Summary
Celler vise forskellige morfologier og etablere en række forskellige interaktioner med deres naboer. Denne protokol beskriver, hvordan at afsløre morfologi af enkelt celler og undersøge celle-celle interaktion ved hjælp af veletablerede Gal4/UAS udtryk system.
Abstract
Celler vise forskellige morfologier og komplekse anatomiske relationer. Hvordan celler interagere med deres naboer? Afviger interaktionerne mellem celletyper eller selv inden for en given type? Hvilke typer af rumlige regler kan de følge? Svarene på sådanne grundlæggende spørgsmål i vivo har hidtil været hæmmet af en mangel på værktøjer til høj opløsning enkelt celle mærkning. Her, er en detaljeret protokol til at målrette enkelt celler med en flerfarvet FlpOut (MCFO) teknik leveret. Denne metode bygger på tre anderledes tagged journalister (HA, FLAG og V5) under UAS kontrol, der holdes stille af en transcriptional terminator flankeret af to FRT websteder (FRT-stop-FRT). En heat shock puls inducerer udtryk af en heat shock-induceret Flp recombinase, som tilfældigt fjerner FRT-stop-FRT kassetter i enkelte celler: udtryk forekommer kun i celler, der også udtrykke en GAL4 driver. Dette fører til en bred vifte af forskelligt farvede celler af en bestemt celletype, der giver mulighed for visualisering af individuelle celle morfologier med høj opløsning. Som et eksempel, kan MCFO-teknikken kombineres med specifikke glial GAL4 drivere til at visualisere morfologier af forskellige glial undertyper i voksen Drosophila hjernen.
Introduction
Glia, ikke-neuronal celle population af nervesystemet (NS), var længe ment, at skabe en statisk ramme for neuroner og derfor er undersøgt ikke i detaljer. Men i mennesker, glia udgør langt størstedelen af cellerne i NS (~ 90%) og falder i flere forskellige kategorier, herunder astrocytter, oligodendrocytes, mikroglia og Schwann celler. I Drosophila, glia udgør omkring 10% af cellerne i NS. Intriguingly, er deres morfologier og funktioner bemærkelsesværdigt ens til dem, der findes i hvirveldyr1,2. Deres morfologier omfatte blod - hjerne barrieren (BBB) danner epitheler, ensheathing og astrocyte-lignende celler.
Drosophila centralnervesystemet (CNS) består af de følgende vigtigste strukturer: cortex regioner, der indeholder de neuronale celle organer; neuropils, som havnen synaptiske forbindelser; små og store axon skrifter, der forbinder de forskellige neuropiles; perifere nerver, der forbinder sanseorganer og muskler med CNS (figur 1). Glia findes forbundet med alle disse anatomiske strukturer: Cortex glia (CG) i de kortikale regioner, astrocyte-lignende glia (ALG) og ensheathing glia (EG) i neuropile regionerne, ensheathing glia er også forbundet med centrale axon skrifter og perifere nerver (EGN), og endelig, to ark-lignende glia, perineurial glia (PG) og subperineurial (SPG), der tilsammen danner et sammenhængende lag, der dækker hele NS (figur 2).
Tidligere undersøgelser har vist at glia spiller en vigtig rolle i udviklingen af NS; de overvåge neuronal celle numre ved at reagere på systemisk cirkulerende insulin-lignende peptider, trofiske støtte til neuroner, såsom astrocyte-neuron laktat lufthavnstransport, og fjerne døende neuroner ved fagocytose3,4 , 5 , 6. i den modne NS, glia opretholde BBB, tage op neurotransmittere og vedligeholde ionisk homøostase, fungere som de store immunceller i NS, da makrofager ikke kan overtræde BBB, og modulere synaptic aktivitet samt dyrs adfærd6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Om de forskellige glial undertyper udfører specialiserede funktioner forbliver et vigtigt åbent spørgsmål. Men en systematisk genome-wide analyse om glia, især i voksen er blevet hæmmet af en mangel på relevante genetiske værktøjer til deres manipulation. Her præsenteres en metode, der giver mulighed for effektiv og nem karakterisering af celle figurer at studere komplekse celle-celle interaktioner. Denne teknik er blevet anvendt til at karakterisere morfologi af de forskellige glial undertyper i voksen Drosophila hjernen, men afhængigt af den specifikke GAL4 driveren bruges, det kunne tilpasses for at studere neuroner12,13 , enhver form for sammenblanding celler, og i princippet alle væv i ethvert udviklingstrin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberede fluer til eksperimenter med flerfarvet FlpOut (MCFO)
Bemærk: The MCFO teknik refererer til en modificeret udgave af den såkaldte Flp-medierede stop kassette excision (FlpOut). Transgene MCFO fluer bære en heat shock promotor (hsp)-Flp recombinase og forskellige journalister under UAS styre. Hver reporter består af en fælles rygraden i en myristoylated (myr) super mappe grøn fluorescerende proteiner (sfGFP), i hvilke 10 eksemplarer af en epitop tag (fx., HA, FLAG eller V5) er indsat. De deraf følgende ikke-fluorescerende proteiner er opkaldt " spaghetti monster GFPs " (smGFPs) 14 og kan påvises ved hjælp af specifikke antistoffer mod forskellige epitop tags.
