Summary
Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.
Abstract
Tümör hücreleri istila ve geçiş yeteneklerini kanser ilerlemesi ve yineleme için ana katkı kaynağı sağlamaktadır. Birçok çalışma nasıl kanser hücrelerinin yaymak yeni tedavi stratejileri geliştirmek amacı ile anlamak için geçiş ve işgal yeteneklerini incelemiş bulunuyoruz. Bu yeteneklerin hücresel ve moleküler temeli analizi hücre hareketlilik karakterizasyonu ve fizikokimyasal özellikleri sitoiskeleti ve hücresel microenvironment yol açmıştır. Uzun yıllar boyunca, Boyden odası tahlil ve sıfırdan yara tahlil cep işgali ve geçiş eğitim için standart teknikleri olmuştur. Ancak, bu iki teknik kısıtlamalar bulunmaktadır. Boyden odası tahlil zor ve zaman alıcı ve düşük tekrarlanabilirlik sıfırdan yara tahlil vardır. Mikroskobu, özellikle de modern teknolojilerin geliştirilmesini sıfırdan yara tahlil tekrarlanabilirlik artmıştır. Güçlü analiz sistemleri kullanarak, bir "içinde-kuluçka" video mikroskobu hücre göç ve işgal otomatik ve gerçek zamanlı analiz sağlamak için kullanılabilir. Amacı bu kağıt, rapor ve hücre işgali ve geçiş eğitim için kullanılan iki deneyleri karşılaştırın etmektir: Boyden odası tahlil ve bir en iyi duruma getirilmiş vitro video mikroskop esaslı çizik tahlil yara.
Introduction
Cep işgali ve geçiş direnci tedavi1 ana nedeni kanser hücrelerinin, yayılması yer alırlar ve lokal veya metastatik yineleme sonra kanser tedavi2yol açabilir. Mezenkimal epitel geçiş (EMT) hücre Invasion-geçiş hangi kanser hücreleri bir epitel Mezenkimal bir fenotip geçiş ilk işlemidir. E-Cadherin epitel fenotip3hücre dışı bir işaretleyicidir ve artan N-cadherin ve vimentin Mezenkimal fenotip4karakteristik ifadesidir. Geçiş de matris metalloproteases5eylem yoluyla iç kapasite kanser hücrelerinin temel hücre dışı Matriks (ECM) işgal bağlıdır.
Bu istila-geçiş mekanizması kanser birçok yerlerde, özellikle baş ve boyun kanser6' için tanımlanmıştır. Pek çok araştırmacı nasıl bu bilgi için yeni tedavi stratejileri götürecek umuduyla kanser hücrelerinin yaymak daha iyi anlamak için göç ve işgal işlemleri üzerinde odaklanmıştır. Bu çalışmalar güvenilir ve tekrarlanabilir deneyleri kullanarak gerçekleştirilen çok önemlidir.
Hücre hareketliliği vitro analizine zor olabilir. Uzun yıllar önce geliştirilen, Boyden odası tahlil Invasion-geçiş analiz7için standart olarak kabul edilir. Ancak, zaman alıcı ve sık sık yanlıştır. İkinci bir test bir hücre monolayer kültürü üzerinde bir çizik bile yapma ve esir alma imge cep işgali ve göç sabit zaman aralıklarında içerir yara iyileşmesi tahlil8' dir. Bu teknik yaygın olarak iki ardışık test sonuçları arasında büyük farklılıklar nedeniyle eleştirildi. Ancak, mikroskopi, özellikle de modern teknolojilerin uygulama sıfırdan yara tahlil tekrarlanabilirlik geliştirdi. Video mikroskoplar kolayca İnkübatörler içinde tanıttı olabilir ve hücre göç gerçek zamanlı görüntü oluşturabilirsiniz. Bu cihazlar mikroskobik verileri kaydetmek ve zaman içinde yara hücre izdiham otomatik olarak analiz sağlar. Bu kağıt Boyden odası tahlil ve en iyi duruma getirilmiş sıfırdan yara tahlil tarif ve avantajları ve her yaklaşımın zayıf yönlerini tartışmak için amaçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: ECM dahil olmadan Boyden odası ve çizik deneyleri için geçiş tahlil olarak adlandırılır ve ECM ile aynı deneyleri işgali tahlil olarak adlandırılır.
1. Boyden odası tahlil
Not: Bu protokolü tekrarlayan bir baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) gırtlak kanseri türetilir ve John elde edildi SQ20B hücre satırı için adapte Little (Boston, MA, USA).
