12 (6), 99-104 (2003).
- Zhang, H., Xi, J. Study on the germplasm resource and ecological characteristics of wild carpet grass (Axonopus compressus) in Guangdong. Grassland and Turf. 13 (1), 25-28 (2005).
- Kao, S. H., Su, S. N., Huang, S. W. Sub-proteome analysis of novel IgE-binding proteins from Bermuda grass pollen. Proteomics. 5 (14), 3805-3813 (2005).
- Ouyang, Y. H., Zhang, D. S., Fan, E. Z., Li, Y., Zhang, L. Correlation between symptoms of pollen allergic rhinitis and pollen grain spreading in summer and autumn. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Waike Zazhi. 47 (8), 623-627 (2012).
- Westritschnig, K. Analysis of the sensitization profile towards allergens in central Africa. Clin Exp Allergy. 33 (1), 22-27 (2003).
- Rossi, R. E., Monasterolo, G., Monasterolo, S. Measurement of IgE antibodies against purified grass-pollen allergens (Phl p 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, and 12) in sera of patients allergic to grass pollen. Allergy. 52 (12), 1180-1185 (2001).
- Zafred, D., Nandy, A., Pump, L., Kahlert, H., Keller, W. Crystal structure and immunologic characterization of the major grass pollen allergen Phl p 4. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 696-703 (2013).
- Chabre, H. Molecular variability of group 1 and 5grass pollen allergens between Pooideae species: implications for immunotherapy. Clin Exp Allergy. 40 (3), 505-519 (2010).
- Mari, A. Skin test with a timothy grass (Phleum pratense) pollen extract vs.IgE to a timothy extract vs. IgE to rPhl p 1 rPhl p 2, nPhl p 4, rPhl p 5, rPhl p 6, rPhl p 7, rPhl p 11, and rPhl p 12: epidemiological and diagnostic data. Clin Exp Allergy. 33 (1), 43-51 (2003).
- Grote, M., Stumvoll, S., Reichelt, R., Lidholm, J., Rudolf, V. Identification of an allergen related to Phl p 4, a major timothy grass pollen allergen, in pollens, vegetables, and fruits by immunogold electron microscopy. Biol Chem. 383 (9), 1441-1445 (2002).
- Andersson, K., Lidholm, J. Characteristics and immunobiology of grass pollen allergens. Int Arch Allergy Immunol. 130 (2), 87-107 (2003).
- Tripodi, S. Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: implications for specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 129 (3), 834-839 (2012).
- Stumvoll, S., et al. Purification, structural and immunological characterization of a timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen Phl p 4, with cross-reactive potential. Biol Chem. 383 (9), 1383-1396 (2002).
- Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Ann Allergy Asthma Immunol. 99 (1), 34-41 (2007).
- Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (IgE) tests performed by different assay systems. J Allergy Clin Immunol. 121 (5), 1219-1224 (2008).
