Summary
התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.
Abstract
תאים להציג מורפולוגיות שונות ויחסים האנטומי מורכב. כיצד תאים אינטראקציה עם שכניהם? האינטראקציות נבדלים בין סוגי תאים או אפילו בתוך סוג מסוים? אילו סוגים של חוקים מרחבי הם בצע? תשובות כאלה שאלות עקרוניות ויוו יש כבר הקשו עד כה על ידי חוסר כלים עבור תיוג תא בודד ברזולוציה גבוהה. . הנה, פרוטוקול מפורט היעד תאים בודדים עם טכניקה ססגוניות FlpOut (MCFO) הינו מסופק. שיטה זו מתבססת על שלושה אחרת מתויג עיתונאים (HA, דגל ו- V5) תחת שליטה UAS שנשמרים שקט מאת בסיים תעתיק ולצדו והשפלתם שני אתרים (והשפלתם-עצור-והשפלתם). דופק הלם החום המניע את הביטוי חום הנוצרות על-ידי הלם Flp recombinase, אשר באופן אקראי מסירה את הקלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם תאים בודדים: ביטוי מתרחשת רק בתאים המבטאים גם מנהל התקן GAL4. זה מוביל מערך של תאים בצבעים שונים של סוג תא נתון המאפשר את החזיית תא בודד מורפולוגיות ברזולוציה גבוהה. כדוגמה, הטכניקה MCFO יכול להיות משולב עם נהגים GAL4 גליה ספציפיים כדי להמחיש את מורפולוגיות מסוגי המשנה גליה שונים במוח דרוזופילה למבוגרים.
Introduction
עכשיו, דונלד, האוכלוסייה הלא-דופאמינרגיים של מערכת העצבים (NS), זמן האמינו לספק מסגרת סטטי של נוירונים, לכן לא נחקרו בפירוט. עם זאת, אצל בני אדם, עכשיו, דונלד מהווים את הרוב המכריע של תאים שריכזה (~ 90%), מחולקים למספר קטגוריות שונות, כולל האסטרוציטים, oligodendrocytes להפוך, מיקרוגלייה תאי שוואן. דרוזופילה, עכשיו, דונלד מהווים כ- 10% של תאים שריכזה. מסקרן, מורפולוגיות והפונקציות שלהם דומים להפליא אלה שנמצאו בעלי חוליות1,2. מורפולוגיות שלהם כוללים את מחסום הדם - מוח (BBB) ויוצרים epithelia, ensheathing ותאים אסטרוציט דמוי.
מערכת העצבים המרכזית (CNS) דרוזופילה מורכב המבנים העיקריים הבאים: קליפת אזורים המכילים את הגופות תאים עצביים; neuropils זה הנמל קשרים סינפטיים; ספינלי האקסון קטנים וגדולים המחברים את neuropiles שונים; העצבים ההיקפיים המחוברים אברי החישה והשרירים עם מערכת העצבים (איור 1). עכשיו, דונלד נמצאים המשויכים כל מבנים אנטומיים אלה: קליפת עכשיו, דונלד (CG) באזורים קורטיקליים, אסטרוציט כמו עכשיו, דונלד (נועה) ו- ensheathing עכשיו, דונלד (למשל) באזורים neuropile, ensheathing עכשיו, דונלד קשורים גם עם ספינלי האקסון המרכזית, ההיקפית העצבים (EGN), ולבסוף, שני גיליון עכשיו, דונלד, עכשיו, דונלד perineurial (עמוד) subperineurial (SPG), אשר ביחד יוצרים שכבה רציפה שמכסה את NS כולו (איור 2).
