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Cancer Research

सेल आक्रमण और प्रवासन प्रक्रिया का मूल्यांकन: वीडियो माइक्रोस्कोप की तुलना-खरोंच घाव परख और Boyden चैंबर परख आधारित

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56337
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,3, 1,3, 1,3, 1,2, 1,3, 1,2
1UMR CNRS 5822 /IN2P3, IPNL, PRISME, Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire, Faculté de Médecine Lyon-Sud, Université Lyon 1, 2Département de Radiothérapie, Institut de Cancérologie de la Loire - Lucien Neuwirth, 3Hospices Civils de Lyon, Centre Hospitalier Lyon-Sud
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन सेल आक्रमण और प्रवास के विश्लेषण के लिए दो अलग तरीके रिपोर्ट: Boyden चैंबर परख और इन विट्रो वीडियो माइक्रोस्कोप पर आधारित घाव-चिकित्सा परख । इन दोनों प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया जाता है, और उनके लाभ और हानि की तुलना की जाती है ।

Abstract

आक्रमण और ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास क्षमताओं कैंसर प्रगति और पुनरावृत्ति के लिए मुख्य योगदान कर रहे हैं । कई अध्ययनों से पता लगाया है प्रवासन और आक्रमण क्षमताओं को समझने की कैसे कैंसर कोशिकाओं का प्रसार, नए उपचार रणनीतियों के विकास के उद्देश्य के साथ । सेलुलर और इन क्षमताओं का आणविक आधार का विश्लेषण सेल गतिशीलता और cytoskeleton और सेलुलर microenvironment के भौतिक गुणों के लक्षण वर्णन करने के लिए नेतृत्व किया गया है । कई वर्षों के लिए, Boyden चैंबर परख और खरोंच घाव परख मानक तकनीकों को सेल आक्रमण और प्रवास का अध्ययन किया गया है । हालांकि, इन दो तकनीकों में सीमाएं हैं । Boyden चैंबर परख मुश्किल और समय लगता है, और खरोंच घाव परख कम reproducibility है । आधुनिक प्रौद्योगिकियों के विकास, विशेष रूप से माइक्रोस्कोपी में, खरोंच घाव परख के reproducibility वृद्धि हुई है । शक्तिशाली विश्लेषण प्रणाली, एक "में-मशीन" वीडियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए स्वचालित और सेल प्रवास और आक्रमण के वास्तविक समय विश्लेषण प्रदान किया जा सकता है । इस कागज का उद्देश्य रिपोर्ट और दो सेल आक्रमण और प्रवास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया परख: Boyden चैंबर परख और एक अनुकूलित इन विट्रो वीडियो माइक्रोस्कोप पर आधारित खरोंच घाव परख की तुलना में है ।

Introduction

कोशिका आक्रमण और प्रवास कैंसर कोशिकाओं के प्रसार में शामिल हैं, जो उपचार के लिए प्रतिरोध का मुख्य कारण है1 और कैंसर के उपचार के बाद locoregional या मेटास्टेटिक पुनरावृत्ति करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं2. उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT) सेल आक्रमण की प्रारंभिक प्रक्रिया है-माइग्रेशन जिसमें कैंसर कोशिकाओं एक उपकला से एक mesenchymal phenotype के लिए स्विच. ई-Cadherin उपकला phenotype3की एक extracellular मार्कर है, और N की वृद्धि की अभिव्यक्ति-Cadherin और vimentin mesenchymal phenotype4की विशेषता है. प्रवासन भी कैंसर कोशिकाओं की आंतरिक क्षमता पर निर्भर करता है extracellular मैट्रिक्स (ECM) की कार्रवाई के माध्यम से आक्रमण करने के लिए मैट्रिक्स metalloproteases5।

इस आक्रमण-प्रवासन तंत्र कई स्थानों पर कैंसर के लिए वर्णित किया गया है, विशेष रूप से सिर और गर्दन के कैंसर में6। कई शोधकर्ताओं ने प्रवास और आक्रमण प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया है बेहतर समझ कैसे कैंसर कोशिकाओं को उंमीद है कि इस ज्ञान को नए उपचार रणनीतियों को बढ़ावा मिलेगा में प्रसार । यह महत्वपूर्ण है कि इन अध्ययनों विश्वसनीय और प्रतिलिपि परख का उपयोग किया जाता है ।

