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Behavior

Drosophila में Glia के उच्च संकल्प एकल कोशिका Morphologies और सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बहुरंगा FlpOut तकनीक का अनुप्रयोग

Published: October 20, 2017 doi: 10.3791/56177
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Gene Center and Department of Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Janelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

Summary

कोशिकाओं को अलग morphologies प्रदर्शन और अपने पड़ोसियों के साथ बातचीत की एक किस्म की स्थापना । इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे एकल कक्षों की आकृति विज्ञान प्रकट करने के लिए और अच्छी तरह से स्थापित Gal4/यूएएस अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग करके कक्ष-कक्ष सहभागिता की जांच करने के लिए ।

Abstract

कक्ष भिंन morphologies और जटिल संरचनात्मक संबंध प्रदर्शित करते हैं । कैसे कोशिकाओं को अपने पड़ोसियों के साथ बातचीत करते हैं? क्या इंटरैक्शन कक्ष प्रकारों के बीच या किसी दिए गए प्रकार में भी अलग होते हैं? वे किस प्रकार के स्थानिक नियमों का पालन करते हैं? vivo में ऐसे फंडामेंटल सवालों के जवाब अब तक हाई रेजोल्यूशन सिंगल सेल लेबलिंग के लिए उपकरणों की कमी से बाधा बने हुए हैं । यहां, एक बहुरंगा FlpOut (MCFO) तकनीक के साथ एकल कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है । इस विधि तीन अलग टैग रिपोर्टर पर निर्भर करता है (हा, झंडा और V5) यूएएस नियंत्रण है कि एक transcriptional टर्मिनेटर दो FRT साइटों (FRT-stop-FRT) द्वारा पार्श्व द्वारा मौन रखा जाता है के तहत । एक गर्मी सदमे पल्स एक गर्मी सदमे प्रेरित Flp recombinase की अभिव्यक्ति लाती है, जो बेतरतीब ढंग से FRT-स्टॉप-FRT कैसेटों को व्यक्तिगत कक्षों में निकालता है: अभिव्यक्ति केवल उन कक्षों में होती है जो किसी GAL4 ड्राइवर को भी व्यक्त करते हैं. यह किसी दिए गए कक्ष प्रकार के भिंन रंग के कक्षों की सरणी की ओर जाता है जो उच्च रिज़ॉल्यूशन पर व्यक्तिगत कक्ष morphologies के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है । एक उदाहरण के रूप में, MCFO तकनीक विशिष्ट glial GAL4 चालकों के साथ जोड़ा जा सकता है वयस्क glial मस्तिष्क में विभिंन Drosophila उपप्रकार के morphologies कल्पना ।

Introduction

Glia, गैर न्यूरॉन्स तंत्रिका तंत्र के सेल जनसंख्या (एन एस), लंबे समय के लिए न्यूरॉन्स के लिए एक स्थिर ढांचा प्रदान करने के लिए माना जाता था और इसलिए विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया. हालांकि, मनुष्यों में, glia एन एस में कोशिकाओं के विशाल बहुमत का गठन (~ ९०%) और astrocytes, oligodendrocytes, microglia और Schwann कोशिकाओं सहित कई विभिन्न श्रेणियों में गिर जाते हैं । Drosophilaमें, glia के बारे में 10% की एन एस में कोशिकाओं का गठन । साज़िश, उनके morphologies और कार्य उल्लेखनीय रीढ़1,2में पाया उन लोगों के समान हैं । उनके morphologies रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) बनाने epithelia, ensheathing, और astrocyte की तरह कोशिकाओं में शामिल हैं ।

Drosophila केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) निंनलिखित प्रमुख संरचनाओं के होते हैं: प्रांतस्था क्षेत्रों है कि न्यूरॉन कोशिका निकायों में शामिल; neuropils कि हार्बर synaptic कनेक्शन; छोटे और बड़े axon पथ जो विभिन्न neuropiles को जोड़ते हैं; परिधीय नसों कि सीएनएस के साथ संवेदी अंगों और मांसपेशियों को जोड़ने (चित्रा 1). Glia इन सभी संरचनात्मक संरचनाओं के साथ जुड़े पाए जाते हैं: cortical क्षेत्रों में प्रांतस्था Glia (सीजी), astrocyte जैसे Glia (ALG) और ensheathing Glia (जैसे) neuropile क्षेत्रों में ensheathing Glia भी केंद्रीय axon इलाकों और परिधीय के साथ जुड़े हुए हैं नसों (EGN), और अंत में, दो शीट की तरह glia, perineurial glia (स्नातकोत्तर) और subperineurial (एसपीजी) है, जो एक साथ एक निरंतर परत है कि पूरे एन एस (चित्रा 2कवर) के रूप में ।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि glia एन एस के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; वे इंसुलिन की तरह पेप्टाइड्स घूम प्रणालीबद्ध करने के लिए प्रतिक्रिया द्वारा न्यूरॉन सेल संख्या की निगरानी, न्यूरॉन्स के लिए पौष्टिकता समर्थन प्रदान करते हैं, इस तरह के astrocyte के रूप में न्यूरॉन्स स्तनपान शटल, और phagocytosis द्वारा मरने न्यूरॉन्स को खत्म3,4 , 5 , 6. परिपक्व एन एस में, glia BBB बनाए रखने, न्यूरोट्रांसमीटर लेने और ईओण homeostasis, एनएस में प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में कार्य को बनाए रखने के बाद से मैक्रोफेज BBB भंग नहीं कर सकते, और synaptic गतिविधि और साथ ही पशु व्यवहार मॉडुलन6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.