מחקרים קודמים הראו כי עכשיו, דונלד תפקיד חשוב בהתפתחות NS; הם לפקח דופאמינרגיים מספרים על ידי מגיב מערכתית במחזור דמוי אינסולין הפפטידים, לספק תמיכה עם מחלות את הנוירונים, כגון המעבורת לקטט אסטרוציט-נוירון, ולחסל נוירונים גוססים על ידי phagocytosis3,4 , 5 , 6. שריכזה בוגרת, עכשיו, דונלד לשמור על BBB, תופסים נוירוטרנסמיטורים לשמור על הומאוסטזיס יוניים, לשמש התאים החיסוניים הגדולות המחלקה שכן המקרופאגים לא יכול לפרוץ BBB, לווסת את פעילות סינפטית, כמו גם התנהגות בעלי חיים6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
אם תתי סוגים שונים גליה לבצע פונקציות מיוחדות נותרת שאלה פתוחה חשוב. עם זאת, ניתוח הגנום כולו שיטתית של עכשיו, דונלד, במיוחד אצל אדם בוגר, יש כבר הקשו על ידי חוסר המתאימה לכלים שלהם מניפולציה גנטית. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת אפיון תא צורות ללמוד אינטראקציות מורכבות תא תא יעיל וקל. טכניקה זו הוחל לאפיין המורפולוגיה של גליה תתי-סוגים שונים במוח דרוזופילה למבוגרים, אבל, בהתאם הנהג GAL4 ספציפי בשימוש, זה יכול להיות מותאם ללמוד נוירונים12,13 , כל סוג של תאים בזה, באופן עקרוני כל רקמות בשלבים התפתחותיים כלשהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-הכנת זבובים לניסויים ססגוניות FlpOut (MCFO)
הערה: MCFO הטכניקה מתייחס גירסה שונה של קלטת בתיווך Flp עצור שנקרא הכריתה (FlpOut). זבובים MCFO הטרנסגניים לשאת מקדם הלם חום (hsp)-Flp recombinase ובקרת כתבים שונים תחת UAS. כל עיתונאי מורכב שדרה משותף של myristoylated (myr) ירוק סופר תיקיה פלורסנט חלבון (sfGFP), בעוד איזה 10 עותקים של תג epitope (למשל., HA, דגל או V5) נוספו. החלבונים הלא-פלורסנט וכתוצאה מכך נקראים " מפלצת הספגטי GFPs " (smGFPs) 14, ניתן להבחין באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד התגים השונים epitope.
- קרוס טס עם הקלטת MCFO, את hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) לקווי המתאים גליה GAL4 מנהל ההתקן (ראה טבלה של חומרים) .
- Hsp פעיל כבר 25 ° c, כמה תאים עשוי לעבור רקומבינציה המוביל תיוג לא ספציפי, להגדיר חוצה ב 18 ° C כדי להימנע leakiness של המערכת. המתן כ- 20 ימים ב 18 ° C כדי להשיג את הדור F1. לאחר החום לחשמל (ראה שלב 2), לשמור על זבובים 25 ° c ( איור 3).
2. מחממים הלם
הערה: בהתאם הכניסה לאתר, היעילות של hsp-Flp עשויים להיות שונים; לכן, הזמן הלם חום אופטימלי חייב להיות מותאם. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש MCFO מניה לטוס בו הוכנס hsp-Flp על כרומוזום ה-X (ראה טבלה של חומרים).
- העברה הוא צאצא של הצלב בשלב 1.1 (F1 דור זבובים, בן 3-4 ימים) לתוך חדש מבחנות שמכילות אוכל וחימום לזעזע אותם ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
הערה: זבובים צעירים (בן 1-2 ימים) רגישים מאוד הלם חום. לחכות 1 או 2 ימים לפני ביצוע ההלם חום על מנת להפחית את שיעור התמותה הנגרמת על ידי הטיפול. שימוש של הדור F1 זבובים כפקד, ללא זעזועים חום. - במהלך הלם חום, לשמור על זבובים בקבוקונים נורמלי עם אוכל על מנת להקטין את שיעור התמותה מפגינות. להכניס נקבות וזכרים נפרד בקבוקונים.
- הקפידו לטבול את המבחנה כולו במים כדי להבטיח הלם חום הומוגניות. השתמש הלם 5-8 דקות כנקודת התחלה מתאימים עבור תיוג דלילה של עכשיו, דונלד תאים עם קווים רבים של הנהג GAL4; משך הלם חייב להיות אופטימיזציה עבור כל מנהל התקן וניסוי (ארוכה או קצרה יותר חום הלם פעמים עשוי להיות נחוץ).
- לאחר הלם חום, להניח את הבקבוקונים אופקית על הספסל לכמה דקות כדי לאפשר את הזבובים להתאושש מההלם חום.
הערה: אין צורך לשנות את הבקבוקונים. - לשמור על הזבובים 25 ° c ומנתחים (ראה שלב 3 ו- 4) אותם ימים 2 או יותר לאחר ההלם חום לביטוי כתב אופטימלית.
