Summary
Le cellule visualizzare diverse morfologie e stabilire una serie di interazioni con i loro vicini. Questo protocollo descrive come per rivelare la morfologia delle singole cellule e per indagare l'interazione cellula-cellula utilizzando il sistema di espressione Gal4/UAS ben consolidato.
Abstract
Celle sono visualizzate diverse morfologie e complessi rapporti anatomici. Come le cellule interagiscono con i loro vicini? Le interazioni differiscono tra tipi cellulari o anche all'interno di un determinato tipo? Quali tipi di regole spaziali seguono? Le risposte a tali domande fondamentali in vivo sono state ostacolate finora da una mancanza di strumenti per l'etichettatura di alta risoluzione singola cella. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per singole celle con una tecnica di MultiColor FlpOut (MCFO) di destinazione. Questo metodo si basa su tre in modo diverso con tag reporter (HA, bandiera e V5) sotto il controllo UAS che sono taciuti da un terminatore trascrizionale fiancheggiato da due siti di FRT (FRT-fermata-FRT). Un impulso di scossa di calore induce l'espressione di un calore indotta da shock Flp ricombinasi, che rimuove in modo casuale le cassette di FRT-fermata-FRT in singole celle: espressione si verifica solo nelle cellule che esprimono anche un driver GAL4. Questo porta a una matrice di celle diversamente colorate di un tipo dato delle cellule che permette la visualizzazione delle morfologie di cella singola ad alta risoluzione. Ad esempio, la tecnica MCFO combinabile con driver GAL4 glial specifici per visualizzare le morfologie dei diversi sottotipi gliali nel cervello adulto Drosophila .
Introduction
Glia, la popolazione delle cellule non neuronali del sistema nervoso (NS), sono stati a lungo creduto di fornire un quadro statico per i neuroni e pertanto non sono stati studiati in dettaglio. Tuttavia, negli esseri umani, glia costituiscono la stragrande maggioranza delle cellule del NS (~ 90%) e rientrano in diverse categorie, tra cui gli astrociti, oligodendrociti, microglia e cellule di Schwann. In Drosophila, glia costituiscono circa il 10% delle cellule nel NS. Intrigante, loro morfologie e funzioni sono notevolmente simili a quelli trovati in vertebrati1,2. Loro morfologie includono barriera emato - encefalica (BBB) formando epiteli, gliali e Astrocita-come le cellule.
Il sistema nervoso centrale di Drosophila (CNS) si compone delle seguenti strutture principali: regioni della corteccia che contengono i corpi cellulari neuronali; neuropils che porto connessioni sinaptiche; tratti di piccole e grandi dell'assone che collegano i diversi neuropiles; nervi periferici che collegano gli organi sensoriali e muscoli con il CNS (Figura 1). Glia sono trovati collegati con tutte queste strutture anatomiche: glia di corteccia (CG) nelle regioni corticali, Astrocita-come glia (ALG) e gliali glia (EG) nelle regioni compresa, gliali glia sono anche associate a tratti assone centrale e periferico nervi (EGN) e infine, due foglio-come glia, glia perineurial (PG) e subperineurial (SPG), che insieme formano uno strato contiguo che copre l'intera NS (Figura 2).
Studi precedenti hanno dimostrato che cellule gliali svolgono un ruolo importante nello sviluppo del NS; monitorare un numero di cellulare di un neurone reagendo ai peptidi del tipo di insulina di circolazione sistemica, forniscono supporto trofico ai neuroni, tra cui la navetta di lattato di astrociti ed eliminare i neuroni morenti di fagocitosi3,4 , 5 , 6. nel NS maturo, glia mantenere la BBB, occupano neurotrasmettitori e mantenere l'omeostasi ionica, agire come le principali cellule immunitarie nel NS, poiché i macrofagi non possono violare la BBB e modulare l'attività sinaptica, nonché il comportamento animale6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Se i diversi sottotipi gliali svolgono funzioni specializzate rimane un importante problema irrisolto. Tuttavia, un'analisi sistematica del genoma della glia, soprattutto nell'adulto, è stata ostacolata dalla mancanza di appropriati strumenti genetici per la loro manipolazione. Qui, un metodo che permette la caratterizzazione efficiente e facile di forme di cella per studiare le interazioni cellula-cellula complessa è presentato. Questa tecnica è stata applicata per caratterizzare la morfologia dei diversi sottotipi gliali nel cervello adulto Drosophila , ma, a seconda del driver GAL4 specifico utilizzato, potrebbe essere adattato per studiare i neuroni12,13 , qualsiasi tipo di macrosezioni cellule e in linea di principio qualsiasi tessuto in tutte le fasi inerenti allo sviluppo.