इन विट्रो में सेल गतिशीलता का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । कई साल पहले विकसित, Boyden चैंबर परख आक्रमण के लिए मानक माना जाता है-प्रवासन विश्लेषण7। हालांकि, यह समय लगता है और अक्सर गलत है । एक दूसरे परीक्षण घाव-चिकित्सा परख8है, जो एक सेल monolayer संस्कृति पर एक खरोंच बनाने और निश्चित समय अंतराल पर सेल आक्रमण और प्रवास की छवियों पर कब्जा करना शामिल है । इस तकनीक की वजह से दो क्रमिक परीक्षणों के परिणामों के बीच बड़े बदलावों की व्यापक रूप से आलोचना की गई है. हालांकि, आधुनिक प्रौद्योगिकियों के आवेदन, विशेष रूप से माइक्रोस्कोपी में, खरोंच घाव परख के reproducibility में सुधार हुआ है । वीडियो सूक्ष्मदर्शी आसानी से मशीन में पेश किया जा सकता है और सेल प्रवास के वास्तविक समय छवियों को उत्पंन कर सकते हैं । इन उपकरणों सूक्ष्म डेटा रिकॉर्ड और समय के साथ घाव सेल संगम का स्वत: विश्लेषण प्रदान करते हैं । इस कागज का उद्देश्य Boyden चैंबर परख और अनुकूलित खरोंच घाव परख का वर्णन है, और लाभ और प्रत्येक दृष्टिकोण की कमजोरियों पर चर्चा ।

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Protocol

नोट: Boyden चैंबर और ECM के शामिल किए जाने के बिना खरोंच परख प्रवास परख के रूप में भेजा जाता है, और ECM के साथ ही परख आक्रमण परख के रूप में जाना जाता है ।

1. Boyden चैंबर परख

नोट: इस प्रोटोकॉल SQ20B सेल लाइन है, जो एक आवर्तक सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) स्वरयंत्र कैंसर से व्युत्पंन और जॉन लिटिल (बोस्टन, MA, संयुक्त राज्य अमरीका) से प्राप्त की है के लिए अनुकूलित है ।

Day 1

  1. सेल सीडिंग
    1. बीज २ १० 6 SQ20B कोशिकाओं में संस्कृति माध्यम (सेमी) की 12 मिलीलीटर में एक १७५ सेमी 2 कुप्पी ७२ एच में एक दिन पहले और कोशिकाओं ८०% सेल संगम करने के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
      1. SQ20B कोशिकाओं के लिए सेमी तैयार करने के लिए, पूरक Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के साथ 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), ०.०४ मिलीग्राम/एमएल hydrocortisone, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और ०.१ g/L streptomycin.
    2. एक लामिना प्रवाह हूड के तहत, कोशिकाओं trypsinize । मध्यम निकालें, बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ कोशिकाओं को धोने, और trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (०.५ g/L) की २.५ मिलीलीटर जोड़ें. ३७ ° c पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन और फिर ३७ ° c करने के लिए गर्म सेमी के १२.५ मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो । किसी कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की संख्या गिनना ।
    3. बीज प्रत्येक शर्त के लिए मूल्यांकन किया जा करने के लिए ६ १० 5 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व पर एक 25 सेमी 2 कुप्पी में कोशिकाओं । सेमी की 3 मिलीलीटर में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को मशीन ।

Day 2

  1. कोशिका भुखमरी और लेपित मंडलों की तैयारी
    1. प्रत्येक कुप्पी में मध्यम की जगह से 3 मिलीलीटर कम भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) मध्यम का उपयोग ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के बजाय FBS के द्वारा भूख से मर । मशीन में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को भूखा ।
      1. भुखमरी सेमी (एस-मुख्यमंत्री) तैयार करने के लिए, ०.१% BSA के साथ पूरक DMEM, ०.०४ मिलीग्राम/एमएल hydrocortisone, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और ०.१ g/L streptomycin ।
    2. माइग्रेशन परख के लिए, चरण १.३ पर जाएं ।
    3. आक्रमण परख के लिए, 12 3 दिन से पहले ज, एक लेपित चैंबर के लिए एस के ५०० μL जोड़कर लेपित Boyden मंडलों तैयार करते हैं । व्यावसायिक रूप से तैयार लेपित Boyden कक्षों का उपयोग करें और उपयोग से पहले उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें । साथी थाली में प्रत्येक Boyden चैंबर प्लेस और यह मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेट ।