- Kors flyver med MCFO kassette og hsp-Flp (hsp-Flp, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) til de relevante glial GAL4 driver linjer (se tabel af materialer) .
- Som hsp er allerede aktive ved 25 ° C og få celler kan gennemgå rekombination fører til en uspecifik mærkning, nedsat krydser ved 18 ° C for at undgå leakiness af systemet. Vent omkring 20 dage ved 18 ° C til indhente F1-generation. Efter varmen chok (Se trin 2), opretholde fluer ved 25 ° C ( figur 3).
2. Heat Shock
Bemærk: afhængigt af indsættelsesstedet, effektiviteten af hsp-Flp kan variere; optimal varme chok tid har derfor skal optimeres. For denne protokol, har været anvendt en MCFO flyve bestand som hsp-Flp blev indsat på X-kromosom (Se Tabel of Materials).
- Overførsel korset i trin 1.1 afkom (F1 generation fluer, 3-4 dage gamle) i nye hætteglas indeholdende mad og varme chok dem ved 37 ° C i et vandbad.
Bemærk: Unge fluer (1-2 dage gammel) er meget følsomme over for varme chok. Vent 1 eller 2 dage mere, før du udfører varme chok for at reducere dødelighed forårsaget af behandlingen. Brug nogle af F1-generation flyver som en kontrol, uden varme chok. - Under den varme chok, opretholde fluer i normal hætteglas med mad for at reducere antallet af stress-induceret dødelighed. Sætte hunner og hanner i separate hætteglas.
- Sørg for at nedsænke hele hætteglasset i vandet for at sikre en ensartet varme chok. Brug en 5-8 min chok som et egnet udgangspunkt for sparsomme mærkning om glia celler med mange GAL4 driver linjer; chok varighed skal optimeres til hver driver og eksperiment (kortere eller længere heat shock gange kan være nødvendigt).
- Efter det varme chok, lægge hætteglas vandret på bænken i et par minutter for at tillade fluer til at inddrive fra den varme chok.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at ændre hætteglassene. - Vedligehold fluer ved 25 ° C og dissekere (Se trin 3 og 4) dem 2 eller flere dage efter varme chok for optimal reporter udtryk.
3. Dissektion forberedelse og løsninger
- dag af dissektion, forberede frisk Fikseringsvæske løsning i 200 µL PCR rør ved at blande 180 µL af S2 cellekulturmedium med 20 µL af 20% PARAFORMALDEHYD (PFA) at opnå en 2% PFA løsning. Opretholde den Fikseringsvæske løsning på is før og under dissektion.
Forsigtig: PFA er giftigt og skal håndteres med omhu.
Bemærk: Bland 160 µL af S2 cellekulturmedium med 40 µL af 20% PARAFORMALDEHYD (PFA) i en 200 µL PCR rør til at forberede en 4% PFA løsning i stedet for en 2% opløsning. - Bruge en PCR rør pr. genotype med et maksimum på 8-10 hjerner pr. rør for optimal farvning resultaterne.
- Forbereder den voksne hjerne vask løsning: 0,5% bovint serumalbumin, 0,5% Triton X-100 i PBS.
Bemærk: Afhængigt af farvning, en oploesning indeholdende 1% kan Triton X-100 være nødvendig. En højere koncentration af Triton X-100 øger penetration af antistof i væv og det er nødvendigt at pletten regioner, der ligger dybt inde i vævet (fx synaptic regioner i den voksne Drosophila hjerne). - Forbereder den blokerende løsning: 3% normal ged serum, 3% normal æsel serum og 0,5% Triton X-100 i PBS.
- Den voksne hjerne vask løsning og den blokerende løsning kan opbevares ved 4 ° C for et par uger.
