Summary
細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA 式システムを使用して、細胞間相互作用を調査する方法について説明します。
Abstract
セルには、異なる形態と複雑な解剖学的関係が表示されます。細胞彼らの隣人との対話の方法相互作用は細胞のタイプ間または特定の種類の内であっても異なる?彼らは空間のルールの種類が従うか。このような基本的な質問体内への回答は、これまでのところ高解像度 1 つのセルのラベルのためのツールの欠如によって妨げられています。ここでは、多色 FlpOut (MCFO) を用いた単一細胞をターゲットに詳細なプロトコルを提供しています。このメソッドは、3 つ異なるタグ記者 (HA、旗、V5) UA 制御の下で 2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターで静かに保管されているに依存します。熱衝撃パルスは、個々 の細胞における FRT 停止 FRT カセットをランダムに削除する熱衝撃波の Flp リコンビナーゼの発現を誘導する: 式は、GAL4 ドライバーを表すセルでのみ発生します。これは、高解像度で個々 の細胞の形態の可視化を可能にする特定の細胞型の別様に着色されたセルの配列に します。例として、MCFO 技術は大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を視覚化するための特定のグリア GAL4 ドライバーと組み合わせることができます。
Introduction
グリア細胞、神経系 (NS) の非神経細胞集団はニューロンの静的なフレームワークを提供するために長い間信じられていた、したがって詳細に至りませんでした。ただし、ヒトでは、グリアは NS (~ 90%) のセルの大部分を構成する、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア、シュワン細胞を含むいくつかの異なるカテゴリに分類されます。ショウジョウバエグリアは、NS で細胞の約 10% を構成します。興味を持って、その形態と機能が脊椎動物1,2で見つけられるそれらに非常に類似します。その形態には、血液脳関門 (BBB) アストロ サイト様細胞、神経鞘、上皮形成が含まれます。
ショウジョウバエ中枢神経系 (CNS) は次の主構造体で構成されています:; 神経細胞の細胞体を含む皮質領域ハーバーのシナプス接続 neuropils接続別 neuropiles; 小規模および大規模な軸索路(図 1) 中枢神経系と感覚器官や筋肉を接続する末梢神経。すべてのこれらの解剖学的構造に関連付けられているグリア細胞が見つかった: 皮質領域、アストロ サイトのようなグリア細胞 (ALG), 脊髄グリア細胞 (EG) 構造の領域、脊髄グリア細胞の皮質グリア (CG) は中央軸索路と周辺機器に関連付けられているも神経 (EGN)、そして最後に、グリア細胞シートのような 2 つ、perineurial グリア (PG) と subperineurial (SPG)、これは一緒に全体の NS (図 2) をカバーする連続した層を形成します。
前の研究は、そのグリアを示されている; NS の開発に重要な役割を果たすインスリン様ペプチドを全身循環に反応して神経細胞の数を監視、ニューロン、グリア-ニューロン乳酸シャトルなどに栄養サポートを提供して貪食3,4で死にかけている神経細胞を排除,5,6成熟した NS でグリア BBB を維持、神経伝達物質を取るとイオンの恒常性を維持、マクロファージできません、BBB に違反し、動物の行動の6と同様、シナプスの活性を調節するので、NS で主要な免疫細胞として機能。,7,8,9,10,11。
グリア細胞のサブタイプが異なるが特殊な機能を実行するかどうか重要な未解決の問題に残る。ただし、成体における特にグリア細胞の体系的なゲノム解析は、その操作に対応する遺伝的ツールの欠如によって妨げられています。ここでは、複雑な細胞間相互作用を研究するセル形状の効率的かつ簡単な評価を可能にする手法を提案します。この手法は、大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を特徴付けるに適用されていますが、ニューロン12,13 を研究に使用される特定の GAL4 ドライバー、に応じて合わせることができます。、混ざり細胞と原則としていかなる任意の発達段階内の任意組織。
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Protocol
1。 多色 FlpOut (MCFO) 実験用のハエの準備
注:、MCFO 技術と呼ばれる Flp を介した停止カセット切除 (FlpOut) の修正バージョンを指します。MCFO ハエの遺伝子を運ぶ熱ショック プロモーター (hsp)-Flp リコンビナーゼや UA の下で別の記者を制御します。各レポーターから成っているエピトープ タグを 10 枚でにおける (myr) スーパー フォルダー緑色蛍光蛋白質 (sfGFP) の共通バックボーン (e.g。、HA、旗または V5) が挿入されています。結果の非蛍光性タンパク質は、名前付き " スパゲッティ モンスター受けた " (smGFPs) 14 と異なるエピトープ タグに対して特定の抗体を使用して検出することができます
。- クロス MCFO カセットと hsp Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) (材料表参照) 適切なグリア GAL4 ドライバー行へ飛ぶ.