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Protocol
1. preparazione di mosche per esperimenti MultiColor FlpOut (MCFO)
Nota: The MCFO tecnica si riferisce a una versione modificata dell'asportazione così chiamato per la cassetta fermata Flp-mediata (FlpOut). Transgenici MCFO mosche trasportano un promotore di scossa di calore (hsp)-ricombinasi Flp e diversi giornalisti sotto UAS di controllo. Ogni giornalista è costituito da una dorsale comune di una miristoilate (myr) proteina fluorescente verde super cartella (sfGFP), in cui 10 copie di un epitopo tag (ad es., HA, bandiera o V5) sono stati inseriti. Le proteine non fluorescente risultante sono denominate " il mostro di spaghetti GFPs " (smGFPs) 14 e può essere rilevata utilizzando anticorpi specifici contro l'epitopo diverso.
- Croce Vola con la cassetta MCFO e la hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) per le righe appropriate gliale GAL4 driver (Vedi tabella materiali) .
- Come il hsp è già attivo a 25 ° C e alcune cellule possono subire ricombinazione che conduce a un'etichettatura non specifico, impostare croci a 18 ° C al fine di evitare la permeabilità del sistema. Attendere circa 20 giorni a 18 ° C per ottenere la generazione F1. Dopo il calore shock (Vedi punto 2), mantenere le mosche a 25 ° C ( Figura 3).
2. Colpo di calore
Nota: a seconda del sito di inserimento, può differire l'efficienza di hsp-Flp; di conseguenza, il tempo di scossa di calore ottimale deve essere ottimizzato. Per questo protocollo, è stato utilizzato uno stock di volare MCFO in cui è stato inserito l'hsp-Flp sul cromosoma X (Vedi Tabella materiali).
- Trasferimento la progenie della Croce nel passaggio 1.1 (mosche di generazione F1, 3-4 giorni) nei nuovi flaconi contenenti cibo e calore shock li a 37 ° C in bagnomaria.
Nota: Giovane mosche (1-2 giorni) sono molto sensibili allo shock termico. Attendere 1 o 2 giorni prima di eseguire la scossa di calore al fine di ridurre il tasso di mortalità causato dal trattamento. Uso alcuni della generazione F1 Vola come un controllo, senza shock termico. - Durante la scossa di calore, mantenere mosche in fiale normale con il cibo al fine di diminuire il tasso di mortalità indotta da stress. Mettere le femmine e i maschi in flaconcini separati.
- Assicurati di immergere il flacone intero nell'acqua per assicurare una scossa di calore omogeneo. Utilizzare uno shock di 5-8 min come punto di partenza adatto per il contrassegno sparse delle cellule di glia con molte linee di GAL4 driver; la durata di shock deve essere ottimizzata per ogni driver e l'esperimento (volte di scossa di calore più o meno lunghi potrebbero essere necessarie).
- Dopo la scossa di calore, ponga le fiale orizzontalmente in panchina per qualche minuto al fine di consentire le mosche a riprendersi dallo shock termico.
Nota: Non è necessario cambiare i flaconcini. - Mantenere le mosche a 25 ° C e (vedere il passaggio 3 e 4) li sezionava 2 o più giorni dopo la scossa di calore per l'espressione ottimale reporter.