क्या विभिंन glial उपप्रकार विशेष कार्य प्रदर्शन एक महत्वपूर्ण खुला सवाल रहता है । हालांकि, glia के एक व्यवस्थित जीनोम व्यापक विश्लेषण, विशेष रूप से वयस्क में, उनके हेरफेर के लिए उपयुक्त आनुवंशिक उपकरणों की कमी से प्रभावित किया गया है । यहां, एक विधि है कि सेल आकार के कुशल और आसान लक्षण वर्णन करने के लिए जटिल सेल सेल बातचीत अध्ययन प्रस्तुत किया है की अनुमति देता है । इस तकनीक को वयस्क Drosophila मस्तिष्क में विभिंन glial उपप्रकार की आकृति विज्ञान की विशेषता के लिए लागू किया गया है, लेकिन, विशिष्ट GAL4 चालक के आधार पर इस्तेमाल किया, यह अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ंयूरॉंस12,13 , मिश्रित कोशिकाओं के किसी भी प्रकार, और सिद्धांत किसी भी विकास के चरणों में किसी भी ऊतक.

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. बहुरंगा के लिए मक्खियों की तैयारी FlpOut (MCFO) उपाययोजना

< p class = "jove_content" > नोट: MCFO तकनीक तथाकथित Flp के एक संशोधित संस्करण को संदर्भित करता है-मध्यस्थता रोक कैसेट उत्पाद (FlpOut) । ट्रांसजेनिक MCFO मक्खियों एक गर्मी सदमे प्रमोटर (hsp) ले-Flp recombinase और यूएएस नियंत्रण के तहत विभिंन पत्रकारों । प्रत्येक रिपोर्टर एक myristoylated (myr) सुपर फ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (sfGFP), जिसमें एक epitope टैग ( उदा ., हा, ध्वज या V5) की 10 प्रतियां सम्मिलित किया गया है की एक आम रीढ़ की होती हैं । परिणामस्वरूप गैर फ्लोरोसेंट प्रोटीन का नाम & #34; स्पेगेटी मॉन्स्टर GFPs & #34; (smGFPs) < सुप क्लास = "xref" > 14 और अलग epitope टैग के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है ।

  1. पार MCFO कैसेट और hsp के साथ मक्खियों-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-रोक-FRT-myr-smGFP-हा, 10XUAS-FRT-रोक-FRT-myr-smGFP-झंडा, 10XUAS-FRT-रोक-FRT-myr-smGFP-V5) को उपयुक्त glial GAL4 चालक रेखाएँ (सामग्री की तालिका देखें) .
    1. के रूप में hsp पहले से ही 25 & #176 पर सक्रिय है; सी और कुछ कोशिकाओं को एक विशिष्ट लेबलिंग के लिए अग्रणी पुनर्संयोजन से गुजरना हो सकता है, सेट अप पार 18 & #176; सी व्यवस्था के leakiness से बचने के क्रम में । करीब 20 दिनों तक इंतजार करें 18 & #176; C F1 जनरेशन को प्राप्त करने के लिए । गर्मी के झटके के बाद (चरण 2 देखें), 25 पर मक्खियों को बनाए रखें & #176; ग (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ ).
< p class = "jove_title" > 2. हीट शॉक

< p class = "jove_content" > नोट: सम्मिलन साइट के आधार पर, hsp-Flp की दक्षता भिन्न हो सकती है; इसलिए, इष्टतम गर्मी सदमे समय के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए है । इस प्रोटोकॉल के लिए, एक MCFO मक्खी शेयर जिसमें एक्स गुणसूत्र पर hsp-Flp डाला गया है इस्तेमाल किया गया है (देखें सामग्री की मेज ) ।

