Summary
عرض مورفولوجيس مختلف الخلايا وإنشاء مجموعة متنوعة من التفاعلات مع جيرانهم. هذا البروتوكول يصف كيف تكشف مورفولوجية الخلايا المفردة والتحقيق التفاعل خلية-خلية باستخدام نظام التعبير Gal4/UAS الراسخة.
Abstract
تعرض الخلايا مورفولوجيس مختلفة ومعقدة من العلاقات التشريحية. كيف تتفاعل مع جيرانهم الخلايا؟ هل تختلف التفاعلات بين أنواع الخلايا أو حتى داخل نوع معين؟ ما هي أنواع القواعد المكانية أنها تتبع؟ الإجابات على هذه الأسئلة الأساسية في فيفو أعاقت حتى الآن عدم وجود أدوات لتسمية خلية مفردة عالية الدقة. ويرد هنا، بروتوكول مفصل لاستهداف الخلايا المفردة مع تقنية متعددة الألوان فلبوت (مكفو). ويعتمد هذا الأسلوب على المعلمة بشكل مختلف الصحفيين الثلاثة (هكتار، والعلم و V5) تحت سيطرة UAS التي يحتفظ بها صامتة بفاصل النسخي يحف به موقعين معاهدة سجل الأفلام (FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام). نبضة صدمة حرارة الحث على التعبير عن الحرارة الناجمة عن صدمة حزب العمل الفيجي recombinase، الذي يزيل أشرطة FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام عشوائياً في الخلايا الفردية: التعبير يحدث فقط في الخلايا التي نعرب أيضا عن برنامج تشغيل GAL4. وهذا يؤدي إلى مجموعة خلايا الملونة بشكل مختلف من نوع خلية معينة يسمح تصور مورفولوجيس الخلايا الفردية بدقة عالية. على سبيل مثال، يمكن الجمع بين تقنية مكفو مع السائقين GAL4 الدبقية محددة لتصور مورفولوجيس من مختلف الأنواع الفرعية الدبقية في الدماغ المورفولوجية الكبار.
Introduction
إطلاق، السكان الخلايا غير العصبية للجهاز العصبي (NS)، منذ فترة طويلة ويعتقد أن توفير إطار ثابت للخلايا العصبية ولم تدرس بالتفصيل لذلك. ومع ذلك، في البشر، وإطلاق تشكل الغالبية العظمى من الخلايا الموجودة في NS (~ 90%)، وتنقسم إلى عدة فئات مختلفة، بما في ذلك أستروسيتيس، أوليجوديندروسيتيس، ميكروجليا وخلايا شوان. في المورفولوجية، يشكل إطلاق حوالي 10% الخلايا في NS. الفضول، مورفولوجيس، والوظائف ملحوظ مماثلة لتلك التي عثر عليها في الفقاريات1،2. وتشمل على مورفولوجيس حاجز الدم – المخ (BBB) تشكيل ابيثيليا، وجرت، وأستروسيتي مثل الخلايا.
المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي (CNS) يتكون من الهياكل الرئيسية التالية: مناطق القشرة التي تحتوي على جثث الخلايا العصبية؛ نيوروبيلس التي تأوي متشابك الاتصالات؛ مساحات إكسون الصغيرة والكبيرة التي تربط نيوروبيليس مختلفة؛ الأعصاب المحيطية التي تربط الحواس والعضلات مع الجهاز العصبي المركزي (الشكل 1). إطلاق توجد المرتبطة بجميع هذه الهياكل التشريحية: إطلاق اللحاء (CG) في المناطق القشرية، أستروسيتي--مثل إطلاق (ALG) وإطلاق جرت (مثلاً) في مناطق نيوروبيلي، إطلاق جرت ترتبط أيضا بمساحات إكسون المركزية والطرفية الأعصاب (الأسماء)، وأخيراً، هما مثل ورقة إطلاق، إطلاق بيرينيوريال (PG) وسوببيرينيوريال (SPG)، التي تشكل معا طبقة متجاورة تغطي NS كامل (الشكل 2).