3. Preparazione di dissezione e soluzioni
- il giorno della dissezione, preparare soluzione fissante fresco in provette per PCR 200 µ l con 180 µ l di terreno di coltura cellulare S2 con 20 µ l di 20% paraformaldeide (PFA) per ottenere una soluzione di 2% PFA. Mantenere la soluzione fissante sul ghiaccio prima e durante la dissezione.
Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
Nota: Mescolare 160 µ l di terreno di coltura cellulare S2 con 40 µ l di 20% paraformaldeide (PFA) in un tubo PCR di 200 µ l per preparare una soluzione PFA 4% invece di una soluzione di 2%. - Utilizzare un tubo di PCR per genotipo con un massimo di 8-10 cervelli per tubo per ottenere ottimi risultati di macchiatura.
- Preparare il cervello adulto, soluzione di lavaggio: albumina di siero bovino di 0,5%, 0,5% Triton X-100 in PBS.
Nota: A seconda della colorazione, una soluzione contenente 1% Triton X-100 può essere necessaria. Una maggiore concentrazione di Triton X-100 aumenta la penetrazione dell'anticorpo nel tessuto ed è necessario per le regioni di macchia che si trovano dentro il tessuto (ad es., regioni sinaptica nel cervello adulto Drosophila). - Preparare la soluzione bloccante: siero di capra normale 3%, 3% donkey normale siero e 0,5% Triton X-100 in PBS.
- Il cervello adulto lavaggio soluzione e la soluzione bloccante può essere memorizzato a 4 ° C per un paio di settimane.
- Mettere la lastra di vetro di depressione profonda pozzi sul ghiaccio e riempire ogni bene con le seguenti soluzioni: uno con etanolo al 70%, uno con PBS e uno con mezzo di coltura cellulare S2.
4. Dissezione del cervello adulto
- posizionare un 3cm piatto di dissezione sul palco di uno stereomicroscopio e riempirlo con freddo medium di coltura cellulare di S2. Condurre tutte le dissezioni in questo mezzo per garantire che il tessuto rimanga sano durante la procedura di dissezione.
Nota: Utilizzare un piatto per dissezione fiancheggiato da alcuni millimetri di silicone nero che fornisce un buon contrasto (nelle immagini) e preservare il forcipe durante la dissezione. - Anestetizzare le mosche del genotipo desiderato con CO 2.
- Con il forcipe, afferrare al volo dalle ali e lavarlo in etanolo 70% freddo per 30 s, quindi con PBS freddo per ulteriori 30 s.
- Trasferire al volo nella depressione profonda ben che viene riempita con terreno di coltura cellulare S2.
- Ripetere la stessa procedura per tutte le mosche dello stesso genotipo e mantenerli in mezzo di coltura cellulare S2 freddo fino a dissezione, che conserverà il tessuto.
Nota: Anestetizzare solo il numero di mosche che può essere sezionata in un periodo di tempo di circa 30 min., lunghi tempi di incubazione in terreno di coltura cellulare di S2 può danneggiare il tessuto. - Afferrare al volo con il forcipe e, sotto un microscopio stereoscopico, immergere la Mosca in mezzo di coltura cellulare S2.
- Staccare la testa dal resto del corpo. Scartare il corpo e tenere la testa immersa nel mezzo di coltura cellulare di S2. È estremamente importante tenere la testa con il forcipe per tutta la durata della dissezione. Se la testa inizia a galleggiare, sarà difficile per recuperarla senza danneggiare il tessuto.
- Iniziare la dissezione tirando fuori un occhio, mentre si tiene la testa con il forcipe almeno una in ogni momento. Assicurarsi che la punta della pinza è appena di sotto della retina per evitare di danneggiare il tessuto sotto. Tirare fuori l'altro occhio e iniziare a rimuovere la cuticola finché non viene visualizzato il cervello.
- Rimuovere il tessuto tracheale e cuticola intorno al cervello fino a quando il tessuto appare pulito. Assicurarsi di rimuovere tutto il tessuto trachea intorno al cervello per ottenere ottimi risultati di colorazione; i tessuti sono ora pronti per essere riparato e macchiato.