Gün 1
-
Tohum hücre
- Tohum 2 106 SQ20B 175 cm2 şişeye bir gün önce 72 h 12 mL kültür orta (CM) hücreleri ve hücrelerin % 80 hücre izdiham için büyümeye izin.
- CM SQ20B hücreler için hazırlamak için Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) % 10 fetal buzağı serum (FCS), 0,04 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin ile ek.
- Laminar akış başlık altında hücreleri trypsinize. Orta kaldırmak, steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hücrelerle yıkama ve tripsin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (0,5 g/L) 2.5 mL ekleyin. 37 ° C'de 5 min için hücreleri kuluçkaya ve reaksiyon 37 ° C'ye ısındı cm 12.5 mL ekleyerek durdurun Bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
- 25 cm2 şişesi 6 105 hücre değerlendirilecek her koşul için bir hücre yoğunluğu, hücrelerde tohum. 24 h cm 3 ml için hücreleri kuluçkaya.
- Tohum 2 106 SQ20B 175 cm2 şişeye bir gün önce 72 h 12 mL kültür orta (CM) hücreleri ve hücrelerin % 80 hücre izdiham için büyümeye izin.
2. gün
-
Hücre açlık ve kaplı odaları hazırlanması
- Hücreleri her şişeyi ortamda ile 3 mL %0,1 sığır serum albumin (BSA) kullanarak düşük fetal sığır serum (FBS) orta yerine FBS değiştirerek açlıktan. Kuluçka 24 h için hücreleri açlıktan.
- Açlık CM (s-CM) hazırlamak için DMEM % 0.1 BSA, 0,04 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin ek.
- Geçiş tahlil için 1.3 adıma geçin.
- İstila tahlil, günde 3, önce 12 h için kaplamalı her odasına s-cm 500 μL ekleyerek kaplı Boyden odaları hazır olun. Ticari olarak hazırlanan kuşe Boyden Chambers'ı kullanın ve onları kullanmadan önce 4 ° C'de tutun. Her Boyden Oda arkadaşı tabağına yerleştirin ve 37 ° C'de kuluçka gecede ayarlayın.
- Hücreleri her şişeyi ortamda ile 3 mL %0,1 sığır serum albumin (BSA) kullanarak düşük fetal sığır serum (FBS) orta yerine FBS değiştirerek açlıktan. Kuluçka 24 h için hücreleri açlıktan.
3. gün
-
Boyden odasında tohum hücre
- Eşlik eden plaka chemoattractant hazırlamak için kullanın. Her doldurmak tam orta %10 FBS, 0,04 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin 750 μL 24-iyi arkadaşı plakalı, iyi.
- Chemoattractant her hücre satır ve her tedavi koşul için uyum. Chemoattractant CM (ca-CM) hazırlamak için DMEM % 10 FCS, 0.4 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin ek.
- Üst odası kabarcıklar önlemek için dikkat çekici doldurulmuş arkadaşı kalenin aktarın.
- İstila tahlil için dikkatli bir şekilde her Boyden odasından cm 450 μL çıkarın.
- Laminar akış başlık altında hücreleri trypsinize. Orta kaldırmak, steril PBS hücrelerle yıkama tripsin EDTA (0.5 g/L) 0.5 mL ekleyin ve sonra hücreleri 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya 37 ° C'ye ısındı CM ekleyerek reaksiyonu durdurmak Bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
- Tohum 3 104 SQ20B % 0.1 BSA orta, 6 104 hücre/mL nihai bir seyreltme veren 500 μL hücrelerde.
Not: Hücre konsantrasyonu her hücre satırı için adapte edilmelidir. - Plaka 37 ° C'de kuluçka makinesi 24 h için yerleştirin.
- Eşlik eden plaka chemoattractant hazırlamak için kullanın. Her doldurmak tam orta %10 FBS, 0,04 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin 750 μL 24-iyi arkadaşı plakalı, iyi.
4. gün
-
Hücre fiksasyon ve boyama
- Önce katlama zaman o hücre satırıyla belirli hücreleri tamir. 24 saat önce SQ20B hücreleri tamir.
- Her ekleme arkadaşı plaka çıkarın ve hücreleri bir pamuklu çubukla kullanarak üst odasından dikkatli bir şekilde çıkarın. Üst bölmede bulunan tüm hücreleri kaldırmak özellikle önemlidir.