3. ניתוח והכנה פתרונות
- היום של הקרע, להכין פתרון מקבע טריים ב 200 µL המבחנות על ידי ערבוב µL 180 S2 תא תרבות בינוני עם 20 µL של 20% paraformaldehyde (PFA) כדי להשיג פתרון מחברים 2%. לשמור על הפתרון מקבע על הקרח לפני ובמהלך את הקרע.
התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות.
הערה: מערבבים µL 160 S2 תא תרבות בינוני עם 40 µL של 20% paraformaldehyde (PFA) בצינור PCR 200 µL כדי להכין פתרון PFA 4% במקום פתרון 2%- - להשתמש שפופרת אחת PCR לכל גנוטיפ עם מקסימום של 8-10 המוח למחזור לקבלת תוצאות מיטביות, מכתימים.
- להכין המוח למבוגרים שטיפה פתרון: 0.5% אלבומין שור, 0.5% X-100 Triton ב- PBS.
הערה: בהתאם ההכתמה, פתרון המכיל 1% טריטון X-100 עשוי להיות נחוץ. ריכוז גבוה יותר של טריטון X-100 מגביר את החדירה של הנוגדן לתוך הרקמה, זה הכרחי לאזורים הכתם שקר עמוק בתוך הרקמה (למשל, סינפטית אזורים במוח דרוזופילה למבוגרים). - להכין את הפתרון חסימה: סרום עז רגיל 3% 3% חמור נורמלית בסרום, 0.5% X-100 Triton ב- PBS.
- המוח למבוגרים שטיפה פתרון והפתרון חסימה שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
- לשים צלחת זכוכית בארות דיכאון עמוק על הקרח ומלא כל טוב עם הפתרונות הבאים: אחד עם 70% אתנול, אחד עם PBS, ואחד S2 תא תרבות בינונית.
4. ניתוח מוחי למבוגרים
- מקם 3 ס לנתח מאכל על הבמה של stereomicroscope ולמלא אותו קר S2 תא תרבות בינוני. לנהל את כל והניתוחים במדיום הזה כדי להבטיח הרקמה יישאר בריא במהלך ההליך לנתיחה.
הערה: תבשיל ויבתר רצוף מספר מילימטרים של סיליקון שחור אשר מספקת קונטרסט רקע טובה (בתמונות) ושימוש לשמר את המלקחיים בזמן. - עזים ומתנגד הזבובים של גנוטיפ הרצוי עם CO 2.
- עם מלקחיים, לתפוס הזבוב על ידי הכנפיים, לשטוף אותה אתנול 70% קר ב-30 s, ואז עם PBS קר ב-30 נוספים ס
- להעביר לטוס לתוך טוב הדיכאון העמוק הממולא S2 תא תרבות בינונית.
- חוזר את ההליך עבור כל הזבובים של גנוטיפ באותה ולתחזק אותם קר S2 תא תרבות בינוני עד לנתיחה, אשר תשמר את הרקמה.
הערה: עזים ומתנגד רק המספר של זבובים יכולים ניסויים תוך פרק זמן של-30 דקות זמן דגירה פעמים ב S2 תא תרבות בינוני עלול לגרום נזק לרקמת. - לתפוס הזבוב עם מלקחיים ויציפו, תחת stereomicroscope, הזבוב במדיום תרבות של S2 תא.
- לנתק את הראש משאר חלקי הגוף. למחוק את הגוף ולשמור את הראש מתחת למים S2 תא תרבות בינוני. . זה מאוד חשוב לי להחזיק את הראש עם מלקחיים לכל משך הקרע. אם הראש מתחיל לצוף, זה יהיה קשה להחזיר אותו ללא פגיעה הרקמה.
- מתחילים את הקרע על-ידי הוצאת עין אחת, בעוד אתה מחזיק את הראש עם מלקחיים אחד לפחות בכל עת. ודא כי הקצה של המלקחיים הוא מתחת הרשתית כדי למנוע פגיעה הרקמה שמתחת. למשוך את העין השנייה, מתחילים להסיר את הקוטיקולה להופעת המוח.
- להסיר כל רקמות והכו אותי ואת לציפורן סביב המוח עד הרקמה נראה נקי. הקפד להסיר את כל הרקמה והכו אותי סביב המוח לקבלת תוצאות מיטביות, צביעת; הרקמות. אתה מוכן להיות קבוע, מוכתם.