  1. चरण १.१ में क्रॉस की संतति अंतरण (F1 जनरेशन मक्खियों, 3-4 दिन पुरानी) भोजन और गर्मी से युक्त नई शीशियों में उंहें ३७ & #176 में एक पानी के स्नान में; सी ।
    नोट: युवा मक्खियों (1-2 दिन पुराने) बहुत सदमे गर्मी के प्रति संवेदनशील हैं । उपचार की वजह से मृत्यु दर को कम करने के लिए गर्मी झटका प्रदर्शन से पहले 1 या 2 अधिक दिनों तक प्रतीक्षा करें । का प्रयोग करें F1 पीढ़ी के कुछ एक नियंत्रण के रूप में मक्खियों, गर्मी सदमे के बिना ।
    2. गर्मी के झटके के दौरान
  2. , भोजन के साथ सामांय शीशियों में मक्खियों को बनाए रखने के क्रम में तनाव प्रेरित मृत्यु दर की कमी है । मादा और नर को अलग शीशियों में डाल दें.
  3. एक सजातीय गर्मी सदमे सुनिश्चित करने के लिए पानी में पूरी शीशी विसर्जित करने के लिए सुनिश्चित करें । कई GAL4 चालक लाइनों के साथ glia कोशिकाओं की विरल लेबलिंग के लिए एक उपयुक्त प्रारंभिक बिंदु के रूप में एक 5-8 मिनट सदमे का उपयोग करें; सदमे की अवधि प्रत्येक ड्राइवर और प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए (कम या ज्यादा गर्मी सदमे बार आवश्यक हो सकता है).
  4. गर्मी सदमे के बाद, एक कुछ मिनट के लिए बेंच पर क्षैतिज शीशियों रखना क्रम में मक्खियों गर्मी सदमे से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए ।
    नोट: यह शीशियों को बदलने के लिए आवश्यक नहीं है ।
  5. 25 & #176 पर मक्खियों को बनाए रखने; सी और टुकड़े (चरण 3 और 4 देखें) उंहें इष्टतम रिपोर्टर अभिव्यक्ति के लिए गर्मी सदमे के बाद 2 या अधिक दिनों ।
< p class = "jove_title" > 3. विच्छेदन तैयारी और समाधान

  1. के दिन विच्छेदन, २०० & #181 में नए सिरे से निर्धारण समाधान तैयार करें; l पीसीआर ट्यूबों को मिलाकर १८० & #181; l के साथ S2 सेल कल्चरल मीडियम का 20 & #181; l का 20% paraformaldehyde (पीएफए) प्राप्त करने के लिए 2% पीएफए समाधान. विच्छेदन के पहले और दौरान बर्फ पर निर्धारण समाधान बनाए रखें ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    नोट: Mix १६० & #181; S2 सेल कल्चरल मीडियम के साथ ४० & #181; l के 20% paraformaldehyde (पीएफए) मे एक २०० & #181; l पीसीआर ट्यूब 2% समाधान के बजाय एक 4% पीएफए समाधान तैयार करने के लिए.
  2. का उपयोग एक जीनोटाइप प्रति पीसीआर ट्यूब इष्टतम धुंधला परिणाम के लिए ट्यूब प्रति 8-10 दिमाग की एक अधिकतम के साथ ।
  3. तैयार वयस्क मस्तिष्क धुलाई समाधान: ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, ०.५% ट्राइटन एक्स-१०० में पंजाब.
    नोट: धुंधला के आधार पर, 1% ट्राइटन X-१०० युक्त समाधान की आवश्यकता हो सकती है । ट्राइटन एक्स के एक उच्च एकाग्रता-१०० ऊतक में एंटीबॉडी के प्रवेश बढ़ जाती है और यह क्षेत्र है कि ऊतक के अंदर गहरी झूठ ( जैसे, वयस्क synaptic Drosophila मस्तिष्क में क्षेत्रों) दाग करने के लिए आवश्यक है.
  4. ब्लॉकिंग समाधान तैयार: 3% सामांय बकरी सीरम, 3% सामांय गधा सीरम, और ०.५% ट्राइटन X-१०० पंजाब में ।
  5. वयस्क मस्तिष्क धोने समाधान और अवरुद्ध समाधान 4 में संग्रहित किया जा सकता है & #176 कुछ हफ्तों के लिए; सी ।
  6. बर्फ पर गहरे अवसाद वेल्स ग्लास प्लेट डाल दिया और निंनलिखित समाधान के साथ एक अच्छी तरह से भरने: ७०% इथेनॉल, पंजाबियों के साथ एक के साथ एक, और S2 सेल संस्कृति माध्यम के साथ एक ।
< p class = "jove_title" > 4. वयस्क मस्तिष्क विच्छेदन