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إطلاق تلعب أدواراً هامة في تنمية NS؛ أنها رصد إعداد الخلايا العصبية باﻻستجابة لتعميم عناصره الببتيدات الشبيهة بالانسولين وتوفير الدعم الغذائي للخلايا العصبية، مثل المكوك لاكتات astrocyte-العصبية، والقضاء على الخلايا العصبية الموت عن طريق البلعمه3،4 , 5 , 6-في NS ناضجة، إطلاق الحفاظ على بي بي بي، وتناول العصبية والحفاظ على التوازن الأيونية، بمثابة الخلايا المناعية الرئيسية في NS، منذ الضامة لا يخل بي بي بي، وتعدل النشاط متشابك، فضلا عن سلوك الحيوانات6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
ما إذا كانت الأنواع الفرعية الدبقية مختلفة المهام المتخصصة تظل مسألة مفتوحة هامة. ومع ذلك، إجراء تحليل منهجي على نطاق الجينوم لإطلاق، خصوصا في الكبار، قد أعاق الافتقار إلى الأدوات الوراثية المناسبة للتلاعب بهم. ويرد هنا، أسلوب يسمح توصيف الأشكال الخلية لدراسة التفاعلات المعقدة خلية-خلية فعالة وسهلة. تم تطبيق هذا الأسلوب لتحديد خصائص مورفولوجية مختلفة الأنواع الفرعية الدبقية في الدماغ المورفولوجية الكبار، ولكن تبعاً للسائق GAL4 المحددة المستخدمة، فإنه يمكن تكييفها لدراسة الخلايا العصبية12،13 ، أي نوع من خلايا الاختلاط، ومن حيث المبدأ أي الأنسجة في أي من مراحل النمو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. "إعداد الذباب" لتجارب متعددة الألوان فلبوت (مكفو)
ملاحظة: تقنية "مكفو" يشير إلى نسخة معدلة من الختان كاسيت وقف حزب العمل الفيجي بوساطة ما يسمى (فلبوت). المعدلة وراثيا مكفو الذباب حمل مروج صدمة حرارة (hsp)-التحكم في ريكومبيناسي حزب العمل الفيجي والصحفيين مختلفة تحت UAS. يتكون كل مراسل دعامة المشترك ميريستويلاتيد (myr) المجلد سوبر أخضر نيون بروتين (سفجفب)، في أي 10 نسخ من علامة حانمه (مثلاً.، هكتار أو العلم أو V5) قد تم إدراجها. تتم تسمية البروتينات الفلورية غير الناتجة عن " وحش السباغيتي الجنسانية " (سمجفبس) 14 ويمكن الكشف عنها باستخدام أجسام مضادة محددة ضد العلامات حانمه مختلفة-
- عبر الذباب مع كاسيت مكفو و hsp-حزب العمل الفيجي (hsp-حزب العمل الفيجي؛ 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG، 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) إلى خطوط سائق GAL4 الدبقية المناسبة (انظر الجدول للمواد) .
- Hsp تنشط عند 25 درجة مئوية وقد تخضع بعض الخلايا جزئ مما أدى إلى وسم غير محدد، إعداد الصلبان عند 18 درجة مئوية تجنبا ليجتازها للنظام. انتظر حوالي 20 يوما عند 18 درجة مئوية للحصول على الجيل F1. بعد الحرارة صدمة (راجع الخطوة 2)، والحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية ( الشكل 3).
2. حرارة صدمة
ملاحظة: قد تختلف تبعاً للموقع، والإدراج كفاءة hsp-حزب العمل الفيجي؛ ولذلك قد الوقت صدمة الحرارة المثلى يكون الأمثل. لهذا البروتوكول، وقد استخدم أسهم يطير مكفو التي أدرجت hsp-حزب العمل الفيجي على كروموسوم إكس (انظر الجدول للمواد)-
- نقل ذرية للصليب في الخطوة 1، 1 (الذباب الجيل F1، 3-4 أيام القديمة) في قارورة جديدة التي تحتوي على الأغذية والحرارة صدمة لهم في 37 درجة مئوية في حمام مائي-
ملاحظة: الذباب الشباب (1-2 أيام القديمة) حساسة جداً للحرارة صدمة. انتظر 1 أو 2 أيام قبل إجراء صدمة الحرارة من أجل خفض معدل الوفيات الناجمة عن العلاج. استخدام بعض من الجيل F1 الذباب كعنصر تحكم، دون صدمة الحرارة. - أثناء صدمة الحرارة، الحفاظ على الذباب في القوارير العادية مع الغذاء من أجل خفض معدل الوفيات الناجمة عن الإجهاد. وضع الإناث والذكور في قنينات منفصلة.