- Düzeltme ve leke Mayıs-Grunwald Giemsa renklendirme9 sağlanan boyama seti kullanarak elde etmek için tek tek ekleyin. Alternatif olarak, % 4 paraformaldehyde 30 dk fiksasyon için başka bir arkadaşı tabak içinde kullanın.
- Ekler bir boş 24-iyi arkadaşı plaka her odası kuruması için bir laboratuvar başlık altında tutun.
Gün 5
-
Mikroskopik analiz
- Eşlik eden plaka ekler 20 faz kontrast mikroskop üzerine yerleştirin ve geçirilen her hücre zarının alt kısmında say. Amaç aşağıdan yukarı hareket ettirerek doğru odak konumunu en iyi duruma getirme ve pozisyon membran alt kısmı durdurun.
- Geçirilen hücrelerin sayıları ve numaralı seribaşı hücreleri arasındaki oran hesaplamak. Her sayısı nüsha her tedavi koşul için yineleyin.
2. çizik tahlil yara: Hücre göç
Not: Talimatları hücre türüne göre adapte olmalıdır.
Gün 1
-
Tohum hücre
- Tohum 2 x 106 SQ20B 175 cm2 şişeye bir gün önce 72 h cm 12 ml hücreleri ve hücrelerin % 80 hücre izdiham için büyümeye izin.
- Laminar akış başlık altında hücreleri trypsinize. Orta kaldırmak, steril PBS hücrelerle yıkama tripsin EDTA (0.5 g/L) 2.5 mL ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için hücreleri kuluçkaya 37 ° C'ye ısındı cm 12.5 mL ekleyerek reaksiyonu durdurmak Bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
- Prediluted bir örneği 4 x 105/mL, hücre yoğunluğu ' 4 104 hücre başına 100 μL her şey son bir yoğunluk vererek oluşturmak. Bu konsantrasyon her hücre satırı için adapte olmalı ve 1 x 104 6 104 hücre aralığında olmalıdır.
- 2.1.2. adımda hazırlanan solüsyona yatırma 100 μL tarafından bir 96-şey plaka her kuyuya tohum hücreleri.
- Hücreler eşit olarak kuyu dibinde dağıtmak 5 min için oda sıcaklığında plaka bırakın.
- Plaka da kuluçka yerleştirin ve 12-16 (en fazla) h 37 ° C'de plaka uygun hücrelere sağlar
2. gün
-
Yara tahlil kaşı
- Adım 2.1 kuluçka makinesi'hazırlanan tabak çıkarın.
- Başlık altında üreticinin protokolüne göre ticari yaralama aygıtı kullanarak bir yara olun.
- Hemen orta her şey bir pipet yara dokunmamaya dikkat çekici bir adapte konik ucuyla kullanarak kaldırın.
- Hücreleri aspirasyon yinelenen ve her şey için 37 ° c sıcak cm 100 μL kullanarak tarafından iki kez yıkayın.
- Bir pipet adapte bir konik ucuyla sonra çamaşır adımları kullanarak CM kaldırın.
- Orta her tedavi koşul için belirli 100 μL her şey için ekleyin.
- Wells için yapılan herhangi bir kabarcık oluşturma önlemek için deneyin. Bir ters pipetting teknik burada yararlı olabilir. Alternatif olarak, bir şırınga iğnesi kabarcıklar kaldırın.
- Plaka video mikroskobu adapte raf yerleştirin.
- Görüntü kalitesini artırmak için en az 15 dk önce plaka alt tarafındaki yoğunlaşmayı önlemek için ilk inceden inceye gözden geçirmek için sıcak plaka izin.
- Zamanlamayı iyi başına bir görüntü, video mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak tarama programı. En çok 2-h Aralık işgali-geçiş deney için gereklidir. Denemenin amacı bir video üretmek için ise 30 dk maksimum aralığını tercih edilir.
- Deney sonunda, yaralama aygıt dikkatle yıkama ve her üretici tarafından belirtilen dört çamaşır adımları izleyin.
Gün 3, 4 ve 5
-
Video mikroskop kullanarak geçiş analizi
- En az 24 h ve 5 gün, izlemek ve hücre göç denetleyin.
- Her hücre türü için uyarlanmış bir uygun cep maskesi hücre göç çözümlemek için kullanın. Her hücre satırı için uyarlanmış bir cep maskesi elde etmek için bir hücre belirli hücre resim koleksiyonu kullanarak yazılım tanımından işleme oluşturmak.