Day 3

  1. Boyden चैंबर में सेल सीडिंग
    1. chemoattractant तैयार करने के लिए साथी थाली का उपयोग करें । 10% FBS, ०.०४ mg/एमएल hydrocortisone, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और ०.१ g/L streptomycin के साथ पूर्ण माध्यम के ७५० μL के साथ 24-well कंपेनियन प्लेट के प्रत्येक कुआं भरें ।
      1. प्रत्येक कक्ष पंक्ति और प्रत्येक उपचार स्थिति के लिए chemoattractant अनुकूलित करें । chemoattractant सेमी (सीए-सेमी) तैयार करने के लिए, पूरक DMEM के साथ 10% FCS, ०.४ मिलीग्राम/एमएल hydrocortisone, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, और ०.१ g/L streptomycin ।
    2. इस बुलबुले से बचने के लिए देखभाल ले रही है, एक filled साथी थाली में ऊपरी चैंबर स्थानांतरण ।
    3. आक्रमण परख के लिए, ध्यान से प्रत्येक Boyden कक्ष से मुख्यमंत्री के ४५० μL निकालें ।
    4. एक लामिना प्रवाह हूड के तहत, कोशिकाओं trypsinize । मध्यम निकालें, बाँझ पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने, trypsin EDTA (०.५ जी/एल) की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें, और फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । ३७ ° c करने के लिए गर्म सेमी जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो । किसी कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की संख्या गिनना ।
    5. बीज ३ १० 4 SQ20B कोशिकाओं ०.१% BSA माध्यम के ५०० μL में, ६ १० 4 कोशिकाओं के एक अंतिम कमजोर पड़ने दे/
      नोट: सेल एकाग्रता प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
    6. मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्लेट प्लेस ।

Day 4

  1. सेल निर्धारण और धुंधला
    1. उस कक्ष पंक्ति के लिए विशिष्ट दोहरीकरण समय से पहले कक्षों को ठीक करें । 24 ज से पहले SQ20B कक्षों को ठीक करें ।
    2. साथी थाली से प्रत्येक डालने निकालें और ध्यान से एक कपास झाड़ू का उपयोग कर ऊपरी चैंबर से कोशिकाओं को हटा दें । यह विशेष रूप से ऊपरी कक्ष में स्थित सभी कक्षों को निकालने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    3. फिक्स और प्रत्येक सम्मिलित दाग व्यक्तिगत रूप से मई प्राप्त करने के लिए-Grunwald Giemsa रंगाई9 का उपयोग कर धुंधला किट प्रदान की । वैकल्पिक रूप से, एक 30 मिनट निर्धारण के लिए एक और साथी थाली में 4% paraformaldehyde का उपयोग करें ।
    4. एक प्रयोगशाला हूड के तहत एक खाली 24 अच्छी तरह से साथी प्लेट में आवेषण रखो प्रत्येक चैंबर शुष्क ।

Day 5

  1. सूक्ष्म विश्लेषण
    1. एक 20 चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप पर आवेषण के साथ साथी थाली डालें और झिल्ली के निचले हिस्से पर प्रत्येक माइग्रेट सेल गिनती । शीर्ष करने के लिए नीचे से उद्देश्य चलती द्वारा सही फोकस स्थिति का अनुकूलन, और झिल्ली के नीचे भाग पर स्थिति को रोकने के ।
    2. माइग्रेट किए गए कक्षों और वरीयता प्राप्त कक्षों की संख्याओं के बीच अनुपात परिकलित करें. दोहराएं प्रत्येक तपसिल में उपचार हालत के लिए गिनती ।

2. खरोंच घाव परख: सेल प्रवासन

नोट: निर्देश कक्ष के प्रत्येक प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