- تأكد من أن تزج القنينة كاملة في الماء لضمان حدوث صدمة حرارة متجانسة. استخدام صدمة 5-8 دقيقة كنقطة انطلاق مناسبة لوسم متفرق إطلاق الخلايا التي تحتوي على العديد من بنود برنامج التشغيل GAL4؛ مدة الصدمة يجب أن يكون الأمثل لكل سائق والتجربة (يلزم مرات صدمة الحرارة أطول أو أقصر).
- بعد صدمة الحرارة، تكمن قنينات أفقياً على مقاعد البدلاء لبضع دقائق كي يتسنى الذباب للتعافي من صدمة الحرارة.
ملاحظة: ليس من الضروري تغيير في القنينات. - الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية وتشريح (راجع الخطوة 3 و 4) منهم 2 أو أكثر من أيام بعد صدمة الحرارة للتعبير الأمثل مراسل.
3. إعداد التشريح والحلول
- يوم التشريح، إعداد حل مثبت الطازجة في أنابيب PCR ميليلتر 200 بخلط ميليلتر 180 من S2 خلية الثقافة المتوسطة مع 20 ميليلتر من 20% بارافورمالدهيد (PFA) للحصول على حل منهاج عمل 2%. الحفاظ على الحل مثبت على الجليد قبل وأثناء التشريح.
تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة ويجب التعامل معها بحذر-
ملاحظة: مزيج ميليلتر 160 من S2 خلية الثقافة المتوسطة مع 40 ميليلتر من بارافورمالدهيد 20% (PFA) في أنبوب بكر 200 ميليلتر لإعداد حل منهاج عمل 4% بدلاً من حل 2%- - استخدام أنبوب PCR واحد كل النمط الوراثي بحد أقصى 8-10 العقول كل أنبوب لتحقيق أفضل النتائج المصبوغة. إعداد
- الدماغ الكبار الغسيل الحل: ألبومين المصل البقري 0.5%، 0.5% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: اعتماداً على تلطيخ، محلول يحتوي على 1% وقد يلزم X-100 تريتون. يزيد تركيز أعلى من Triton X-100 اختراق جسم إلى الأنسجة ومن الضروري أن وصمة عار المناطق التي تقع داخل الأنسجة (مثل المناطق متشابك في الدماغ المورفولوجية الكبار)- - إعداد حل حظر: مصل الماعز العادي 3% والمصل حمار عادي 3% 0.5% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني.
- يمكن تخزين الدماغ الكبار الغسيل الحل والحل حظر عند 4 درجة مئوية لبضعة أسابيع-
- وضع لوحة زجاج الآبار الاكتئاب العميق على الجليد وملء كل جيدا مع الحلول التالية: واحد مع الإيثانول 70% وواحدة مع برنامج تلفزيوني، وواحدة مع خلية S2 الثقافة المتوسطة.
4. تشريح الدماغ الكبار
- موقف سم 3 تشريح طبق في مرحلة ستيريوميكروسكوبي وملئه بخلية S2 الباردة الثقافة المتوسطة. إجراء تشريح جميع في هذه الوسيلة لضمان بقاء الأنسجة الصحية أثناء إجراء تشريح.
ملاحظة: استخدم طبق تشريح اصطف مع عدة ملليمترات من السيليكون الأسود الذي ينص على النقيض خلفية جيدة (في الصور)، والاحتفاظ الملقط خلال التشريح. - تخدير الذباب من النمط الوراثي المطلوب مع CO 2-
- مع الملقط، انتزاع يطير بالأجنحة وغسله في الإيثانول 70% الباردة لمدة 30 ثانية، ثم مع برنامج تلفزيوني الباردة 30 إضافية س.