- לשמור על כל המוחות ביתור תוך קר S2 תא תרבות בינוני לפני העברת אותם לתוך הפתרון מחברים כדי זמן השלב קיבעון.
5. צביעת המוח למבוגרים
< ol>הערה: טיימס הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הנוגדן בשימוש. Incubations עוד עשוי להיות נחוץ.
- עבור תיוג שלושה סמנים MCFO, דגירה את השכל עם אנטי-HA (שבערך), אנטי-דגל (DYKDDDDK epitope) (1: 100), ואת ראשי נוגדנים anti-V5.
- ראשי ישירות-מצומדת נוגדנים יכול לשמש במקום השילוב הרגיל ראשי + המשני (למשל., אנטי-549 V5:DyLight (1:200)). במקרה זה, לטפל את הנוגדנים ישירות-מצומדת נוגדנים משניים.
הערה: עבור כל גנוטיפ, שמור קצת שכל כפקדי כדי לוודא יחודיות של צביעה. לדלג הדגירה נוגדן ראשוני ולעבור ישירות אל השלב הבא.
הערה: דוגמאות של נוגדנים המתאימים: 488 AlexaFluor (1:250), אנטי-549 V5:DyLight (1:200) ו- DyLight 647 (1: 100)-מצומדת נוגדנים.
6. הרכבה של המוח עבור הדמיה
- חיתוך הדמיה מרווח לגודל המתאים באמצעות מספריים. עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כריך את מרווח הדגימה והדמיה בין שני coverslips זכוכית דקה.
הערה: מפרידי כלי הדמיה הם דקים (0.12 מ"מ עובי) מפרידי דבק זה קלף והדבק על השקופיות coverslips או מיקרוסקופ זכוכית, המאפשר את ההרכבה של דגימות ללא דחיסה. - באמצעות מלקחיים, להסיר דבק אניה ממשטח אחד ולהחיל את מרווח, דבק בצד למטה, על פני השטח של coverslip זכוכית (22 מ"מ x 60 מ"מ). חלות µL 10 של הרכבה בינונית coverslip זכוכית חדשה.
- עם P10 פיפטה, להעביר את המוח מהצינור 200 µL coverslip, ליד הירידה של הרכבה בינונית. יחד עם הרקמות, להעביר כמה PBS על מנת לשמור על המוח בפתרון.
- עם P10 פיפטה, להעביר את המוח מהערוץ ירידת הרכבה בינונית מנסה להגביל את כמות PBS. העבר את דגימות במדיום גובר על coverslip עם מרווח הדמיה. להשתמש במדיה הרכבה מספיק כדי לכסות את הדגימה.
- להסיר דבק אניה אחרים מן הצד העליון של מרווח ולהוסיף coverslip זכוכית על דגימות. עם קצה מלקחיים, חלים לחץ עדין על האזור דבק כדי לאטום. תמונה הרקמות נטענים באופן מיידי או לאחסן את השקופיות ב-20 ° C לניתוח בשלב מאוחר יותר.
7. תמונה רכישת
- רכוש ערימות של תמונות פלורסצנטיות קונאפוקלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם 40 X (NA = 1.2, טבילה במי) אובייקטיבית או 63 X (NA = 1.4, שמן טבילה) המטרה (מידות פיקסלים = 1,024 x 1,024 במישור xy; המרחק בין שני מקטעים קונאפוקלית = 0.5 מיקרומטר). להתאים גלאי ורווח היסט בכל אחד מהערוצים בצורה כזאת, כי אין פיקסלים רווי ומאפסים פיקסל הם נוכח התמונות; זה מונע אובדן מידע ומבטיחה שימוש מלוא הטווח הדינמי של הגלאי.
הערה: מאחר הדמיה תלת-ממד זמן רב, המידות יכול להיות אוטומטי על-ידי סריקה מרובים דגימות במקביל במקומות שונים. כדי למנוע אידוי עם המטרה טבילה במים, להשתמש בשמן מיוחד טבילה בינוני עם השבירה n = 1.33. - לעבד את הערימות קונאפוקלית עבור מאליהם ההקרנות, שינויי גוון ערוץ, וכוונון הבהירות, לעומת זאת באמצעות תוכנות ניתוח תמונה רגילה (ראה טבלה של חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות ניתן להשיג באמצעות הטכניקה MCFO במוח דרוזופילה למבוגרים. איור 3 מראה סכימטי של השיטה. שלושה אחרת מתויג ממברנה עיתונאים (myr-smGFP-אה, myr-smGFP-דגל ו myr-smGFP-V5) תחת שליטה UAS נשמרים שקט מאת בסיים תעתיק ולצדו והשפלתם שני אתרים (והשפלתם-עצור-והשפלתם). דופק הלם החום המניע את הביטוי של Flp recombinase המסירה באופן אקראי הקלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם בתאים בודדים. זה מוביל מערך של תאים בצבעים שונים מסוג תא נתון, שצוין על-ידי מנהל ההתקן GAL4 בשימוש.