  1. स्थिति एक stereomicroscope के मंच पर एक 3 सेमी विदारक पकवान और यह ठंडा S2 सेल संस्कृति माध्यम के साथ भरें । इस माध्यम में सभी विच्छेदों का संचालन सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान स्वस्थ रहता है ।
    नोट: एक विदारक पकवान काले सिलिकॉन के कई मिलीमीटर है जो एक अच्छी पृष्ठभूमि इसके विपरीत (छवियों में) प्रदान करता है के साथ लाइन में खड़ा का उपयोग करें, और विच्छेदन के दौरान संदंश की रक्षा ।
  2. Anesthetize से वांछित जीनोटाइप की मक्खियों को कं 2 .
    3. संदंश के साथ
  3. , पंख से मक्खी हड़पने के लिए और ठंड में ७०% इथेनॉल 30 एस के लिए, तो अतिरिक्त 30 एस
    4. के लिए ठंडे पंजाबियों के साथ धो
  4. गहरी अवसाद में मक्खी हस्तांतरण अच्छी तरह से है कि S2 सेल संस्कृति माध्यम से भर जाता है ।
  5. एक ही जीनोटाइप के सभी मक्खियों के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराने और ठंडा S2 सेल संस्कृति माध्यम में उंहें बनाए रखने के विच्छेदन, जो ऊतक की रक्षा करेगा ।
    नोट: Anesthetize केवल मक्खियों की संख्या है कि के बारे में 30 मिनट के एक समय की अवधि में विच्छेदित किया जा सकता है । S2 सेल संस्कृति माध्यम में लंबे समय मशीन समय ऊतक नुकसान हो सकता है ।
  6. संदंश के साथ मक्खी हड़पने के लिए और, एक stereomicroscope के तहत, S2 सेल संस्कृति माध्यम में मक्खी जलमग्न.
  7. शरीर के बाकी हिस्सों से सिर को अलग करते हैं । शरीर को त्यागें और S2 सेल संस्कृति माध्यम में सिर जलमग्न रहते हैं । विच्छेदन की संपूर्ण अवधि के लिए संदंश के साथ सिर पकड़ना अत्यंत महत्वपूर्ण है । सिर फ्लोट करने के लिए शुरू होता है, यह ऊतक को नुकसान पहुँचाए बिना इसे पुनः प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो जाएगा ।
  8. एक आंख बाहर खींच द्वारा विच्छेदन शुरू, जबकि हर समय कम से एक संदंश के साथ सिर पकड़े हुए । सुनिश्चित करें कि संदंश की नोक बस के नीचे ऊतक हानिकारक से बचने के लिए रेटिना के नीचे है । दूसरी आंख बाहर खींचो और छल्ली को हटाने शुरू जब तक मस्तिष्क प्रकट होता है ।
  9. ऊतक साफ दिखाई देता है जब तक मस्तिष्क के आसपास के सभी सांस ऊतक और छल्ली निकालें । इष्टतम धुंधला परिणाम के लिए मस्तिष्क के चारों ओर सभी सांस ऊतक को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें; अब ऊतकों को स्थिर और दाग के लिए तैयार कर रहे हैं ।
  10. को पीएफए समाधान में स्थानांतरित करने से पहले शीत S2 कोशिका संस्कृति माध्यम में सभी विच्छेदित दिमाग को बनाए रखने के क्रम में समय निर्धारण कदम ।
< p class = "jove_title" > 5. वयस्क ब्रेन सना

< राजभाषा>
  • कमरे के तापमान (आरटी) में पीएफए समाधान में एक P10 पिपेट के साथ अलग मस्तिष्क हस्तांतरण । ऊतक क्षति से बचने के लिए, विच्छेदन के बाद दिमाग स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग कभी नहीं. २०० & #181 में सभी चरणों का पालन करें; L पीसीआर ट्यूबों पर एक nutator.
  • सभी कदम के लिए, एक P200 पिपेट के साथ पुराने समाधान को खारिज करने से पहले, दिमाग ट्यूब के तल पर बसने के लिए अनुमति देते हैं । ऊतक aspirating बिना supernatant को दूर करने के लिए प्रयास करें । प्रकाश जोखिम से ऊतक की रक्षा.
  • २०० & #181 में दिमाग ठीक कर; 2% पीएफए के एल S2 सेल संस्कृति माध्यम में 1 ज के लिए या 4% पीएफए में 30 मिनट के लिए । reproducibility को बढाने के लिए नमूनों के बीच निर्धारण का समय समान रखें ।
  • के बाद 3 (या अधिक) 15 मिनट की बहाकर प्रत्येक में २०० & #181; l वयस्क मस्तिष्क धोने के समाधान, के ऊतकों को ब्लॉक २०० & #181 के लिए 30 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान के एल. अवरुद्ध समाधान में अब मशीन समय संभव हो रहे हैं ।
  • गर्मी में दिमाग रात भर 4 & #176; प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सी में वयस्क मस्तिष्क धोने समाधान २०० की कुल मात्रा में पतला & #181; L.
    ध्यान दें: मशीन समय इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के प्रकार के आधार पर भिंन हो सकते हैं । अब गर्मी की आवश्यकता हो सकती है । तीन MCFO मार्करों के लेबलिंग के लिए
    1. , विरोधी के साथ दिमाग मशीन (1:500), विरोधी झंडा (DYKDDDDK epitope) (1:100), और विरोधी V5 प्राथमिक एंटीबॉडी ।
    2. प्राथमिक सीधे-संयुग्मित एंटीबॉडी सामांय प्राथमिक + माध्यमिक संयोजन ( जैसे ., विरोधी V5: DyLight ५४९ (1:200)) के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । इस मामले में, माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में सीधे-संयुग्मित एंटीबॉडी का इलाज.
      नोट: प्रत्येक जीनोटाइप के लिए, नियंत्रण के रूप में कुछ दिमाग रखने के लिए धुंधला की विशिष्टता की पुष्टि करें । प्राथमिक एंटीबॉडी गर्मी छोड़ें और अगले कदम के लिए सीधे जाओ ।
  • में 1 ज के लिए 3 बार ऊतक धो लें २०० & #181; वयस्क मस्तिष्क धोने समाधान (३.३ चरण) के एल और उंहें माध्यमिक fluorophore-conjugates/प्राथमिक सीधे-संयुग्मित एंटीबॉडी वयस्क मस्तिष्क धुलाई समाधान में पतला के साथ रात 4 & #176; C या के लिए 4 ज पर, २०० & #181 की कुल मात्रा में; L
    नोट: उपयुक्त एंटीबॉडी के उदाहरण: AlexaFluor ४८८ (1:250), एंटी V5: DyLight ५४९ (1:200) और DyLight ६४७ (1:100)-संयुग्मित एंटीबॉडी.
  • धो के दिमाग 3 बार 1 ज के लिए २०० & #181; वयस्क ब्रेन वाशिंग समाधान के एल, २०० में एक अंतिम धोने के बाद & #181; पंजाबियों के एल में रातोंरात 4 & #176; C या के लिए 1-2 h पर RT; पंजाब में अंतिम धुलाई कदम ट्राइटन X-१०० के किसी भी निशान को हटा और के लिए आवश्यक है इष्टतम धुंधला परिणाम । एक विरोधी के साथ बढ़ते मध्यम में दिमाग माउंट ग्लास coverslips पर एजेंट फीका ।
    • < p class = "jove_title" > 6. इमेजिंग के लिए दिमाग के बढ़ते