- نقل الطاير إلى الاكتئاب العميق جيدا مليء بالمتوسطة ثقافة الخلية S2.
- كرر نفس الإجراء لجميع الذباب من نفس النمط الوراثي والمحافظة عليها في الخلية S2 الباردة الثقافة المتوسطة حتى التشريح، الذي سوف يحافظ على الأنسجة.
ملاحظة: تخدير فقط عدد الذباب الذي يمكن تشريح في فترة زمنية من حوالي 30 دقيقة في حضانة في أوقات طويلة في S2 خلية الثقافة المتوسطة قد تتلف الأنسجة. - الاستيلاء على الطاير مع الملقط، وتحت ستيريوميكروسكوبي، تغرق الطاير في مستنبت الخلية S2.
- فصل الرأس عن باقي الجسم. تجاهل الجسم وإبقاء الرأس غارقة في S2 خلية الثقافة المتوسطة. من المهم جداً عقد الرأس مع الملقط لكامل مدة التشريح. إذا كان الرأس يبدأ بتعويم، سيكون من الصعب على استعادته دون إلحاق الضرر بالانسجة. تبدأ
- التشريح عن طريق سحب عينة واحدة، بينما يمسك الرأس مع الملقط واحدة على الأقل في جميع الأوقات. تأكد من أن تلميح الملقط هو أسفل شبكية العين لتجنب إتلاف الأنسجة تحت. سحب العين الأخرى والبدء في إزالة بشرة حتى يظهر الدماغ.
- إزالة جميع أنسجة القصبة الهوائية وبشرة حول الدماغ حتى تظهر الأنسجة نظيفة. تأكد من إزالة جميع الأنسجة الرغامى حول الدماغ لتحقيق أفضل النتائج المصبوغة؛ الأنسجة جاهزة الآن لتكون ثابتة والملون.
- الحفاظ على جميع العقول تشريح في S2 الباردة الخلية المتوسطة الثقافة قبل تحويلها إلى حل منهاج العمل من أجل الوقت خطوة التثبيت.
5. تلوين الدماغ الكبار
< را>ملاحظة: قد تختلف أوقات الحضانة تبعاً للنوع من الأجسام المضادة المستخدمة. قد يكون من الضروري إينكوبيشنز أطول.
- لوضع العلامات من علامات مكفو الثلاثة، احتضان العقول مع مكافحة--هكتار (1: 500)، المضادة العلم (حانمه ديكدددك) (1: 100)، والأجسام المضادة-V5 الأولية.
- الابتدائية مترافق مباشرة الأجسام المضادة يمكن أن تستخدم بدلاً من الجمع الابتدائي + الثانوية العادية (مثلاً.، أنتي-V5:DyLight 549 (1: 200)). وفي هذه الحالة، علاج الأجسام المضادة مترافق مباشرة كالأجسام المضادة الثانوية-
ملاحظة: لكل الوراثي، تبقى بعض العقول كعناصر تحكم التحقق من الطابع الخاص لتلطيخ. تخطي في الحضانة جسم الابتدائية وانتقل مباشرة إلى الخطوة التالية-
ملاحظة: أمثلة من الأجسام المضادة المناسبة: 488 اليكسافلور (1: 250)، مكافحة-V5:DyLight 549 (1: 200) وديلايت 647 (1: 100)-مترافق الأجسام المضادة.
6. تصاعد من العقول لتصوير
- تريم تصوير فاصل إلى الحجم المناسب باستخدام مقص. للفحص المجهري عالية الاستبانة، ساندويتش فاصل العينة والتصوير بين اثنين الزجاج كوفيرسليبس.
ملاحظة: يتم تصوير الفواصل رقيقة (0.12 مم) الفواصل لاصقة قشر والعصا على الشرائح الزجاجية كوفيرسليبس أو المجهر، السماح بتركيب العينات دون ضغط.
إزالة الخطوط الملاحية المنتظمة لاصقة من سطح أحد - استخدام الملقط، وتطبيق مباعدة لاصق الجانب الأسفل، على سطح الزجاج ساترة (22 مم × 60 مم). تطبيق 10 ميليلتر من تصاعد المتوسطة ساترة زجاج جديد.