הכללית, שבעה צבעים אפשריים. איור 4 איור 5 מראים את מורפולוגיות יחיד של תאים EG ונועה. באונה דרוזופילה antennal (אי אל), בהתאמה. הגדלת זמן הלם החום גורם כמות מוגברת של תאים עם תוויות, בהתאם לסוג ההתקן GAL4, לכן הכרחי לאופטימיזציה הראשונית של פרוטוקול הלם חום. איור 6 מראה על תיוג של EG באונה אופטיים דרוזופילה (OL) עם כתבים MCFO יחיד.
איור 1: אנטומיה של מבוגרים דרוזופילה NS- האזורים קורטיקלית (מנוקדים אזורים אפורים) מכילים כל עצביים, מרבית הגופים תא גליה, ואילו האזורים neuropile (אזורים כחולים) מכילים של קשרים סינפטיים. בדרכי אזורים (כחול כהה) לחבר את neuropiles שונים. דמות זו שונתה מ. קרמר ואח (2017) 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תת גליה כלליים דרוזופילה CNS. מתויג ממברנה GFP (UAS-mCD8-GFP) כתב מונע על ידי מנהלי התקנים ספציפיים GAL4 מאפשר את החזיית סוגי גליה כלליים חמש המשנה (PG: perineurial עכשיו, דונלד, SPG: subperineurial עכשיו, דונלד, CG: קליפת עכשיו, דונלד, נועה: אסטרוציט כמו עכשיו, דונלד, EG: עכשיו, דונלד ensheathing). האזורים מורכב (מגנטה אזורים) מזוהים עם הסמן presynaptic NC82 (BRUCHPILOT). בחלק התחתון, מוצגים גם ספירת עבור תתי סוגים שונים גליה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שיטת החצייה הטכניקה MCFO. תיאור סכמטי של הטכניקה MCFO. Homozygousvirgins נושאת את הקלטת MCFO את hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) הם חצו עם זכרים נהג GAL4 homozygous ספציפיים. הדור F1 הוא ואז חום בהלם. על פי מספר קלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם יוסר באופן אקראי הכתבים, 7 צבעים שונים אפשריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מורפולוגיה של ensheathing עכשיו, דונלד (למשל) באונה antennal (אי אל). קונאפוקלית z-ערימות של דרוזופילה AL לאחר wholemount immunostaining. (א) מורפולוגיה של אל זוהה עם הסמן presynaptic NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) תיוג סטוכסטי של EGcells הנגרמת על ידי הגדלת פעמים הלם חום: 8 דקות (B), 8.5 min (ג) ו- 10 דקות (D). הרווחים EG-רבים בצורות ובגדלים שונים, כפי שהם ensheath פני השטח של Neighboring AL. למשל תאים מכסה תחומים ברורים אבל חלקית interdigitate אזורים של מגע. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. HA: שפעת אנושית hemagglutinin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מורפולוגיה של אסטרוציט כמו עכשיו, דונלד (נועה) באונה antennal (אי אל). קונאפוקלית z-ערימות של דרוזופילה AL לאחר wholemount immunostaining. (א) המורפולוגיה של מלאכותית זוהה עם הסמן presynaptic NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) תיוג סטוכסטי של נועה תאים המושרה על ידי הגדלת פעמים הלם חום: 8 דקות (B), 10 min (ג) ו- 15 דקות (D). נועה הצג גודל המשתנה מורפולוגיות אבל לכסות אזורים במידה רבה שאינם חופפים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. HA: שפעת אנושית hemagglutinin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: מורפולוגיה של ensheathing עכשיו, דונלד (למשל) באונה אופטיים (OL). קונאפוקלית z-ערימות של דרוזופילה OL לאחר wholemount immunostaining. (A-C) MCFO תיוג עם שלושה עיתונאים עצירה-מגרות עם HA, דגל V5 myr-smGFPs. Flp recombinase היה המושרה על ידי הלם חום 10 דקות ב 37 º C. (A-C) כתבים MCFO בודדים מיזוג (D) מוצגים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. HA: שפעת אנושית hemagglutinin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה נוחה ויעילה ללמוד המורפולוגיה של סוגי תאים שונים בתוך רקמה עניין ברזולוציה גבוהה. עם הטכניקה MCFO, כתבים מרובים עם תגי epitope שונים משמשים בשילוב של תיוג סטוכסטי ססגוניות (איור 2). בדומה בשיטות אחרות כגון Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO מגביר את הגיוון התווית דרך סמן coexpression, המאפשר את הפריט החזותי של תא לגבולות התא ללימודי אינטראקציה עם תא-תא. לדוגמה, עם שלושה עיתונאים, 7 צירופים אפשריים של סמן אפשריות. לעומת שיטות תיוג קודמות, הטכניקה MCFO מראה פקד קל ומדויק יותר של התא תיוג צפיפות17: זבובים Flybow 1.0 אקספרס סמן ברירת המחדל שגורם לתא בודד תיוג קשה יותר; Flybow 2.0 זבובים דורשות הביטוי של שני recombinases שונים Flp הפיכת המערכת מורכבת יותר.