- Hsp が 25 ° C でアクティブになって、いくつかの細胞が非特異的ラベル付けにつながる再結合を受ける可能性がありますは、水漏れしたため、システムを避けるために 18 ° C の交点を設定します。F1 世代を取得する 18 の ° C で約 20 日間を待ちます。熱後 (手順 2 を参照) に衝撃を与える、25 ° C ( 図 3) でハエを維持します 。
2。衝撃を熱
注: 挿入部位によって hsp Flp の効率は異なります; したがって、最適な熱衝撃時間が最適化するようにしました。このプロトコルでは、hsp Flp が X 染色体に挿入された MCFO フライのストックが使われています (材料の表 を参照してください).
- 転送の子孫ステップ 1.1 十字架 (F1 世代ハエ、3-4 日古い) 食品と熱を含む新しいバイアルには、37 の ° C の水浴中で彼らを驚かせた
。 注: 若いハエ (1-2 日古い)、熱衝撃に非常に敏感。1 または 2 の治療による死亡率を減らすためにヒート ショックを実行する前より多くの日を待ちます。F1 世代のいくつかは熱ショックなしのコントロールとして飛ぶ使用します 。
- 熱ショック時のストレスによる死亡率を減少させるために食物と一緒に普通のバイアルにハエを維持します。女性と男性、別のバイアル 。
- 均一熱ショックのように水に全体のバイアルを浸すことを確認してください。適切な出発点として多く GAL4 ドライバー行とグリア細胞の疎ラベルに 5-8 分ショックを使用します。ショック期間に各ドライバーおよび実験 (短いまたは長い熱衝撃時間が必要になる場合があります) の最適化しなければなりません 。
- 熱衝撃から回復するハエを許可するために数分間ベンチに水平にバイアルを置く熱ショック後
。 注: バイアルを変更する必要はありません 。
- 25 ° C でハエを維持し、解剖 (手順 3 と 4 を参照してください) に最適な記者式の熱ショック後の日が 2 以上 。
3。解剖準備およびソリューション
- 、解剖の日は、20% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 %pfa 解を得るための 20 μ L で S2 細胞培養液 180 μ L を混合することによって 200 μ L の PCR チューブに新鮮な固定液を準備します。前に、解剖中に氷の上固定液を維持します
。 注意: PFA は毒性があり注意して処理する必要があります
。 注: を混ぜて 2% 溶液の代わりに 4 %pfa ソリューションを準備する 200 μ L の PCR チューブで 20% パラホルムアルデヒド (PFA) の 40 μ L 160 μ L の S2 細胞培養培地 。
- 最適な染色結果最大管あたり 8-10 脳の遺伝子ごとの 1 つの PCR チューブを使用します 。
- ソリューションを洗う大人の脳の準備: 0.5% 0.5% ウシ血清アルブミン PBS でトリトン X-100
。 注: 染色液 1% トリトン X-100 を必要ことがあります。トリトン X-100 の高濃度増加抗体の組織への浸透と、深い組織 (大人の ショウジョウバエ 脳におけるシナプス領域 など) の内側にある染色領域する必要がある 。
- ブロック ソリューションを準備: 3% ヤギ血清, 3% 通常ロバ血清と 0.5 %pbs でトリトン X-100 。
- 洗浄ソリューションとブロッキング液成人の脳を数週間の 4 ° C で保存ことができます 。
- 氷の上の深いうつ病井戸ガラス板を置くし、フィル各次のソリューションとも: pbs と S2 細胞培養培地使用の 70% エタノール 1 つ 。
4。大人の脳解剖
- 3 cm の皿を解剖顕微鏡のステージ上の位置し、冷たい S2 細胞培養培地でそれを埋めます。解剖手順中に組織が健康な状態であることを確認するこの中にすべての解剖を実施します
。 注: ブラック シリコーン (イメージ) で良い背景のコントラストを提供する複数のミリメートルと並んで解剖皿を使用し、解剖時に鉗子を保持します 。
- CO 2 と目的遺伝子型のハエを麻酔します 。
- 鉗子、翼で飛ぶをつかむ 30 の冷たい 70% エタノールで洗うと s 追加 30 冷 PBS とし、s.