Day 1

  1. सेल सीडिंग
    1. बीज 2 x 106 SQ20B कोशिकाओं में सेमी की 12 मिलीलीटर में एक १७५ सेमी2 कुप्पी ७२ एच में एक दिन पहले और कोशिकाओं ८०% सेल संगम करने के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. एक लामिना प्रवाह हूड के तहत, कोशिकाओं trypsinize । मध्यम निकालें, बाँझ पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने, trypsin EDTA (०.५ जी/एल) के २.५ मिलीलीटर जोड़ने, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म सेमी की १२.५ मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो । किसी कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की संख्या गिनना ।
    3. 4 x 105/mL के एक सेल घनत्व पर एक पतला नमूना उत्पंन, १०० μL प्रति एक अच्छी तरह से में ४ १० 4 कोशिकाओं के एक अंतिम घनत्व दे रही है । इस एकाग्रता प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और 1 x 104 के लिए ६ १० 4 कोशिकाओं की श्रेणी में होना चाहिए ।
    4. चरण 2.1.2 में तैयार समाधान के १०० μL जमा करके एक ९६-well थाली के प्रत्येक कुआं में बीज कोशिकाओं ।
    5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली छोड़ कुओं के नीचे समान रूप से कोशिकाओं को फैलाने के लिए ।
    6. मशीन में थाली प्लेस और कोशिकाओं को 12 से 16 घंटे के लिए प्लेट का पालन करने की अनुमति (अधिकतम) ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।

Day 2

  1. खरोंच घाव परख
    1. मशीन से कदम २.१ में तैयार प्लेटों को हटा दें ।
    2. हुड के तहत, एक घाव वाणिज्यिक घायल डिवाइस का उपयोग कर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    3. तुरंत एक अच्छी तरह से एक रूपांतरित शंकु टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग कर के माध्यम से हटाने, ध्यान घाव को छूने के लिए नहीं ले ।
    4. दो बार आकांक्षा दोहरा और एक अच्छी तरह के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म सेमी की १०० μL का उपयोग करके कोशिकाओं को धो लें ।
    5. धो चरणों के बाद एक अनुकूलित शंकु टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग कर सेमी निकालें ।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक उपचार शर्त के लिए मध्यम विशिष्ट के १०० μL जोड़ें ।
    7. कुओं में कोई भी बुलबुले बनाने से बचने की कोशिश करें । एक रिवर्स pipetting तकनीक यहां सहायक हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक सिरिंज सुई के साथ बुलबुले को दूर.
    8. वीडियो माइक्रोस्कोप के अनुकूलित रैक में थाली प्लेस ।
    9. छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, थाली की थाली के निचले हिस्से पर संघनित्र से बचने के लिए पहले स्कैन से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    10. कार्यक्रम स्कैन की अनुसूची, अच्छी तरह से प्रति एक छवि पर वीडियो माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । आक्रमण-माइग्रेशन प्रयोग के लिए अधिकतम 2-h अंतराल आवश्यक है । यदि प्रयोग का उद्देश्य एक वीडियो उत्पादन करने के लिए है, 30 मिनट अधिकतम का एक अंतराल पसंद है ।
    11. प्रयोग के अंत में, जख्मी डिवाइस को सावधानी से धोएं और निर्माता द्वारा दर्शाई गई चार वाशिंग स्टेप्स में से प्रत्येक का पालन करें ।

3, 4, और 5 दिन

  1. वीडियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर माइग्रेशन का विश्लेषण
    1. न्यूनतम 24 घंटे के लिए और 5 दिनों तक, कक्ष माइग्रेशन की निगरानी और जांच करें.
    2. कक्ष माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए अनुकूलित एक उपयुक्त कक्ष मास्क का उपयोग करें । प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित एक सेल मास्क प्राप्त करने के लिए, एक विशिष्ट सेल छवि संग्रह का उपयोग कर सॉफ्टवेयर से एक सेल प्रोसेसिंग परिभाषा उत्पंन करते हैं ।
    3. ट्रेस घटता है और एक स्प्रेडशीट, जो विश्लेषण और परिणामों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है डेटा निर्यात ।

3. खरोंच घाव परख: सेल आक्रमण

नोट: निर्देश कक्ष के प्रत्येक प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

Day 1

  1. सेल सीडिंग
    1. चरण २.१ में वर्णित के रूप में कक्ष सीडिंग के लिए एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।