- Sætte dyb depression wells glasplade på is og udfylde hver godt med følgende løsninger: en med 70% ethanol, en med PBS, og en med S2 cellekulturmedium.
4. Voksen hjerne dissektion
- placere en 3 cm dissekere parabol på scenen i et stereomikroskop og fyld den med koldt S2 cellekulturmedium. Gennemføre alle dissektioner i dette medie til at sikre, at væv forbliver raske under proceduren dissektion.
Bemærk: Brug et dissekere parabol foret med flere millimeter af sort silikone, som giver en god baggrund kontrast (i billeder), og bevare pincet i dissektion. - Bedøver fluer af den ønskede genotype med CO 2.
- Med pincet, fange flyve med vingerne og vaske det i koldt 70% ethanol til 30 s, derefter med kolde PBS for yderligere 30 s.
- Overføre flyve ind i dyb depression godt, der er fyldt med S2 cellekulturmedium.
- Gentag den samme procedure for alle fluer af samme genotype og fastholde dem i kolde S2 cellekulturmedium indtil dissektion, som vil bevare vævet.
Bemærk: Bedøver kun antallet af fluer, som kan blive dissekeret i en periode på ca. 30 min. lang inkuberingstider i S2 cellekulturmedium kan beskadige vævet. - Grab flue med pincet og under et stereomikroskop nedsænkes i farten i S2 cellekulturmedium.
- Løsrive hovedet fra resten af kroppen. Kassér kroppen og holde hovedet neddykket i S2 cellekulturmedium. Det er yderst vigtigt at holde hovedet med pincet for hele varigheden af dissektion. Hvis hovedet begynder at flyde, det bliver svært at hente det uden at beskadige vævet.
- Begynde dissektion ved at trække det ene øje, mens du holder hovedet med mindst én pincet på alle tidspunkter. Sørg for, at spidsen af pincet lige under nethinden til at undgå skader væv nedenunder. Træk andet øje og begynde at fjerne neglebånd indtil hjernen vises.
- Fjerner alle trakeale væv og neglebånd omkring hjernen indtil vævet vises ren. Sørg for at fjerne alle trakeale væv omkring hjernen for optimal farvning resultaterne; væv er nu klar til at være faste og farves.
- Opretholde alle de dissekerede hjerner i kolde S2 celle næringssubstratet før du overfører dem til PFA løsning for at tid trinnet fiksering.
5. Voksen hjerne farvning
< ol>Bemærk: Inkuberingstider kan variere afhængigt af antistof anvendes. Længere inkubationer kan være nødvendigt.
- For mærkning af de tre MCFO markører, inkuberes hjerner med anti-HA (1: 500), anti-FLAG (DYKDDDDK epitop) (1: 100), og anti-V5 primære antistoffer.
- Primære direkte-konjugerede antistoffer kan anvendes i stedet for de normale primære + sekundær kombination (fx., anti-V5:DyLight 549 (1:200)). I dette tilfælde behandler de direkte-konjugerede antistoffer som sekundære antistoffer.
Bemærk: For hver genotype, beholde nogle hjerner som kontrol for at verificere specificiteten af farvning. Springe primære antistof inkubation og gå direkte til næste trin.
Bemærk: eksempler på relevante antistoffer: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1:200) og DyLight 647 (1: 100)-konjugerede antistoffer.
6. Montering af hjerner til Imaging
- Trim an imaging spacer til en passende størrelse ved hjælp af saks. For høj opløsning mikroskopi, sandwich modellen og imaging spacer mellem to glas coverslips.
Bemærk: Imaging spacere er tynde (0,12 mm tyk) klæbende afstandsstykker, skræl og holde sig til glas coverslips eller mikroskop slides, giver mulighed for montering af enheder uden komprimering. - Brug af pincet, Fjern den selvklæbende liner fra en overflade og anvende spacer, selvklæbende side ned, på overfladen af et glas coverslip (22 mm x 60 mm). Anvend 10 µL af montering medium til en ny glas coverslip.
- Med et P10 pipette, overføre hjerner fra 200 µL tube til coverslip, ved siden af henlægge af montering medium. Sammen med væv, overføre nogle PBS for at opretholde hjerner i løsning.
- Med et P10 pipette, flytte hjerner fra PBS til dråbe af montering medium forsøger at begrænse mængden af PBS. Overføre modellerne i montering medium på coverslip med den billeddiagnostiske spacer. Bruge nok montering medier til at dække modellen.