    1. कैंची का उपयोग कर उचित आकार के लिए एक इमेजिंग स्पेसर ट्रिम कर दीजिए । उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए, दो ग्लास coverslips.
      के बीच सैंडविच नमूना और इमेजिंग स्पेसर नोट: इमेजिंग स्पेसर पतली (०.१२ मिमी मोटी) चिपकने वाली स्पेसर्स कि छील और कांच coverslips या माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए छड़ी, अनुमति संपीड़न के बिना नमूनों के बढ़ते हैं ।
    2. संदंश का उपयोग कर, एक सतह से चिपकने वाला लाइनर को हटाने और स्पेसर लागू करते हैं, एक गिलास coverslip की सतह पर चिपकने वाला पक्ष नीचे, (22 मिमी x ६० मिमी) । Apply 10 & #181; L बढ़ते मीडियम के एक नए ग् coverslip.
      3. एक P10 पिपेट के साथ
    3. , २०० & #181 से दिमाग का अंतरण; एल ट्यूब coverslip के लिए, बढ़ते माध्यम की बूंद के बगल में । ऊतकों के साथ साथ, कुछ पंजाबियों हस्तांतरण के लिए समाधान में दिमाग को बनाए रखने के लिए ।
      4. एक P10 पिपेट के साथ
    4. , पंजाबियों से दिमाग को बढ़ते माध्यमों की बूंद तक ले जाने के लिए पंजाबियों की मात्रा सीमित करने की कोशिश कर रहा है । इमेजिंग स्पेसर के साथ coverslip पर बढ़ते माध्यम में नमूनों स्थानांतरण । पर्याप्त बढ़ते मीडिया का उपयोग करने के लिए नमूना कवर ।
    5. स्पेसर के ऊपरी हिस्से से अन्य चिपकने वाला लाइनर निकालें और नमूनों के शीर्ष पर एक गिलास coverslip जोड़ें । एक संदंश की नोक के साथ, सील करने के लिए चिपकने वाला क्षेत्र पर एक सौंय दबाव लागू होते हैं । घुड़सवार ऊतकों की छवि तुरंत या स्टोर पर-20 & #176; C for बाद में विश्लेषण.
    < p class = "jove_title" > 7. छवि अधिग्रहण

    1. एक 40X के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फोकल प्रतिदीप्ति छवियों के ढेर प्राप्त (na = १.२, जल विसर्जन) उद्देश्य या 63X (na = १.४, तेल विसर्जन) उद्देश्य (पिक्सेल आकार = १,०२४ x १,०२४ xy विमान में; दो फोकल अनुभागों के बीच की दूरी = ०.५ & #181; m). डिटेक्टर लाभ और इस तरह से प्रत्येक चैनल में ऑफसेट समायोजित करें कि कोई संतृप्त पिक्सल और शूंय पिक्सेल मूल्यों छवियों में मौजूद हैं; यह सूचना हानि से बचा जाता है और डिटेक्टर के पूर्ण गतिशील रेंज का उपयोग सुनिश्चित करता है ।
      नोट: के बाद से 3 डी इमेजिंग समय लगता है, माप स्वचालित विभिंन स्थानों पर समानांतर में कई नमूनों को स्कैन करके किया जा सकता है । जल विसर्जन उद्देश्य के साथ वाष्पीकरण से बचने के लिए, अपवर्तन सूचकांक के साथ विशेष तेल विसर्जन माध्यम का उपयोग करें n = १.३३.
    2. अधिकतम घनत्व अनुमानों के लिए फोकल स्टैक प्रक्रिया, चैनल छटा में परिवर्तन, और किसी भी मानक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चमक और कंट्रास्ट का समायोजन ( सामग्री की तालिका देखें).