Day 2

  1. ECM की तैयारी
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने से पहले कम से कम 12 ज के लिए मैट्रिक्स को ठंढ । सुनिश्चित करें कि कोई समुच्चय दिखाई दे रहे हैं । यदि समुच्चय दृश्यमान हैं, तो मैट्रिक्स को एक लंबी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि समुच्चय गायब न हो जाए । मैट्रिक्स बर्फ पर रखो । पिपेट का उपयोग करें ।
      नोट: मैट्रिक्स अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर नहीं रखा जमना होगा ।
    2. 5 मिनट के लिए बर्फ पर microcentrifuge ट्यूबों चिल ।
    3. लो सेमी फ्रिज से 4 ° c करने के लिए ठंडा और ३०० μg/एमएल के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ठंडा microcentrifuge ट्यूबों में मैट्रिक्स पतला ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर के लिए पतला मैट्रिक्स के साथ microcentrifuge ट्यूबों लौटें ।
      नोट: एक ठंडा microcentrifuge ट्यूबों के लिए अनुकूलित रैक प्रयोग भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को बनाए रखने के लिए उपयोगी है ।

Day 2

  1. खरोंच घाव परख और ECM के उपचार
    1. मशीन से कदम ३.१ में तैयार प्लेट निकालें ।
    2. हुड के नीचे, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार घाव को वाणिज्यिक जख्मी उपकरण का उपयोग करना ।
    3. तुरंत एक अच्छी तरह से एक अनुकूलित शंकु टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करने के लिए घाव को छूने के लिए नहीं के माध्यम से मध्यम निकालें ।
    4. दो बार आकांक्षा प्रक्रिया दोहरा और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म सेमी की १०० μL का उपयोग करके कोशिकाओं को धो लें ।
    5. दूसरे धोने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस मशीन पर थाली प्लेस 5 मिनट के लिए अपने तापमान equilibrate के लिए ।
    6. एक शंकु टिप के साथ आकांक्षा पिपेट के साथ एक अच्छी तरह से शीत मध्यम निकालें, ध्यान किनारे से पिपेट ध्यान रखने के लिए और घाव को छूने से बचने के लिए ।
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा शंकु सुझावों का उपयोग करने के लिए पतला मैट्रिक्स के ५० μL जोड़ें ।
    8. 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में थाली प्लेस ।
      नोट: ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म समर्थन रैक ९६-अच्छी तरह से थाली के वार्मिंग में तेजी लाने के लिए उपयोगी है ।
    9. मशीन से प्लेट निकालें और एक अच्छी तरह से प्रत्येक उपचार हालत के लिए संकेत के रूप में अनुकूलित सेमी के १०० μL जोड़ें ।
    10. कुओं में कोई भी बुलबुले बनाने से बचने की कोशिश करें । एक रिवर्स pipetting तकनीक यहां सहायक हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक सिरिंज सुई के साथ बुलबुले को दूर.
    11. वीडियो माइक्रोस्कोप में अनुकूलित रैक में थाली प्लेस ।
    12. छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, थाली की थाली के निचले हिस्से पर संघनित्र से बचने के लिए पहले स्कैन से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    13. कार्यक्रम स्कैन के अनुसूची, खरोंच घाव स्कैन मोड में, अच्छी तरह से प्रति एक छवि पर वीडियो माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. एक आक्रमण-माइग्रेशन प्रयोग के लिए आवश्यक अधिकतम 2-h अंतराल । यदि प्रयोग का उद्देश्य एक वीडियो उत्पादन करने के लिए है, 30 मिनट अधिकतम का एक अंतराल पसंद है ।
    14. प्रयोग के अंत में, जख्मी डिवाइस को सावधानी से धोएं और निर्माता द्वारा दर्शाई गई चार वाशिंग स्टेप्स में से प्रत्येक का पालन करें ।

3, 4, और 5 दिन

  1. एक वीडियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल आक्रमण का विश्लेषण ।
    1. चरण २.३ दोहराएँ ।

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Representative Results

हम यहां रिपोर्ट दो अलग तरीकों सेल आक्रमण और प्रवास का विश्लेषण करने के लिए । चित्रा 1 Boyden चैंबर प्रयोग से पता चलता है. आवेषण chemoattractant माध्यम के साथ एक साथी थाली में रखा जाता है, और कोशिकाओं सेमी में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । झिल्ली (प्रवास परख) अनकोट किया जा सकता है या लेपित (आक्रमण परख) । कोशिकाओं को एस सेमी में ऊपरी कक्ष में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । निचले चैंबर एक chemoattractant के रूप में मुख्यमंत्री से भरा है । दोहरीकरण समय से पहले कोशिकाओं तय कर रहे हैं ।