- Eğrileri izleme ve veri analiz ve sonuçları karşılaştırmak için kullanılan bir elektronik tabloya ver.
3. çizik tahlil yara: Hücre Invasion
Not: Talimatları hücre türüne göre adapte olmalıdır.
Gün 1
-
Tohum hücre
- 2.1. adımda açıklandığı gibi hücre tohum için aynı iletişim kuralını kullanın.
2. gün
-
ECM hazırlanıyor
- Matris için en az 12 h 4 ° C'de kullanmadan önce defrost Hiçbir toplamları görünür olduğundan emin olun. Toplamları görünür durumdaysa, matrix 4 ° C'de kadar agrega ortadan daha uzun süre tutmak. Matris buz üzerinde tutun. Precooled pipet ipuçlarını kullanın.
Not: Matrix kuvvetlendirmek değil Eğer 4 ° C'de muhafaza - 5 min için buz üzerine microcentrifuge boruları chill.
- CM 4 ° C-buzdolabından soğutmalı ve 300 μg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için precooled microcentrifuge tüpler matrisinde oranında seyreltin.
- Buzdolabı 4 ° C'de prediluted matris microcentrifuge tüplerini dönmek
Not: microcentrifuge tüpler için uyarlanmış bir soğutma rafa deneme boyunca 4 ° C'de tüpler korumak için yardımcı olur.
- Matris için en az 12 h 4 ° C'de kullanmadan önce defrost Hiçbir toplamları görünür olduğundan emin olun. Toplamları görünür durumdaysa, matrix 4 ° C'de kadar agrega ortadan daha uzun süre tutmak. Matris buz üzerinde tutun. Precooled pipet ipuçlarını kullanın.
2. gün
-
Yara tahlil ve ECM tedavisinde kazı kazan
- Adım 3.1 kuluçka makinesi'hazırlanan tabak çıkarın.
- Başlık altında üreticinin protokolüne göre ticari yaralama aygıtı kullanarak yara olun.
- Hemen orta her şey bir pipet yara dokunmamaya dikkat çekici bir adapte konik ucuyla kullanarak kaldırın.
- Hücreleri aspirasyon yordamı yinelenen ve 37 ° C'ye ısındı cm 100 μL kullanarak tarafından iki kez yıkamak
- İkinci yıkama sonra plaka 5 min için sıcaklık equilibrate için 4 ° C kuluçka makinesi yerleştirin.
- Her şey dikkatle kenarından pipet ve yara dokunmaktan kaçının için dikkat çekici bir konik uç ile aspirasyon pipet ile soğuk orta kaldırın.
- 4 ° C'de precooled konik ipuçlarını kullanarak her şey 50 μL prediluted matris ekleyin
- 37 ° C'de kuluçka 30 dk için plaka yerleştirin.
Not: Bir prewarmed destek raf 37 ° C'de ve 96-şey levha ısınma hızlandırmak yararlıdır. - Plaka da kuluçka kaldırın ve her tedavi koşul için belirtildiği gibi her şey için adapte cm 100 μL ekleyin.
- Wells için yapılan herhangi bir kabarcık oluşturma önlemek için deneyin. Bir ters pipetting teknik burada yararlı olabilir. Alternatif olarak, bir şırınga iğnesi kabarcıklar kaldırın.
- Plaka video mikroskobu adapte rafa yerleştirin.
- Görüntü kalitesini artırmak için en az 15 dk önce plaka alt tarafındaki yoğunlaşmayı önlemek için ilk inceden inceye gözden geçirmek için sıcak plaka izin.
- Taramalar, kuyuda sıfırdan yara tarama modunu başına bir görüntü, video mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak zamanlama programı. En çok 2-h Aralık içinde bir istila-geçiş deney için gerekli. Denemenin amacı bir video üretmek için ise 30 dk maksimum aralığını tercih edilir.
- Deney sonunda, yaralama aygıt dikkatle yıkama ve her üretici tarafından belirtilen dört çamaşır adımları izleyin.
Gün 3, 4 ve 5
-
Video bir mikroskop kullanarak cep işgali analizi.
- 2.3 arasındaki adımları yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz burada hücre işgali ve geçiş analiz etmek için iki farklı yöntem raporu. Şekil 1 Boyden odası deneyi gösterir. Ekler chemoattractant orta ile bir arkadaşı tabak içine yerleştirilir ve hücreleri CM tohumlari. Membran kaplamasız olabilir (geçiş tahlil) veya (Invasion tahlil) kaplı. Hücre s-cm üst odasına numaralı seribaşı. Alt odası CM ile bir chemoattractant girilir. Hücreleri önce katlama zaman sabittir.