- مع P10 ماصة، نقل العقول من أنبوب 200 ميليلتر إلى ساترة، إلى جانب انخفاض المتوسط المتصاعدة. جنبا إلى جنب مع الأنسجة، نقل بعض برنامج تلفزيوني من أجل المحافظة على العقول في الحل-
- مع P10 ماصة، نقل العقول من برنامج تلفزيوني إلى قطره من تصاعد المتوسطة في محاولة للحد من برنامج تلفزيوني. نقل العينات في وسط تصاعد في ساترة مع فاصل التصوير. استخدام وسائل الإعلام المتزايدة ما يكفي لتغطية العينة. إزالة الخطوط الملاحية المنتظمة لاصقة أخرى من الجانب العلوي من فاصل
- وإضافة ساترة زجاجية على رأس العينات. مع تلميح الملقط، تطبيق ضغط لطيف فوق منطقة لاصقة لختم. صورة الأنسجة المركبة فورا أو تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.
7. التقاط صور
- الحصول على أكوام من الصور الأسفار [كنفوكل] باستخدام مجهر [كنفوكل] مع 40 س (NA = 1.2، غمر المياه) الهدف أو 63 X (NA = 1.4، غمر النفط) الهدف (أحجام بكسل = 1,024 x 1,024 على متن الطائرة س ص؛ المسافة بين قسمين [كنفوكل] = 0.5 ميكرومتر). ضبط الإزاحة في كل قناة في مثل هذه طريقة أن لا مشبعة بكسل وقيم بكسل الصفر موجودة في الصور؛ والكشف عن الكسب هذا يتجنب فقدان المعلومات ويضمن استخدام النطاق الديناميكي الكامل كاشف.
ملاحظة: نظراً لتصوير ثلاثي الأبعاد مضيعة للوقت، يمكن أن يكون آليا القياسات عن طريق فحص عينات متعددة في نفس الوقت في مواقع مختلفة. لتجنب التبخر مع الهدف غمر المياه، استخدام النفط الخاص الغمر المتوسطة مع معامل الانكسار n = 1.33. - عملية المداخن [كنفوكل] للحد الأقصى من الكثافة الإسقاطات، التغييرات في هوي القناة، وضبط السطوع والتباين باستخدام أي برنامج تحليل الصورة القياسية (انظر الجدول للمواد)-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويوضح هذا القسم أمثلة على النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام تقنية مكفو في الدماغ المورفولوجية الكبار. ويبين الشكل 3 تخطيطي للأسلوب. وتحتفظ غشاء الموسومة بشكل مختلف الصحفيين الثلاثة (myr-سمجفب-ها myr-سمجفب-العلم و myr-سمجفب-V5)، تحت سيطرة UAS صامتة بفاصل النسخي يحف به موقعين معاهدة سجل الأفلام (FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام). نبضة صدمة حرارة الحث على التعبير عن ريكومبيناسي حزب العمل الفيجي الذي يزيل أشرطة FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام عشوائياً في الخلايا الفردية. وهذا يؤدي إلى مجموعة خلايا الملونة بشكل مختلف من نوع خلية معينة، المحدد بواسطة برنامج التشغيل GAL4 المستخدمة.
عموما، سبعة ألوان ممكن. الرقم 4 و الشكل 5 إظهار مورفولوجيس واحدة من الخلايا EG و ALG في الفص باللوامس المورفولوجية (القاعدة)، على التوالي. زيادة الوقت صدمة الحرارة يحفز زيادة كمية الخلايا المسماة، اعتماداً على نوع برنامج التشغيل GAL4، ولذلك الأمثل أولية للبروتوكول صدمة الحرارة اللازمة. ويبين الشكل 6 وسم EG في الفص البصري المورفولوجية (را) مع الصحفيين مكفو واحد.