- S2 細胞培養液で満たされている井戸の深い不況に、フライを転送します 。
- 同じ遺伝子型のすべてのハエについて同じ手順を繰り返します、解剖、組織を保持するまで冷たい S2 細胞培養培地でそれらを維持します
。 注: 麻酔だけで S2 セル培地の培養時間が長く約 30 分の時間内に解剖することができますハエの数はティッシュを傷つけることがあります 。
- 鉗子でハエをつかむし、顕微鏡下で S2 細胞培養培地でその場が水没します 。
- は、体の残りの部分から頭をデタッチします。体を破棄し、S2 細胞培養液中に浸漬頭を維持します。解離の全体の持続期間のための鉗子で頭を保持するために非常に重要です。組織を損傷することがなく取得することは困難であろう頭にフロートする起動する場合 。
- は、すべての回で、少なくとも 1 つの鉗子で頭を押しながら 1 つ目を引いて、郭清を開始します。鉗子の先端は避けるために網膜のすぐ下の損傷の下に組織されていることを確認します。もう片方の目を抜くし、脳が表示されるまでにキューティクルを削除を開始します 。
- は、すべての気管組織と脳の周りの表皮組織がきれいに表示されますまでを削除します。最適な染色結果を得る脳の周りのすべての気管組織を削除することを確認します。組織は固定し、染色する準備が整いました 。
- タイム固定ステップするために PFA ソリューションに転送する前に冷たい S2 解剖脳細胞の培維持します 。
5。大人の脳の染色
< ol>。 注: インキュベーション時間は、使用される抗体の種類によって異なる場合があります。長い孵化必要があります。
- 3 MCFO マーカーのラベルは、アンチの頭脳を孵化させなさい-HA (1: 500)、反フラグ (DYKDDDDK epitope) (1: 100) と反 V5 一次抗体 。
- プライマリ直接された抗体は通常プライマリ + セカンダリの組み合わせの代わりにされる可能性があります (e.g。、反-V5:DyLight 549 (レバレッジ))。この場合、二次抗体と直接標識抗体を処理します
。 注: 各遺伝子型の染色の特異性を確認するためのコントロールとして、いくつかの脳をしてください。一次抗体の孵化をスキップし、次の手順に進みます 。
注: 適切な抗体の例: AlexaFluor 488 (1: 250) 反-V5:DyLight 549 (レバレッジ) と DyLight (1: 100) 647-標識抗体
6。脳のイメージング用マウント
はさみを使用して適切なサイズに- トリム イメージングのスペーサー。高分解能顕微鏡の 2 つのガラス coverslips 間標本とイメージングのスペーサーをサンドイッチします
。 注: イメージング スペーサーは薄い (0.12 mm 厚) 供試体圧縮なしの実装可能皮およびガラス coverslips または顕微鏡のスライドする棒を接着スペーサー 。
- 使用鉗子は 1 つの表面から接着性ライナーを取り外してガラス カバーガラス (22 mm × 60 mm) の表面にスペーサー、ダウン、接着面を適用します。メディアをマウントの 10 μ L を新しいガラス基板に適用します 。
- で、P10 のピペットは、メディアをマウントの横にある、coverslip に 200 μ L 管から脳を転送します。一緒に組織ソリューションで脳を維持するためにいくつかの PBS を転送します 。
- で、P10 のピペットは、PBS の量を制限しようとすると、メディアをマウントのドロップに PBS から脳を移動します。イメージングのスペーサーと coverslip でメディアをマウントで標本を転送します。見本をカバーするのに十分なメディアをマウントを使用します 。
- は、スペーサーの上から他の接着性ライナーを取り外して、標本上にガラス基板を追加します。鉗子の先端でシール接着領域の上穏やかな圧力を適用します。すぐにマウントされている組織を画像または後で分析のための-20 ° C でスライドを保存します 。
7。画像取得
- 40 X を用いた共焦点顕微鏡共焦点蛍光画像の取得スタック (NA = 1.2、水浸漬) 目的または 63 X (NA = 1.4、オイルの液浸) 目的 (ピクセル サイズ = 1,024 x 1,024 xy 平面で共焦点の 2 つのセクション間の距離 = 0.5 μ m)。検出器ゲインとない飽和ピクセルとピクセル値は、画像内に存在するように各チャネルのオフセットを調整します。これは情報の損失を回避し、検出器のダイナミック レンジの使用を保証します
。 注: 3 D イメージングは時間がかかるため、測定値は別の場所で同時に複数のサンプルをスキャンすることによって自動化できます。水浸対物レンズで蒸発を防ぐには、屈折率 n と特別な油浸漬媒体を使用して = 1.33 。
- チャネル色相と輝度の調整に変更、最大密度予測の共焦点スタックを処理し、標準的な画像解析ソフトウェアを使用して対照的 (材料の表 を参照してください).