चित्रा 2 सेल निर्धारण के बाद Boyden झिल्ली से पता चलता है । आरेख 2a एक इष्टतम परिणाम दिखाता है, जिसमें झिल्ली के ऊपरी हिस्से पर सेल क्लस्टर होते हैं । चित्रा बी + कोशिकाओं निश्चित और झिल्ली पर नीले रंग में दाग के साथ एक इष्टतम परिणाम से पता चलता है ।

चित्रा 3 खरोंच घाव परख के एक इष्टतम परिणाम से पता चलता है । रैखिक घाव चित्रा 3ए में देखा जा सकता है । कोई कोशिकाओं को घाव में मनाया जाता है, और घाव भरने 30 घंटे के भीतर हुई है । घाव को चंगा करने के लिए समय के लिए सेल लाइन और पर्वतमाला पर निर्भर है 24 से ५० ज ।

चित्र 3 बी चार उपचार की स्थिति के तहत घाव भरने के एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व है: नियंत्रण, ABT-१९९ (विरोधी Bcl-2), सेटुक्सीमब (विरोधी EGFR), और ABT-199 + सेटुक्सीमब । ABT-199 + सेटुक्सीमब संयोजन काफी कम सेल माइग्रेशन । घटता वीडियो माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर है, जो समय के साथ सेल प्रवास के मजबूत डेटा विश्लेषण प्रदान करता है का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं । त्रुटि पट्टियां प्रत्येक कुआं के लिए मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं ।

९० प्रतिशत संगम घाव भरने की परख के लिए इष्टतम कोशिका घनत्व है. इष्टतम सेल सीडिंग सेल लाइन पर निर्भर करता है और 3 x 104 से 6 x 104 कोशिकाओं से पर्वतमाला । चित्रा 4a इष्टतम सेल घनत्व से पता चलता है, और चित्र 4c कम सेल घनत्व से पता चलता है । वेल्स को सेल क्लस्टर से बचने के लिए दो बार धोना चाहिए, जैसा कि चित्र 4Bमें दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: Boyden चैंबर प्रयोग के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । आवेषण chemoattractant माध्यम के साथ एक साथी थाली में रखा जाता है, और कोशिकाओं सेमी में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । झिल्ली (ए) या लेपित (बी) अनकोट किया जा सकता है ।

Figure 2
चित्रा 2: इष्टतम और इष्टतम सूक्ष्म परिणाम Boyden चैंबर प्रयोग में प्राप्त. (क) झिल्ली और unयाख् के परिणाम के ऊपरी हिस्से पर सेल समूहों के साथ इष्टतम झिल्ली । स्केल बार = ३०० µm. (ख) नीले रंग में दाग झिल्ली के निचले हिस्से में बेशुमार कोशिकाओं के साथ इष्टतम झिल्ली । स्केल बार = ३०० µm ।

Figure 3
चित्रा 3: इष्टतम परिणाम घाव भरने के प्रयोग में प्राप्त किया । (एक) खरोंच घाव परख से प्रतिनिधि छवि घाव चिकित्सा दिखाया 0, 15 पर मनाया, और 30 एच । एक गुणवत्ता प्रयोग के लिए मानदंड एक रैखिक घाव, कोई सेल टुकड़े घाव में मनाया जाता है, और इष्टतम सेल संगम । स्केल बार = ३०० µm. (B) घाव भरने की चित्रमय प्रतिनिधित्व घाव कोशिका संगम (प्रतिशत) के मापदंडों के समय के अनुसार (एच) दिखा ठहराव । चार उपचार की स्थिति यहां विश्लेषण कर रहे हैं, और डेटा एसडी के साथ दिखाया जाता है ।

Figure 4
चित्रा 4: घाव भरने के प्रयोग में प्राप्त की उपइष्टतम परिणाम । (क) आदर्श कोशिका घनत्व. (ख) सेल गोली धोने की समस्याओं । (ग) कोशिका घनत्व कम है । स्केल बार्स = ३०० µm