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    Representative Results

    यह खंड वयस्क Drosophila मस्तिष्क में MCFO तकनीक का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है कि परिणामों के उदाहरण दिखाता है । आकृति 3 पद्धति का योजनाबद्ध रूप से पता चलता है । तीन अलग झिल्ली-टैग रिपोर्टर (myr-smGFP-हा, myr-smGFP-झंडा और myr-smGFP-V5) के तहत यूएएस नियंत्रण एक transcriptional टर्मिनेटर दो FRT साइटों (FRT-stop-FRT) द्वारा पार्श्व द्वारा मौन रखा जाता है । एक गर्मी सदमे पल्स Flp recombinase की अभिव्यक्ति है जो बेतरतीब ढंग से FRT-स्टॉप-FRT कैसेटों को व्यक्तिगत कोशिकाओं में निकालता है लाती है । इसका उपयोग GAL4 ड्राइवर द्वारा निर्दिष्ट किसी दिए गए कक्ष प्रकार के भिंन रंग के कक्षों की सरणी के लिए होता है ।

    कुल मिलाकर सात रंग संभव हैं । चित्रा 4 और चित्रा 5 क्रमशः Drosophila antennal पालि (अल) में EG और ALG कोशिकाओं के एकल morphologies दिखाओ । गर्मी सदमे समय में वृद्धि GAL4 चालक के प्रकार के आधार पर, लेबल कोशिकाओं की एक वृद्धि की राशि लाती है, इसलिए गर्मी सदमे प्रोटोकॉल का एक प्रारंभिक अनुकूलन आवश्यक है । चित्रा 6 एकल MCFO पत्रकारों के साथ Drosophila ऑप्टिक पालि (राजभाषा) में उदाहरण के लेबल से पता चलता है ।

    Figure 1
    चित्रा 1: वयस्क Drosophila एनएस के एनाटॉमी । neuropile क्षेत्रों (नीले क्षेत्रों) synaptic कनेक्शन होते हैं, जबकि cortical क्षेत्रों (बिंदीदार ग्रे क्षेत्रों) के सभी न्यूरॉन्स और glial कोशिका निकायों के अधिकांश होते हैं । पथ क्षेत्रों (डार्क ब्लू) अलग neuropiles कनेक्ट । यह आंकड़ा Kremer एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१७) 18. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