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Representative Results
このセクションでは、大人のショウジョウバエ脳における MCFO 技術を使用して得られる結果の例を示しています。メソッドの概略図を図 3に示します。3 異なる膜タグ記者 (myr smGFP HA、myr smGFP フラグ myr smGFP V5) UA コントロールの下で、2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターが黙っていた。熱衝撃パルスは、個々 の細胞における FRT 停止 FRT カセットをランダムに削除する Flp リコンビナーゼの発現を誘導します。これは使用される GAL4 ドライバーで指定された特定のセル型の別様に着色されたセルの配列に します。
全体的に七色が可能。図 4と図 5でショウジョウバエ触角葉 (AL) の EG と ALG のセルの 1 つの形態をそれぞれ示しています。したがって熱衝撃プロトコルの最初の最適化が必要な GAL4 ドライバーの種類によって、ラベル付きの細胞量の増加を誘導熱衝撃時間の増加します。図 6は、ショウジョウバエ視葉 (OL) の単一の MCFO 記者と EG のラベルを示します。
図 1: 解剖学大人のショウジョウバエNS 。皮質 (点線の灰色の領域) では、シナプス接続を含む構造領域 (青い部分)、すべての神経細胞とグリア細胞体のほとんどが含まれています。管地域 (紺) は、別の neuropiles を接続します。この図は、クレーメルらから変更されています。(2017)18.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:ショウジョウバエ中枢神経系における汎用グリア細胞サブタイプ。特定 GAL4 ドライバーによって駆動膜タグ (UA-mCD8-GFP) GFP レポーター 5 汎用グリア細胞サブタイプの描出が可能 (PG: SPG perineurial グリア: subperineurial グリア、CG: 皮質グリア、ALG: アストロ サイトのようなグリア細胞、EG: 脊髄グリア)。神経領域 (マゼンタ領域) は、NC82 (BRUCHPILOT) のシナプス前のマーカーで検出されます。下部には、別のグリア細胞のサブタイプの細胞数も示されます。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: MCFO 技術の交差方式。MCFO 法の模式図。Homozygousvirgins MCFO カセットと hsp Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) を運ぶ特定のホモ GAL4 ドライバー男性と交差しています。F1 世代、熱ショックになります。記者からランダムに削除 FRT 停止 FRT カセットの数によると、7 つの異なる色が可能です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 触角葉 (AL) における脊髄グリア細胞 (EG) の形態。共焦点 z スタックショウジョウバエアルの wholemount 染色後。(A) 形態の AL NC82 (BRUCHPILOT) のシナプス前のマーカーを検出します。(B D)熱衝撃時間の増大による EGcells の確率表示: 8 分 (B)、(C) 8.5 分および 10 分 (D)。EG 取る多くの異なった形およびサイズ、彼らとして ensheath ら近隣の表面など細胞の接触の地域では部分的にされ、異なる分野をカバー。スケール バー = 20 μ m. ハ: 人間のインフルエンザ血球凝集素。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 触角葉 (AL) におけるアストロ サイトのようなグリア細胞 (ALG) の形態。共焦点 z スタックショウジョウバエアルの wholemount 染色後。シナプス マーカー NC82 (BRUCHPILOT) と AL の形態を (A) が検出されました。(B D)熱衝撃時間の増大による ALG 細胞の確率的分類: 8 分 (B)、(C) 10 分と 15 分 (D)。ALG を可変サイズと形態が大きく重ならない領域をカバーしています。スケール バー = 20 μ m. ハ: 人間のインフルエンザ血球凝集素。