Şekil 2 Boyden membran hücre fiksasyon sonra gösterir. Şekil 2A ile hücre kümeleri membran üst tarafında bir suboptimal sonuçlar görülüyor. Şekil 2B bir en iyi sonuç ile sabit ve membran üzerinde mavi lekeli hücreleri gösterir.
Şekil 3 en iyi bir karalama yara tahlil sonucu gösterir. Doğrusal yara şekil 3Aiçinde görülebilir. Hiçbir hücre yarada gözlenir ve yara iyileşmesi içinde 30 h oluştu. Yara iyileşmesi zaman hücre kültürünü ve 50 h 24 arasında değişmektedir bağlıdır.
Şekil 3B olduğunu altında dört tedavi koşulları şifa yara grafik gösterimi: kontrolü, ABT-199 (anti-Bcl-2), cetuximab (anti-EGFR) ve ABT-199 + cetuximab. ABT-199 + cetuximab birlikte önemli ölçüde azalma hücre göç. Eğrileri hücre geçiş süresi ile sağlam veri çözümlemesi sağlayan video mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak elde edilir. Hata çubukları her şey için standart sapma (SD) temsil eder.
% 90'ı yara iyileşmesi tahlil için optimum hücre yoğunluğu görkemlidir. Optimum hücre tohum cep telefonda bağlıdır ve 3 x 104 ' ten 6 x 104 hücrelere arasında değişmektedir. Şekil 4A optimum hücre yoğunluğu gösterir ve şekil 4 c düşük hücre yoğunluğu gösterir. Wells şekil 4B' gösterildiği gibi iki kez hücre kümeleri, önlemek için yıkanmalıdır.
Şekil 1: Boyden odası deneyi şematik gösterimi. Ekler chemoattractant orta ile bir arkadaşı tabak içine yerleştirilir ve hücreleri CM tohumlari. Membran kaplamasız (A) veya kaplanmış (B) olabilir.
Şekil 2: Suboptimal ve en uygun mikroskobik sonuçlar elde Boyden odası deneyde. (A)Suboptimal membran ile hücre kümeleri membran ve uninterpretable sonuçlar üst tarafında. Ölçek çubuğu 300 µm. (B) en uygun membran ile alt kısmında mavi lekeli membran sayılabilir hücrelerde =. Ölçek çubuğu 300 µm =.
Şekil 3: en iyi sonuçları elde yara iyileşmesi deneyde. (A)0, 15 ve 30 h yara iyileşmesi gösterilen sıfırdan yara tahlil temsilcisi görüntüden. Kalite deneme için doğrusal bir yara, yara ve optimum hücre izdiham hücre parçaları yok gözlenen ölçütlerdir. Ölçek çubuğu = miktar yara hücre izdiham (yüzde) saat (h) göre parametrelerin gösterilen yara iyileşme 300 µm. (B) grafik olarak gösterilmesi. Dört tedavi koşulları burada analiz edilir ve veri SD ile gösterilir
Şekil 4: Suboptimal sonuçlar elde yara iyileşmesi deneyde. (A)Ideal hücre yoğunluğu. (B) sorunları hücre Pelet yıkama. (C) düşük hücre yoğunluğu. Ölçek çubukları 300 µm =
| Avantajları | Dezavantajları | |
| Boyden odası deneyi | -3D-hücre Kemotaksis | -Zaman alıcı |
| -Hem işgali ve geçiş ile kaplanmış ve sigara kaplı katman matris | -Düşük tekrarlanabilirlik | |
| -Pahalı ekler | ||
| -Hiçbir zaman hata arama | ||
| -Yapışık hücreleri ihtiyaç | ||
| Tahlil iyileşmesi | -Otomatik son derece tekrarlanabilir yara | -2D-hücre hareketliliği |
| -Hem işgali ve geçiş ile kaplanmış ve sigara kaplı katman matris | -Yapışık hücreleri ihtiyaç | |
| -Analize dahil Hücre proliferasyonu | ||
| -Hızlandırılmış mikroskobik görsel analiz | ||
| -Veri ihracat yara iyileşme ölçümler hassas analizi ile | ||
| -Tedavi sonrası turp gibi bilgisayar yazılımı için hücre göç ve işgal eğrileri |
Tablo 1: avantajları ve dezavantajları Boyden odası deneyi ve video mikroskobu yara iyileşmesi tahlil. Avantajları ve dezavantajları, Boyden odasının deneme ve çizik tahlil yara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada iki farklı yöntemler cep işgali ve geçiş işlemi çalışma raporu Bu süreç analizi bir subpopulation kanser kök hücreleri10,11adı verilen kanser hücrelerinin artan hareketliliği tarafından açıkladı metastatik yineleme katılan faktörler anlamak için önemlidir.