- Fjerne andre klæbende foringen fra oversiden af spacer og tilføje et glas coverslip på toppen af modellerne. Med spidsen af en pincet, anvende en blide tryk over selvklæbende område for at forsegle. Billede monteret væv umiddelbart eller gemme dias ved-20 ° C til senere analyse.
7. Billed tilegnelse
- erhverve stakke af Konfokal fluorescens billeder ved hjælp af en Konfokal mikroskop med en 40 X (NA = 1,2, vand fordybelse) mål eller 63 X (NA = 1,4, immersionsolie) mål (pixel størrelser = 1.024 x 1.024 i xy-plan; Afstand mellem to Konfokal sektioner = 0,5 µm). Justere detektor gevinst og forskydning i hver kanal på en sådan måde, at ingen mættede pixel og nulværdier pixel er til stede i billederne; Dette undgår information tab og sikrer anvendelse af den fulde dynamiske rækkevidde af detektoren.
Bemærk: Da 3D imaging er tidskrævende, målingerne kan automatiseres ved at scanne flere prøver samtidig på forskellige steder. For at undgå fordampning med vand fordybelse mål, bruge særlige olie fordybelse medium med brydningsindeks n = 1,33. - Behandle de Konfokal stakke for maksimal tæthed fremskrivninger, ændringer i kanal hue, og justering af lysstyrke og kontrast, ved hjælp af standard billede analyse software (Se Tabel of Materials).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit illustrerer eksempler på resultater, der kan opnås ved hjælp af MCFO teknik i voksen Drosophila hjernen. Figur 3 viser en skematisk af metoden. Tre anderledes membran-tagged journalister (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG og myr-smGFP-V5) under UAS kontrol holdes stille af en transcriptional terminator flankeret af to FRT websteder (FRT-stop-FRT). En heat shock puls inducerer udtryk af Flp recombinase, som tilfældigt fjerner FRT-stop-FRT kassetter i individuelle celler. Dette fører til en bred vifte af forskelligt farvede celler for en given celletype, angivet af GAL4-driveren benyttes.
Samlede, syv farver er muligt. Figur 4 og figur 5 viser de enkelt morfologier af EG og ALG celler i Drosophila antennal lap (AL), henholdsvis. Øge varme chok tid inducerer en øget mængde af mærket celler, afhængigt af GAL4 driver, en indledende optimering af heat shock protokol er derfor nødvendigt. Figur 6 viser mærkning af EG i Drosophila optik lap (OL) med enkelt MCFO journalister.
Figur 1: Anatomi af en voksen Drosophila NS. De kortikale regioner (punkteret grå områder) indeholder alle de neuronale og de fleste af de glial celle organer, mens neuropile regionerne (blå områder) indeholder de synaptiske forbindelser. Tarmkanalen regioner (mørkeblå) tilslutte de forskellige neuropiles. Dette tal er blevet ændret fra Kremer et al. (2017) 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: generiske glial undertyper i Drosophila CNS. En membran-tagged normal god landbrugspraksis (UAS-mCD8-NGL) reporter drevet af specifikke GAL4 drivere giver mulighed for visualisering af de fem generiske glial undertyper (PG: perineurial glia, SPG: subperineurial glia, CG: cortex glia, ALG: astrocyte-lignende glia og EG: ensheathing glia). Neuropil regioner (magenta områder) er registreret med den præsynaptiske markør NC82 (BRUCHPILOT). I bunden, er celletal for de forskellige glial undertyper også vist. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: passage ordningen for MCFO teknik. Skematisk af MCFO teknik. Homozygousvirgins transporterer MCFO kassette og hsp-Flp (hsp-Flp, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) er krydset med specifikke homozygote GAL4 driver hanner. F1-generation er derefter varme chokeret. Afhængig af antallet af FRT-stop-FRT kassetter tilfældigt fjernet fra journalisterne, er syv forskellige farver muligt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: morfologi af ensheathing glia (EG) i den antennal lap (AL). Konfokal z-stakke af Drosophila AL efter wholemount immunfarvning. (A) morfologi af AL registreret med den præsynaptiske markør NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stokastiske mærkning af EGcells induceret ved at øge varme chok gange: 8 min. (B), 8,5 min (C) og 10 min (D). EG tage på mange forskellige former og størrelser, som de ensheath overfladen af AL. Neighboring fx celler dækker forskellige områder men delvist interdigitate i regioner af kontakt. Skalalinjen = 20 µm. HA: Human influenza hemagglutinin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: morfologi af astrocyte-lignende