- Mantenere tutti i cervelli sezionati in S2 freddo delle cellule di coltura prima di trasferirli nella soluzione PFA per tempo il passo di fissazione.
5. La macchiatura del cervello adulto
< ol>Nota: I tempi di incubazione possono variare a seconda del tipo di anticorpo utilizzato. Le incubazioni più lungo potrebbero essere necessarie.
- Per l'etichettatura dei tre marcatori MCFO, incubare i cervelli con anti-HA (1: 500), anti-FLAG (epitopo DYKDDDDK) (1: 100) e gli anticorpi primari anti-V5. Gli anticorpi coniugati direttamente
- primaria potrebbero essere utilizzati invece della normale combinazione primaria + secondaria (ad es., anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). In questo caso, trattare gli anticorpi coniugati direttamente come anticorpi secondari.
Nota: Per ciascun genotipo, tenere alcuni cervelli come controlli per verificare la specificità della colorazione. Saltare l'incubazione dell'anticorpo primario e andare direttamente al passaggio successivo.
Nota: esempi degli anticorpi adatti: AlexaFluor 488 (1: 250), anti-V5:DyLight 549 (1: 200) e DyLight 647 (1: 100)-anticorpi.
6. Montaggio dei cervelli per l'Imaging
- Trim un imaging distanziale la dimensione desiderata utilizzando le forbici. Per microscopia ad alta risoluzione, a sandwich tra due lamelle di vetro il distanziale esemplare e imaging.
Nota: Imaging distanziali sono sottili (0,12 mm di spessore) distanziali adesivi che buccia e bastone per vetrini coprioggetti o microscopio, che permette il montaggio dei campioni senza compressione. - Using pinze, rimuovere il rivestimento adesivo da una superficie e applicare il distanziale, il lato adesivo verso il basso, sulla superficie del vetrino coprioggetti (22 x 60 mm). Applicare 10 µ l di mezzo di montaggio nuovo vetrino coprioggetti.
- Pipetta con un P10, trasferire i cervelli dal tubo 200 µ l per il vetrino coprioggetto, vicino a quella del mezzo di montaggio. Insieme con i tessuti, trasferire alcuni PBS al fine di mantenere il cervello in soluzione.
- Pipetta con un P10, spostare i cervelli da PBS a goccia di mezzo di montaggio cercando di limitare la quantità di PBS. Trasferire gli esemplari in mezzo di montaggio il coprivetrino con il distanziale imaging. Utilizzare abbastanza mezzi di montaggio per coprire il campione.
- Rimuovere altri il rivestimento adesivo dal lato superiore del distanziatore e aggiungere un vetrino coprioggetti in cima gli esemplari. Con la punta di un forcipe, applicare una leggera pressione sulla zona adesiva per sigillare. Immagine dei tessuti montati immediatamente o archiviare le diapositive a-20 ° C per un'analisi successiva.
7. Acquisizione immagini
- pile di acquisizione di immagini di fluorescenza confocale utilizzando un microscopio confocale con un 40x (NA = 1.2, immersione in acqua) obiettivo o 63 X (NA = 1.4, olio da immersione) obiettivo (le dimensioni dei pixel = 1.024 x 1.024 nel piano xy; Distanza tra due sezioni confocale = 0,5 µm). Regolare il rivelatore guadagno e offset in ogni canale in modo tale che nessun pixel saturato e zero i valori dei pixel sono presenti nelle immagini; Questo evita la perdita di informazioni e garantisce l'utilizzo della gamma dinamica completa del rivelatore.
Nota: Poiché l'imaging 3D è molto tempo, le misurazioni possono essere automatizzate analizzando campioni multipli in parallelo alle posizioni differenti. Per evitare l'evaporazione con l'obiettivo a immersione in acqua, utilizzare olio speciale immersione mezzo con indice di rifrazione n = 1.33. - Elaborare gli stack confocale per proiezioni di densità massima, cambiamenti nel canale tonalità e regolazione della luminosità e il contrasto utilizzando qualsiasi software di analisi di immagine standard (Vedi Tabella materiali).