फायदे नुकसान
Boyden चैंबर प्रयोग -3d सेल Chemotaxis -समय लेने वाली
-लेपित और गैर लेपित परत मैट्रिक्स के साथ दोनों आक्रमण और प्रवास -कम reproducibility
-महंगा आवेषण
-कोई समय-चूक अन्वेषण
-अनुयाई कोशिकाओं की जरूरत
घाव हीलिंग परख -स्वचालित अत्यधिक प्रतिलिपि घाव -2d-सेल गतिशीलता
-लेपित और गैर लेपित परत मैट्रिक्स के साथ दोनों आक्रमण और प्रवास -अनुयाई कोशिकाओं की जरूरत
-सेल प्रसार विश्लेषण में शामिल
-समय चूक सूक्ष्म दृश्य विश्लेषण
-सटीक विश्लेषण के साथ घाव भरने मैट्रिक्स के डेटा निर्यात
-बाद उपचार सेल प्रवास और आक्रमण घटता के लिए मजबूत सॉफ्टवेयर

तालिका 1: Boyden चैंबर प्रयोग और वीडियो माइक्रोस्कोप घाव-हीलिंग परख के लाभ और नुकसान । फायदे और Boyden चैंबर प्रयोग और खरोंच घाव परख के नुकसान ।

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Discussion

सेल आक्रमण और माइग्रेशन प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए हम यहाँ दो विभिन्न मोडलों की रिपोर्ट करते हैं । इस प्रक्रिया का विश्लेषण मेटास्टेटिक पुनरावर्तन में शामिल कारकों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, जो कैंसर स्टेम सेल10,11नामक कर्क कोशिकाओं की एक उपजनसंख्या की वृद्धि हुई गतिशीलता द्वारा समझाया जा सकता है ।

Boyden चैंबर प्रयोग एक सबसे अक्सर इस्तेमाल किया तकनीक सेल आक्रमण और प्रवास का पता लगाने के लिए है । इस पद्धति का एक लाभ यह है reproducibility, हालांकि इस तकनीक है प्रयोगकर्ता विशेषज्ञता पर अत्यधिक निर्भर है । सेल गिनती मैनुअल है और प्रयोगकर्ता के बीच भिन्न हो सकते हैं. कई महत्वपूर्ण कदम मानकीकृत और देखभाल के साथ पालन किया जाना चाहिए, इस तरह के उपयुक्त chemoattractant और भुखमरी के उपयोग को सुनिश्चित करने के रूप में प्रत्येक सेल लाइन के लिए विशिष्ट मध्यम । एक कपास झाड़ू के साथ ऊपरी झिल्ली से कोशिकाओं को हटाने इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने और चित्रा 2aमें दिखाए गए उपइष्टतम परिणामों से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण है । यदि यह परख एक त्रि-आयामी (3 डी) के माध्यम से सेल गतिशीलता, आक्रमण, और प्रवास क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, यह एक समय चूक प्रयोग के माध्यम से कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए संभव नहीं है । इसके अलावा, एक असुरक्षित झिल्ली के साथ वाणिज्यिक आवेषण अक्सर महंगे हैं ।

वीडियो माइक्रोस्कोप आधारित खरोंच घाव परख यहां प्रस्तुत एक मजबूत तकनीक के लिए सेल प्रवास और आक्रमण का मूल्यांकन है । परख एक यांत्रिक घाव निर्माता के साथ किया जाता है और उपचार की स्थिति के बीच एक प्रतिलिपि तुलना प्रदान करता है । वीडियो सूक्ष्म विश्लेषण एक समय चूक प्रयोग के माध्यम से घाव भरने और कोशिका संगम के लिए सटीक मात्रात्मक डेटा उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विभिन्न उपचार स्थितियों के समय-समय पर विश्लेषण सूक्ष्म प्रेक्षणों द्वारा पुष्टि जा सकता है । इस विश्लेषण परख के दौरान सेल प्रसार को एकीकृत करता है और खाते में सेल दोहरीकरण समय लेता है । वीडियो या raw डेटा सामग्री को परिणामों का एक अत्यधिक विज़ुअल प्रस्तुतिकरण प्राप्त करने के लिए निर्यात किया जा सकता है, जैसा कि चित्र बीमें कक्ष माइग्रेशन वक्र में दिखाया गया है ।