الشكل 1: تشريح للكبار المورفولوجية NS. المناطق القشرية (منقط المناطق الرمادية) تحتوي على كل من الخلايا العصبية ومعظم الهيئات الخلية الدبقية، بينما المناطق نيوروبيلي (المناطق الزرقاء) يحتوي على اتصالات متشابك. المناطق المسالك (أزرق داكن) الاتصال نيوروبيليس مختلفة. وقد تم تعديل هذا الرقم من كريمر et al. (2017) 18- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أنواع فرعية الدبقية عامة في المورفولوجية CNS. مراسل معلم غشاء بروتينات فلورية خضراء (UAS-mCD8-بروتينات فلورية خضراء) مدفوعا بالسائقين GAL4 محددة يسمح التصور من الأنواع الفرعية الخمسة الدبقية عامة (PG: إطلاق بيرينيوريال، SPG: إطلاق سوببيرينيوريال، الفريق الاستشاري: إطلاق اللحاء، ALG: إطلاق مثل أستروسيتي و EG: إطلاق جرت). يتم الكشف عن مناطق نيوروبيل (مناطق أرجواني) مع علامة بريسينابتيك NC82 (بروتشبيلوت). في الجزء السفلي، تظهر عدد خلايا للأنواع الفرعية الدبقية مختلفة أيضا. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: نظام العبور للأسلوب مكفو. التخطيطي أسلوب مكفو. وعبرت هوموزيجوسفيرجينس تحمل كاسيت مكفو و hsp-حزب العمل الفيجي (hsp-حزب العمل الفيجي؛ 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG، 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) مع GAL4 متماثل معين سائق الذكور. ثم أن الجيل F1 هو الحرارة صدمة. وفقا للعدد من أشرطة الكاسيت FRT-توقف-FRT إزالة عشوائياً من الصحفيين، سبعة ألوان مختلفة ممكنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مورفولوجية إطلاق جرت (مثلاً) في الفص باللوامس (AL)- [كنفوكل] z-رزمة من المورفولوجية لبعد إيمونوستينينج ووليماونت. (أ) "مورفولوجية لل" الكشف مع علامة بريسينابتيك NC82 (بروتشبيلوت). (ب-د) تصنيف العشوائية من اجسيلس الناجمة عن زيادة الحرارة صدمة مرات: 8 دقيقة (ب)، 8.5 دقيقة (ج) و 10 دقيقة (د). خذ مثلاً في أشكال مختلفة وأحجام عديدة، كما أنها انشياث سطح المجاورة آخرون الخلايا على سبيل المثال تغطية مجالات متميزة لكن إينتيرديجيتاتي جزئيا في المناطق لجهة الاتصال. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. ها: هيماغلوتينين الإنفلونزا البشرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: مورفولوجية astrocyte مثل إطلاق (ALG) في الفص باللوامس (AL)- [كنفوكل] z-رزمة من المورفولوجية لبعد إيمونوستينينج ووليماونت. تم الكشف عن مورفولوجيا (A) من الجامعة مع علامة بريسينابتيك NC82 (بروتشبيلوت). (ب-د) وسم العشوائية ALG الخلايا الناجم عن زيادة الحرارة صدمة مرات: 8 دقيقة (ب)، 10 دقيقة (ج) و 15 دقيقة (د). ALG إظهار حجم متغير ومورفولوجيس ولكن تغطي مجالات غير متداخلة إلى حد كبير. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. ها: هيماغلوتينين الإنفلونزا البشرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: مورفولوجية إطلاق جرت (مثلاً) في الفص البصري (را). [كنفوكل] z-رزمة من المورفولوجية را بعد إيمونوستينينج ووليماونت. (أ-ج) مكفو وسم مع الصحفيين الثلاثة التوقف-كاسيت مع ها، والعلم، و V5 myr-سمجفبس. حملت حزب العمل الفيجي recombinase بصدمة حرارة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. (أ-ج) يتم إظهار الفردية مكفو الصحفيين ودمج (د). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. ها: هيماغلوتينين الإنفلونزا البشرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وفعالة لدراسة مورفولوجية أنواع الخلايا المختلفة داخل أنسجة للاهتمام بدقة عالية. مع تقنية مكفو، تستخدم الصحفيين متعددة مع العلامات حانمه مختلفة في تركيبة لوسم العشوائية متعددة الألوان (الشكل 2). مماثلة إلى أساليب أخرى مثل برينبوو/فليبو15،،من1617، مكفو يزيد تنوع التسمية من خلال كوكسبريشن ماركر، السماح لتصور حدود الخلية لدراسات التفاعل خلية خلية. على سبيل المثال، مع الصحفيين الثلاثة، سبع مجموعات ماركر المحتملة الممكنة. مقارنة طرق وضع العلامات السابقة، تقنية مكفو يظهر عنصر تحكم أكثر دقة وسهولة من الخلية وسم الكثافة17: الذباب 1.0 فليبو إكسبريس علامة افتراضي الذي يجعل خلية مفردة وسم أكثر صعوبة؛ 2.0 فليبو الذباب يتطلب التعبير عن اثنين من ريكومبيناسيس حزب العمل الفيجي مختلفة جعل النظام أكثر تعقيداً.