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Representative Results
In questa sezione sono riportati esempi di risultati che possono essere ottenuti utilizzando la tecnica MCFO nel cervello adulto della drosofila . La figura 3 Mostra un disegno schematico del metodo. Tre giornalisti diversamente membrana-etichetta (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG e myr-smGFP-V5) sotto il controllo UAS sono taciuti da un terminatore trascrizionale fiancheggiato da due siti di FRT (FRT-fermata-FRT). Un impulso di scossa di calore induce l'espressione della ricombinasi Flp che rimuove in modo casuale le cassette di FRT-fermata-FRT in singole celle. Questo porta a una matrice di celle diversamente colorate di un tipo dato delle cellule, specificati dal driver GAL4 utilizzato.
Nel complesso, sette colori sono possibili. Figura 4 e Figura 5 Mostra il singole morfologie delle cellule EG e ALG nel lobo antennal Drosophila (AL), rispettivamente. Aumentare il tempo di scossa di calore induce una maggiore quantità di cellule con etichettate, a seconda del tipo di driver GAL4, pertanto è necessaria un'ottimizzazione iniziale del protocollo di scossa di calore. Figura 6 Mostra l'etichettatura di EG nel lobo ottico di Drosophila (OL) con i giornalisti dei MCFO singoli.
Figura 1: Anatomia dell'adulto Drosophila NS. Le regioni corticali (punteggiate zone grigie) contengono tutte il neuronale e la maggior parte dei corpi delle cellule gliali, mentre le regioni compresa (zone blu) contengono le connessioni sinaptiche. Regioni del tratto (blu scuro) Collegare i diversi neuropiles. Questa figura è stata modificata da Kremer et al. (2017) 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sottotipi generici glial in Drosophila CNS. Un reporter GFP (UAS-mCD8-GFP) membrana-etichetta guidato da autisti GAL4 specifici permette la visualizzazione dei cinque sottotipi gliali generici (PG: perineurial glia, SPG: subperineurial glia, CG: glia di corteccia, ALG: Astrocita-come glia ed EG: gliali glia). Le regioni del neuropil (zone magenta) vengono rilevate con il marcatore presinaptico NC82 (BRUCHPILOT). Nella parte inferiore, sono indicati anche i conteggi delle cellule per i diversi sottotipi di gliali. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: schema di attraversamento per la tecnica MCFO. Schema della tecnica MCFO. Homozygousvirgins portando la cassetta MCFO e la hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) sono attraversati con i maschi omozigoti specifici driver di GAL4. La generazione F1 è quindi calore scioccato. In base al numero di cassette FRT-fermata-FRT casualmente rimosso dai giornalisti, sette diversi colori sono possibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: morfologia della glia gliali (EG) nel lobo antenne (AL). Confocale z-pile di Drosophila AL dopo wholemount immunostaining. (A) morfologia di AL rilevato con il marcatore presinaptico NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stocastico etichettatura di EGcells indotta aumentando volte di scossa di calore: 8 min (B), 8,5 min (C) e 10 min (D). Il prendere EG su molte diverse forme e dimensioni, come essi Sheath la superficie dei vicini altri. cellule EG coprono aree distinte ma parzialmente interdigitazione nelle regioni di contatto. Barra della scala = 20 µm. HA: emoagglutinina influenza umana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: morfologia della Astrocita-come glia (ALG) nel lobo antenne (AL). Confocale z-pile di Drosophila AL dopo wholemount immunostaining. (A) morfologia della AL rilevato con il marcatore presinaptico NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stocastico contrassegno delle celle ALG indotta aumentando volte di scossa di calore: 8 min (B), (C) di 10 min e 15 min (D). ALG Mostra variabile dimensioni e morfologie ma coprono aree in gran parte non sovrapposte. Barra della scala = 20 µm. HA: emoagglutinina influenza umana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: morfologia della glia gliali (EG) nel lobo ottico (OL). Confocale z-pile di Drosophila OL dopo wholemount immunostaining. (A-C) MCFO etichettatura con tre