בהתאם הנהג GAL4 ספציפיים השתמשו, הטכניקה MCFO עשוי להיות מותאם כדי ללמוד כל רקמות בכל שלב התפתחותי. . הנה, הטכניקה הוחל לאפיין המורפולוגיה של סוגי גליה כללי המשנה במוח דרוזופילה למבוגרים ברזולוציה גבוהה. תיוג ססגוניות של תאים בודדים מאפשרת את הפריט החזותי של הגבולות השונים ומסייעת להבין, לדוגמה, את האינטראקציה המרחבית בין שני תאים סמוכים; מלבד התאים PNG ו- SPG, אשר נועדו טופס epithelia, כל סוגי גליה אחרים להראות ריצוף, זה הם למזער מגע עם שכניהם גליה, תוך מיקסום קשר עם תא עצביים מעטפת (תאי הגוף, האקסונים, דנדריטים, ו הסינפסות). כולם לשלוח תהליכים lamellipodial או filopodial בסדר גמור לא רק לשכונה המקומי שלהם, אלא גם אל תוך הסביבה מרוחק18.
על ההצלחה של פרוטוקול זה, חשוב לבוא מאחור זבובים ב 18 ° C כדי להימנע leakiness במערכת. כאשר ויבתר לאורך כל תהליך צביעת, חשוב למנוע נזק לרקמות לקבלת תוצאות מיטביות, מוכתמים. לבסוף, יש שני היבטים טכניים להיחשב: הזמן הלם חום מגדיר את כמות התאים אשר באים לידי ביטוי את התגים. הלם חום קצר יוביל תיוג של כמה תאים, בעוד הלם חום רב יניעו את הביטוי של תגיות בתאים רבים עד המקרה הקיצוני שבו כל קלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם יוסרו מן הכתבים, בתוך כל התאים. במקרה זה, בצבע אחד בלבד (המיזוג של שלושה תגי epitope) להיות נוכחים, מניעת הפריט החזותי של תא בודד מורפולוגיות הפעם הלם חום משתנה בהתאם האתר ההכנסה של hsp-Flp ואת הנהג GAL4, ולכן שלב אופטימיזציה הראשוני עשוי להיות נחוץ. הביטוי סמן אקראי, לא יכול להיות ממוקד subpopulation ספציפיים של תאים מונחה על ידי מנהל ההתקן GAL4. בתוך תא אחד, תגיות שונות יכול להתבטא המאפשרים את הנוגדן. ההכתמה של השכנה תאים עם צבעים שונים. עם זאת, לעיתים, יותר מתגית אחת מתבטאת בתא אחד שמוביל החפיפה של שני הצבעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף אחד מחברי יש אינטרסים מתחרים או סותר.
Acknowledgments
המחברים תודה ארנים Jenett Aljoscha Nern, חברים אחרים של המעבדה רובין לקבלת ייעוץ ושיתוף של ריאגנטים שלא פורסמו, Janelia לטוס אור צוות הפרוייקט ליצירת תמונות קונפוקלי. המחברים גם תודה חברי המעבדה גאליה להערות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P.
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