    Figure 2
    चित्र 2: Drosophila सीएनएस में जेनेरिक glial उपप्रकार । एक झिल्ली-टैग GFP (यूएएस-mCD8-GFP) संवाददाता विशिष्ट GAL4 ड्राइवरों द्वारा संचालित पांच जेनेरिक glial उपप्रकार (स्नातकोत्तर: perineurial glia, एसपीजी: subperineurial glia, तटरक्षक: प्रांतस्था glia, ALG: astrocyte की तरह glia और जैसे के दृश्य की अनुमति देता है: ensheathing glia) । neuropil क्षेत्रों (रानी क्षेत्रों) presynaptic मार्कर NC82 (BRUCHPILOT) के साथ पाया जाता है । निचले भाग में, भिन्न glial उपप्रकारों के लिए कक्ष गणनाएँ भी दिखाई जाती हैं. स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 3
    चित्रा 3: MCFO तकनीक के लिए पार योजना. MCFO तकनीक की योजनाबद्ध । Homozygousvirgins ले MCFO कैसेट और hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-रोक-FRT-myr-smGFP-हा, 10XUAS-FRT-रोक-FRT-myr-smGFP-ध्वजा, 10XUAS-FRT-रोक-FRT-myr-smGFP-V5) को विशिष्ट homozygous GAL4 चालक पुरुषों के साथ पार कर जाते हैं. F1 पीढ़ी तो गर्मी सदमे में है । पत्रकारों से बेतरतीब ढंग से निकाले गए FRT-स्टॉप-FRT कैसेटों की संख्या के हिसाब से सात विभिन्ना रंग संभव हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्रा 4: antennal पालि (अल) में ensheathing glia (EG) के आकृति विज्ञान । फोकल जेड के पोट के बाद Drosophila अल के wholemount immunostaining. (क) अल की आकृति विज्ञान presynaptic मार्कर NC82 (BRUCHPILOT) के साथ पता चला. (B-D) Stochastic EGcells के लेबलिंग गर्मी सदमे बार बढ़ती द्वारा प्रेरित: 8 मिनट (ख), ८.५ मिनट (सी) और 10 मिनट (डी) । जैसे वे अल की सतह ensheath, जैसे कई अलग आकृति और आकार पर ले, उदाहरण के लिए कोशिकाओं को अलग क्षेत्रों को कवर लेकिन संपर्क के क्षेत्रों में आंशिक रूप से interdigitate । स्केल बार = 20 µm. HA: मानव इंफ्लूएंजा hemagglutinin । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्रा 5: antennal पालि (AL) में astrocyte की तरह glia (ALG) के आकृति विज्ञान । फोकल जेड के पोट के बाद Drosophila अल के wholemount immunostaining. (क) अल की आकृति विज्ञान presynaptic मार्कर NC82 (BRUCHPILOT) के साथ पता चला. (B-D) Stochastic ALG कोशिकाओं के लेबलिंग गर्मी सदमे बार बढ़ती द्वारा प्रेरित: 8 मिनट (ख), 10 मिनट (सी) और 15 मिनट (डी) । ALG दिखाने के चर आकार और morphologies लेकिन कवर मोटे तौर पर गैर अतिव्यापी क्षेत्रों । स्केल बार = 20 µm. HA: मानव इंफ्लूएंजा hemagglutinin । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 6
    चित्रा 6: ऑप्टिक पालि (राजभाषा) में ensheathing glia (EG) का आकृति विज्ञान । wholemount immunostaining के बाद Drosophila राजभाषा के फोकल जेड पोट । (A-C) MCFO लेबलिंग के साथ तीन बंद करो-कैसेट पत्रकारों के साथ हा, झंडा और V5 myr-smGFPs । Flp recombinase ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 10 मिनट की गर्मी सदमे से प्रेरित किया गया था । (A-C) व्यक्तिगत MCFO रिपोर्टर और मर्ज (D) दिखाए जाते हैं । स्केल बार = 20 µm. HA: मानव इंफ्लूएंजा hemagglutinin । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प में ब्याज की एक ऊतक के भीतर विभिन्न कोशिका प्रकार की आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आसान और कुशल विधि का वर्णन. MCFO तकनीक के साथ, विभिंन epitope टैग के साथ कई पत्रकारों बहुरंगा stochastic लेबलिंग (चित्रा 2) के लिए संयोजन में उपयोग किया जाता है । ऐसे Brainbow/Flybow15,16,17के रूप में अंय तरीकों के समान है, MCFO मार्कर coexpression के माध्यम से लेबल विविधता बढ़ जाती है, की अनुमति सेल सेल संपर्क अध्ययन के लिए सेल की सीमाओं के दृश्य । उदाहरण के लिए, तीन रिपोर्टर्स के साथ, सात संभावित मार्कर संयोजन संभव हैं । पिछले लेबलिंग तरीकों की तुलना में, MCFO तकनीक सेल लेबलिंग घनत्व के एक अधिक सटीक और आसान नियंत्रण से पता चलता है17: Flybow १.० मक्खियों एक डिफ़ॉल्ट मार्कर है कि एक सेल लेबलिंग अधिक कठिन बनाता है एक्सप्रेस; Flybow २.० मक्खियों दो अलग Flp recombinases प्रणाली और अधिक जटिल बनाने की अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है ।

    विशिष्ट GAL4 चालक इस्तेमाल पर निर्भर करता है, MCFO तकनीक किसी भी विकास के स्तर पर किसी भी ऊतक का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यहाँ, तकनीक उच्च संकल्प पर वयस्क Drosophila मस्तिष्क में जेनेरिक glial उपप्रकार की आकृति विज्ञान की विशेषता के लिए लागू किया गया है । एकल कोशिकाओं के बहुरंगा लेबल अलग सीमाओं के दृश्य की अनुमति देता है और समझने में मदद करता है, उदाहरण के लिए, दो आसंन कोशिकाओं के बीच स्थानिक बातचीत; इसके अलावा PNG और एसपीजी कोशिकाओं है, जो epithelia फार्म के लिए होती हैं, अंय सभी glial उपप्रकार छत दिखाने के लिए, कि वे अपने glial पड़ोसियों के साथ संपर्क को कम करने के लिए है, जबकि लिफाफा ंयूरॉन डिब्बे के साथ संपर्क अधिकतम (कोशिका शरीर, axons, dendrites, और synapses) । वे सब ठीक lamellipodial या filopodial न केवल अपने स्थानीय पड़ोस में, लेकिन यह भी सुदूर परिवेश में18।

    इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए, यह 18 डिग्री सेल्सियस पर रियर मक्खियों के लिए महत्वपूर्ण है ताकि प्रणाली में leakiness से बचने के लिए । जब विदारक और पूरे धुंधला प्रक्रिया के दौरान, यह इष्टतम धुंधला परिणाम के लिए ऊतक को किसी भी क्षति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । अंत में, दो तकनीकी पहलुओं पर विचार किया जाना है: गर्मी सदमे समय कोशिकाओं में टैग व्यक्त कर रहे है की राशि को परिभाषित करता है । एक छोटी गर्मी सदमे कुछ कोशिकाओं के लेबल के लिए नेतृत्व करेंगे, जबकि एक लंबी गर्मी सदमे कई कोशिकाओं में टैग की अभिव्यक्ति के चरम मामले में जो सभी FRT-stop-FRT कैसेट पत्रकारों से हटा रहे हैं, सभी कोशिकाओं में प्रेरित करेगा । इस स्थिति में, केवल एक रंग (तीन epitope टैग की मर्जी) मौजूद होगा, एकल कक्ष morphologies के दृश्यावलोकन को रोक रहा है. गर्मी सदमे समय hsp-Flp और GAL4 ड्राइवर के सम्मिलन साइट के आधार पर भिन्न होता है, इसलिए एक प्रारंभिक ऑप्टिमाइज़ेशन चरण आवश्यक हो सकता है । मार्कर व्यंजक यादृच्छिक है और GAL4 ड्राइवर द्वारा चालित कक्षों की एक विशिष्ट उपजनसंख्या को लक्षित नहीं किया जा सकता. एक सेल के भीतर, अलग टैग अलग रंग के साथ पड़ोसी कोशिकाओं के धुंधला एंटीबॉडी सक्षम करने के लिए व्यक्त किया जा सकता है । हालांकि, कभी-कभार, एक से अधिक टैग दो रंगों के ओवरलैप करने के लिए अग्रणी एक कक्ष में व्यक्त किया जाता है ।

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    Disclosures

    लेखकों में से कोई भी प्रतिस्पर्धा या परस्पर विरोधी हितों की है ।

    Acknowledgments

    लेखक Arnim Jenett, Aljoscha Nern, और सलाह के लिए रुबिना प्रयोगशाला के अंय सदस्यों और अप्रकाशित पुनर्अभिकर्ताओं के बंटवारे और Janelia फोकल छवियों को पैदा करने के लिए प्रकाश परियोजना टीम मक्खी धंयवाद । लेखकों ने पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए गॉल लेबोरेटरी के सदस्यों का भी धन्यवाद किया ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water bath Grant GD100
    PCR tubes Sarstedt 72.737.002
    Forceps Dumont 11251-20
    Dissecting dish 30 mm x 12 mmm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dish
    Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate Corning 7223-34 Glass dissection plates
    Sylgard Black SYLGARD, Sigma-Aldrich 805998 home made with charcoal
    ExpressFive S2 cell culture medium Invitrogen 10486-025
    20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713
    Triton X-100 Roth 3051.3
    Normal goat serum Jackson Laboratories 005-000-121
    Normal donkey serum Jackson Laboratories 017-000-121
    Bovine Serum Albumin Sigma A9647
    Rabbit HA-tag Cell Signaling C29F4 Primary antibody, dilution 1:500
    Rat FLAG-tag Novus Biologicals NBP1-06712 Primary antibody, dilution 1:100
    Mouse V5-tag:DyLight 549 AdSerotec 0411 Conjugated antibody, dilution 1:200
    anti-rabbit AlexaFluor 488 Invitrogen A11034 Secondary antibody, dilution 1:250
    anti-rat DyLight 647 Jackson Laboratories 712-605-153 Secondary antibody, dilution 1:100
    Vecta Shield Vector Laboratories H-1000
    SlowFate Gold Invitrogen S36937
    Secure Seal Spacer Grace Biolabs Contact company for ordering
    Microscope cover glass 22 X 60 mm Marienfeld 101152
    Microscope cover glass 22 x 22 mm Roth H874
    Stereo Microscope, Leica MZ6 Leica
    Confocal laser scanning microscope LSM710 Zeiss
    Immersol Zeiss 518 F Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
    Immersol Zeiss W 2010 Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
    R56F03-GAL4 (EG) Bloomington Stock Center 39157 GAL4 driver
    R86E01-GAL4 (ALG) Bloomington Stock Center 45914 GAL4 driver
    hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 Bloomington Stock Center 64085 UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
    Fiji (Image J) Image analysis software
    Multi Time Macro Zeiss Software for automated scanning

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    References

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    Tags

    व्यवहार अंक १२८ आकृति विज्ञान सेल-सेल इंटरेक्शन Drosophila बहुरंगा FlpOut (MCFO) GAL4/यूएएस प्रणाली फोकल माइक्रोस्कोपी
    <em>Drosophila</em> में Glia के उच्च संकल्प एकल कोशिका Morphologies और सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बहुरंगा FlpOut तकनीक का अनुप्रयोग
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    Batelli, S., Kremer, M., Jung, C.,… More

    Batelli, S., Kremer, M., Jung, C., Gaul, U. Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila. J. Vis. Exp. (128), e56177, doi:10.3791/56177 (2017).

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