stop-cassetta reporter con HA, bandiera e V5 myr-smGFPs. Ricombinasi FLP è stata indotta da una scossa di calore 10 min a 37 ° C. (A-C) Singoli MCFO reporter e Unione (D) sono mostrati. Barra della scala = 20 µm. HA: emoagglutinina influenza umana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per studiare la morfologia dei diversi tipi di cellule all'interno di un tessuto di interesse ad alta risoluzione. Con la tecnica del MCFO reporter multipli con differenti epitopo tag sono utilizzati in combinazione per multicolor stocastico etichettatura (Figura 2). Simili ad altri metodi come Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta la diversità di etichetta attraverso coexpression di marcatore, permettendo la visualizzazione dei bordi della cella per studi di interazione cellula-cellula. Ad esempio, con i tre giornalisti, sette potenziale marcatore combinazioni sono possibili. Rispetto ai precedenti metodi di etichettatura, la tecnica MCFO viene illustrato un controllo più preciso e facile della cella etichettatura densità17: 1.0 Flybow mosche esprimere un indicatore predefinito che rende singola cella etichettatura più difficile; Flybow 2.0 mosche richiedono l'espressione della ricombinasi Flp due differenti rendendo il sistema più complicato.
A seconda del driver GAL4 specifico utilizzato, la tecnica MCFO può essere adattata per studiare qualsiasi tessuto in qualsiasi fase dello sviluppo. Qui, la tecnica è stata applicata per caratterizzare la morfologia dei sottotipi generici gliali nel cervello adulto drosofila ad alta risoluzione. L'etichettatura multicolor di singole cellule permette la visualizzazione dei contorni diversi e aiuta a comprendere, ad esempio, l'interazione spaziale tra due celle adiacenti; a parte le cellule PNG e SPG, che hanno lo scopo di epiteli forma, tutti gli altri sottotipi di glial Visualizza piastrellatura, che è ridurre al minimo contatto con i loro vicini glial, massimizzando il contatto con il compartimento di un neurone avvolto (corpo cellulare, assoni, dendriti, e sinapsi). Mandano tutti i processi impercettibili e lamellipodial o filopodial non solo nella loro zona locale, ma anche in un ambiente distante18.
Per il successo di questo protocollo, è cruciale al posteriore mosche a 18 ° C al fine di evitare la permeabilità del sistema. Quando per dissezione e durante tutta la procedura di colorazione, è importante evitare di danneggiare il tessuto per ottenere ottimi risultati di colorazione. Infine, devono essere considerati due aspetti tecnici: il tempo di scossa di calore definisce la quantità di cellule in cui sono espressi i tag. Una scossa di calore breve porterà ad etichettatura di alcune cellule, mentre una scossa di calore lungo induce l'espressione di tag in molte cellule fino al caso estremo in cui tutte le cassette di FRT-fermata-FRT vengono rimossi dai giornalisti, in tutte le cellule. In questo caso, un solo colore (l'Unione dei tre tag epitopo) sarà presente, impedendo la visualizzazione delle morfologie di singola cellula. Il tempo di scossa di calore varia a seconda del sito di inserimento di hsp-Flp e il driver di GAL4, quindi un passaggio di ottimizzazione iniziale potrebbe essere necessario. L'espressione del marcatore è casuale e non può essere destinato a una specifica sottopopolazione di cellule guidato dal driver GAL4. All'interno di una cella, può essere espresso diversi tag consentendo la macchiatura dell'anticorpo delle cellule con differenti colori vicine. Tuttavia, in alcuni casi, più di un tag è espresso in una cella che portano alla sovrapposizione dei due colori.
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Disclosures
Nessuno degli autori hanno interessi concorrenti o in conflitto.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Arnim Jenett, Aljoscha Nern e altri membri del laboratorio Rubin per consigli e condivisione di reagenti inediti e il Janelia Fly Light Project Team per la generazione di immagini confocal. Gli autori ringraziano anche i membri del laboratorio Gallia per commenti sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P.
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