कई महत्वपूर्ण कदम व्याख्यात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । सेल सीडिंग के लिए इष्टतम शर्तों सेल लाइन पर निर्भर हैं और कुओं में ९०% सेल संगम प्राप्त करने के लिए विभिन्न कमजोर पड़ने के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए. एक रैखिक घाव प्राप्त करने के लिए, सेल चढ़ाना 16 एच से अधिक नहीं होना चाहिए । धुलाई कदम दो बार किया जाना चाहिए और तेजी से घाव है कि परिणामों को बदल सकता है में सेल मलबे शुरू करने से बचने के लिए । आक्रमण खरोंच घाव के लिए, ECM की उचित देखभाल भी एक महत्वपूर्ण कदम है । ठंडा दरों स्थिर होना चाहिए, और ECM ठंडा पिपेट सुझावों के साथ हेरफेर किया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा ।

इन तकनीकों में कई लाभ हैं, जो 1 तालिका में संक्षेप हैं । इस तकनीक के लिए अनुयाई कोशिकाओं की जरूरत होती है । scratching कोशिकाओं को यांत्रिक चोट का कारण बनता है, जो आसपास के माध्यम में सेलुलर सामग्री की रिहाई का कारण बनता है और माइग्रेशन प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं । खरोंच घाव परख इस तकनीक का उपयोग नहीं किया जा सकता है, जो सेल chemotaxis की नहीं बल्कि 2d सेल गतिशीलता का अनुमान प्रदान करता है । हम हाल ही में एक वीडियो सूक्ष्म chemotaxis एक वाणिज्यिक चढ़ाना प्रणाली का उपयोग परख विकसित की है । इस परख एक उच्च प्रवास की क्षमता के साथ कोशिकाओं की जरूरत है, जैसे कैंसर स्टेम सेल, के रूप में पहले12वर्णित है । इस नई तकनीक से भविष्य में आक्रमण-प्रवास की परख के लिए सोने के मानक बन सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इन तकनीकों को LabEx प्राइमर्स (ANR-11-LABX-००६३), Contrat प्लान-Etat-रीजन (CPER) के वैज्ञानिक ढांचे के भीतर ETOILE (CPER 2009-2013), और गीतकार ग्रांट इंका-DGOS-४६६४ के सहयोग से विकसित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Calf Serum Gold GE Healthcare A15-151
Hydrocortisone water soluble Sigma-Aldrich H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X Dominique Dutscher L0022-100
DMEM Gibco 61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I Gibco 31765-027
EGF Promega G5021 The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Z1 coulter particle Beckman Coulter 6605698
Optical microscope Olympus  CKX31
SQ20B cell line Gift from the John Little’s Laboratory -
Wound Maker Essen Bioscience 4494 Store in safe and dry place
96-well ImageLock Plate Essen Bioscience 4379
CoolBox 96F System with CoolSink 96F Essen Bioscience 1500-0078-A00
CoolBox with M30 System Essen Bioscience 1500-0078-A00
Boyden Insert Dominique Dutcher 353097
Boyden Coated Insert Dominique Dutcher 354483 Store at -20 °C
Companion 24-well Plate Dominique Dutcher 353504
BD Matrigel standard BD BioScience BD 354234 Store at -20°C. 
RAL 555 Staining Kit RAL Diagnostics  361550 Store in safe and dry place
Microcentrifuge tubes Eppendorf 33511

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References

  1. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  2. Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
  3. Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
  4. Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
  5. Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
  6. Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
  7. Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
  8. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
  9. Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
  10. Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
  11. Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
  12. Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).

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कैंसर अनुसंधान अंक १२९ Boyden चैंबर खरोंच घाव आक्रमण/प्रवास सेल गतिशीलता वीडियो-माइक्रोस्कोपी सेल chemotaxis
सेल आक्रमण और प्रवासन प्रक्रिया का मूल्यांकन: वीडियो माइक्रोस्कोप की तुलना-खरोंच घाव परख और Boyden चैंबर परख आधारित
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Guy, J. B., Espenel, S., Vallard,… More

Guy, J. B., Espenel, S., Vallard, A., Battiston-Montagne, P., Wozny, A. S., Ardail, D., Alphonse, G., Rancoule, C., Rodriguez-Lafrasse, C., Magne, N. Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay. J. Vis. Exp. (129), e56337, doi:10.3791/56337 (2017).

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