اعتماداً على برنامج GAL4 المحددة المستخدمة، قد يكون الأسلوب مكفو تكييفها لدراسة أي الأنسجة في أي مرحلة من مراحل التنمية. هنا، قد طبق التقنية لتحديد خصائص مورفولوجية عامة الأنواع الفرعية الدبقية في الدماغ المورفولوجية الكبار بدقة عالية. العلامات متعددة الألوان من خلايا مفردة يسمح تصور حدود مختلفة ويساعد في فهم، على سبيل المثال، التفاعل المكاني بين خليتين متجاورتين؛ وبصرف النظر عن الخلايا بابوا نيو غينيا وستاروود، والتي تهدف إلى ابيثيليا النموذج، تظهر جميع أنواع فرعية أخرى الدبقية التبليط، هذا أنهم إلى تقليل الاتصال مع جيرانهم الدبقية، مع تعظيم الاتصال مع حجرة العصبية المغلفة (جسم الخلية، ومحاور عصبية، dendrites، و نقاط الاشتباك العصبي). أنهم جميعا إرسال عمليات لاميليبوديال أو فيلوبوديال ما يرام ليس فقط في منطقتهم المحلية ولكن أيضا في محيط بعيد18.
لنجاح هذا البروتوكول، من الأهمية بمكان خلفي الذباب عند 18 درجة مئوية لتفادي يجتازها في النظام. عند تشريح وطوال الإجراءات المصبوغة بأكملها، من المهم تجنب أي ضرر للأنسجة لتحقيق أفضل النتائج المصبوغة. أخيرا، لقد اثنين من الجوانب التقنية النظر في: الوقت صدمة الحرارة يحدد كمية الخلايا التي يتم التعبير عن العلامات. صدمة حرارة قصيرة سيؤدي إلى وضع العلامات من خلايا قليلة، بينما سوف تحفز صدمة حرارة طويلة التعبير عن العلامات في العديد من الخلايا تصل إلى الحالة القصوى التي يتم إزالة جميع أشرطة الكاسيت FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام من الصحفيين، في كافة الخلايا. في هذه الحالة، سوف يكون لون واحد فقط (دمج ثلاث علامات حانمه) الحالية، منع التصور من خلية واحدة مورفولوجيس. الوقت صدمة الحرارة يختلف تبعاً لموقع الإدراج hsp-حزب العمل الفيجي والسائق GAL4، ولذلك قد تكون خطوة أولية تحسين اللازمة. التعبير علامة عشوائية ولا يمكن أن تكون موجهة إلى يتدنى محددة من الخلايا التي يقودها سائق GAL4. داخل خلية واحدة، علامات مختلفة ويمكن التعبير عن تمكين تلطيخ جسم المجاورة الخلايا بألوان مختلفة. ومع ذلك، أحياناً، أعرب أكثر من علامة واحدة في خلية واحدة، مما يؤدي إلى تداخل اللونين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لدى أي من أصحاب المصالح المتنافسة أو المتصارعة.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون أرنيم جينيت، Nern الجوشا، وأعضاء آخرين في مختبر روبين للحصول على المشورة وتقاسم الكواشف غير منشورة و "جانيليا يطير فريق المشروع الضوء" لتوليد الصور [كنفوكل]. يشكر المؤلفون أيضا أعضاء المختبر بلاد الغال للتعليقات على المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P.
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