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 脊髄グリア細胞 (EG) 光葉 (OL) の形態。共焦点 z スタックショウジョウバエOL の wholemount 染色後。(A ~ C)MCFO myr smGFPs HA、フラグ V5 と 3 停止カセット記者とラベル付けします。37 ° C で 10 分間熱ショックによる Flp リコンビナーゼ(A ~ C)個々 の MCFO 記者とマージ (D) のとおりです。スケール バー = 20 μ m. ハ: 人間のインフルエンザ血球凝集素。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、高解像度で興味の組織内の別のセル型の形態を研究する簡単で効率的な方法について説明します。MCFO を用いた異なるエピトープ タグで複数の記者は多色確率ラベル (図 2) の組み合わせで使用されます。Brainbow/Flybow15,16,17などの他のメソッドと同様に、MCFO よりラベル多様化マーカー共発現による細胞間相互作用研究のためのセル境界の視覚化を許可します。たとえば、3 つの記者、7 つの潜在的なマーカーの組み合わせが可能です。以前のラベル付け方法と比較して、MCFO 技術は、細胞密度17をラベリングのより正確かつ簡単コントロールを示しています: 単一細胞ラベリングより困難である場合は、デフォルトのマーカーを明示 Flybow 1.0 ハエFlybow 2.0 ハエより複雑なシステムを作る 2 つの異なる Flp リコンビナーゼの発現が必要があります。
によって使用される特定の GAL4 ドライバー、MCFO 技術は、あらゆる発達段階での任意の組織を研究に適応させること。ここでは、テクニックは、高解像度で大人のショウジョウバエ脳における汎用グリア細胞サブタイプの形態の特性に適用されています。単一セルの多色ラベル付けにより、異なる境界線の可視化と、たとえば、2 つの隣接するセル間の空間的相互作用を理解するのに役立ちます他のグリア細胞サブタイプのすべて表示タイル、フォーム上皮には、PNG および SPG の細胞から離れてそれはエンベロープの神経細胞コンパートメントとの接触を最大化しながら、グリアの隣人が付いている接触を最小に (細胞体、軸索、樹状突起とシナプス)。彼らはすべては、彼らの地元の近所にだけでなく、遠い周辺18に罰金葉状または filopodial プロセスを送信します。
このプロトコルの成功は、システムで水漏れしたためを避けるために 18 ° C でハエをリアに不可欠です。解離と汚損プロシージャ全体で、最適な染色結果を得るのための組織への損傷を避けるために重要です。最後に、2 つの技術的な側面が考慮されなければならない: 熱衝撃時間タグを表現する細胞の量を定義します。短いヒート ショックは、長い熱ショックがタグのすべてのセルで、記者団から削除されますすべての FRT 停止 FRT カセットで極端なケースまで多くの細胞での発現を誘導しながら、いくつかのセルのラベルに します。この場合、1色のみ (3 つの epitope の札のマージ) が存在する、単一細胞の形態の可視化を防止します。熱衝撃時間は、したがって最初の最適化手順必要があります hsp Flp と GAL4 ドライバーの挿入部位によって異なります。マーカー式はランダムであり、GAL4 ドライバーによって駆動される細胞の特定の集団を対象にはできません。1 つのセル内で隣接する色が異なる細胞の抗体の汚損を有効にする別のタグを表現できます。ただし、場合によっては、1 つ以上のタグは 2 色の重複につながる 1 つのセルで表現されます。
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Disclosures
作者は、競合または競合する興味を持ちます。
Acknowledgments
著者は、アルニム Jenett、Aljoscha ナーンサイ、アドバイスのルービン研究室の他のメンバーと未発表試薬および共焦点画像を生成するため Janelia 飛ぶ光プロジェクト チームの共有をありがちましょう。著者も原稿のコメントをガリア研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
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