glia (ALG) i den antennal lap (AL). Konfokal z-stakke af Drosophila AL efter wholemount immunfarvning. (A) morfologi af AL registreret med den præsynaptiske markør NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stokastiske mærkning af ALG celler inducerede ved at øge varme chok gange: 8 min. (B), 10 min (C) og 15 min (D). ALG Vis variabel størrelse og morfologier men dækker stort set ikke-overlappende områder. Skalalinjen = 20 µm. HA: Human influenza hemagglutinin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: morfologi af ensheathing glia (EG) i den optiske lap (OL). Konfokal z-stakke af Drosophila OL efter wholemount immunfarvning. (A-C) MCFO mærkning med tre stop-kassette journalister med HA, FLAG og V5 myr-smGFPs. FLP recombinase er fremkaldt ved en 10 min varme chok ved 37 ° C. (A-C) Enkelte MCFO journalister og Flet (D) er vist. Skalalinjen = 20 µm. HA: Human influenza hemagglutinin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en nem og effektiv metode til at studere morfologi af forskellige celletyper i et væv af interesse i høj opløsning. Med MCFO teknikken anvendes flere journalister med forskellige epitop tags i kombination for multicolor stokastiske mærkning (figur 2). I lighed med andre metoder såsom Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO øger etiket mangfoldighed gennem markør coexpression, tillade visualisering af cellegrænserne for celle-celle interaktion undersøgelser. For eksempel, med tre journalister er syv potentielle markør kombinationer muligt. I forhold til tidligere mærkning metoder, MCFO teknik viser en mere præcis og nem kontrol af cellen mærkning tæthed17: Flybow 1,0 fluer express standard markør der gør enkelt celle mærkning vanskeligere; Flybow 2.0 fluer kræver udtryk for to forskellige Flp recombinases at gøre systemet mere kompliceret.
Afhængigt af den specifikke GAL4 driver benyttes, kan MCFO teknikken tilpasses studere alle væv på enhver udviklingsstadiet. Her, er teknikken blevet anvendt til at karakterisere morfologi af de generiske glial undertyper i voksen Drosophila hjernen med høj opløsning. Flerfarvet mærkning af enkelt celler giver mulighed for visualisering af de forskellige grænser og hjælper med at forstå, for eksempel, de rumlige interaktion mellem to tilstødende celler; ud over de PNG og SPG celler, som er beregnet til form epitheler, alle andre glial undertyper Vis flisebelægning, er de minimere kontakt med deres glial naboer, samtidig med at maksimere kontakt med den indhyllede neuronal rum (cellen kroppen, axoner, dendrites, og synapser). De alle sender fint lamellipodial eller filopodial processer, ikke kun i deres lokale kvarter, men også i fjerne omgivelser18.
For succesen med denne protokol er det afgørende at opdrætte fluer på 18 ° C for at undgå leakiness i systemet. Når dissekere og under hele farvning proceduren, er det vigtigt at undgå skader på væv for optimal farvning resultaterne. Endelig, to tekniske aspekter skal tages i betragtning: heat shock tid definerer antal celler, tags er udtrykt. En kort varme chok vil føre til mærkning af et par celler, mens en lang heat shock vil fremkalde udtryk af tags i mange celler op til det ekstreme tilfælde, hvor alle FRT-stop-FRT kassetter er fjernet fra reportere, i alle celler. I dette tilfælde vil kun én farve (sammenfletning af de tre epitop tags) være til stede, forhindrer visualisering af enkelt celle morfologier. Heat shock tid varierer afhængigt af indsættelsesstedet hsp-Flp og driver GAL4 derfor en indledende optimering skridt kan være nødvendigt. Markør udtryk er tilfældige og ikke kan være målrettet til en bestemt celleområde drevet af GAL4 driver. Inden i en celle, kan forskellige tags udtrykkes aktivering antistoffarvning af tilstødende celler med forskellige farver. Men lejlighedsvis, mere end ét mærke er udtrykt i én celle fører til overlapning mellem de to farver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har konkurrerende eller modstridende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takke Arnim Jenett, Aljoscha Nern og andre medlemmer af Rubin laboratorium for rådgivning og deling af ikke-udgivne reagenser og Janelia flyve lys projektgruppen til at generere Konfokal billeder. Forfatterne også takke medlemmerne af Gallien laboratorium for kommentarer på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P.
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