Boyden odası deneyi biridir en sık kullanılan teknikler keşfetmek için hücre işgali ve geçiş. Bu yaklaşımın bir avantajı, tekrarlanabilirlik olsa da bu teknik son derece deneyci'nın uzmanlık bağlıdır. Hücre sayımı ve manuel Denemecileri arasında değişebilir. Birçok kritik adım standart ve her hücre kültürünü belirli uygun chemoattractant ve açlık orta kullanımını sağlamak gibi özenle takip gerekir. Bir pamuk bez ile üst zar hücreleri kaldırma aynı zamanda en iyi sonuçlar sağlanması ve şekil 2Asuboptimal sonuçlar kaçınmak için önemlidir. Bu tahlil hücre hareketliliği, işgal ve üç boyutlu (3D) geçirgen membran aracılığıyla geçiş kapasiteleri değerlendirmek için kullanılırsa, hızlandırılmış bir deney ile hücreleri izlemek mümkün değildir. Ayrıca, ticari ekler gözenekli bir membran ile genellikle pahalıdır.
Burada sunulan mikroskop tabanlı video sıfırdan yara tahlil hücre göç ve işgal değerlendirmek için güçlü bir tekniktir. Tahlil bir mekanik yara maker ile gerçekleştirilir ve tedavi koşulları arasında tekrarlanabilir bir karşılaştırma sağlar. Video mikroskopik analiz yara şifa ve hücre izdiham hızlandırılmış bir deneyi için kesin nicel verileri oluşturmak için kullanılabilir. Zaman zaman analizi farklı tedavi koşulları tarafından mikroskobik gözlemler doğruladı. Bu analiz tahlil sırasında hücre çoğalması entegre ve hücre iki katına zaman dikkate alır. Video veya ham veri içerik sonuçlar, son derece görsel bir gösterimini elde etmek için hücre geçiş eğrileri şekil 3Biçinde gösterildiği gibi dışa aktarılabilir.
Birçok kritik adım yorumlanabilir sonuçları elde etmek için gereklidir. Tohum hücre için en uygun koşulları cep telefonda bağımlıdır ve % 90 hücre izdiham Wells elde etmek için farklı dilutions ile test edilmelidir. Doğrusal bir yara elde etmek için hücre kaplama 16 h aşmamalıdır. Çamaşır adım iki kez ve hızla yapılması gereken hücre artıkları sonuçları değiştirmek yara içine tanıtımı önlemek için. İstila sıfırdan yara için de önemli bir adım ECM çok uygun oldu. Soğutma oranları sabit olmalıdır ve ECM soğutulmuş pipet ipuçları ile manipüle ve 4 ° C'de muhafaza
Bu teknikler tablo 1'de özetlenmiştir pek çok avantajı var. Yapışık hücreleri bu teknik için ihtiyaç vardır. Nedenleri mekanik yaralanma hücrelere tırmalamak, hangi hücresel içeriği yayımlanmasından çevreleyen ortamın neden olur ve geçiş sürecini etkileyebilir. Kazı-kazan yara tahlil 2D hücre hareketliliği ama değil bu tekniği kullanarak okudu değil hücre kemotaksisi bir tahmin sağlar. Son zamanlarda bir ticari kaplama sistemi kullanarak bir video mikroskobik kemotaksisi tahlil geliştirdik. Bu tahlil hücreleri kanser kök hücreleri gibi bir yüksek geçiş yeteneği ile12daha önce açıklandığı gibi ihtiyacı var. Bu yeni teknik Invasion-geçiş deneyleri için altın standart gelecekte olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu teknikler LabEx ASAL (ANR-11-LABX-0063), ETOILE (CPER 2009-2013) ve lirik Grant İnka-DGOS-4664 bilimsel çerçevesinde Kervansaray'a planı-Etat-bölge (CPER) desteği ile geliştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
