Summary
Este estudo relata dois métodos diferentes para a análise de migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e em vitro vídeo baseado em microscópio cicatrização ensaio. São descritos os protocolos para estes dois experimentos, e suas vantagens e desvantagens são comparadas.
Abstract
A capacidade de invasão e migração de células tumorais é principais contribuintes para a progressão do câncer e recorrência. Muitos estudos têm explorado as capacidades de migração e invasão de entender como as células cancerosas se disseminar, com o objectivo de desenvolver novas estratégias de tratamento. Análise das bases celulares e moleculares destas habilidades levou para a caracterização da mobilidade celular e as propriedades físico-químicas do citoesqueleto e microambiente celular. Por muitos anos, o ensaio de câmara Boyden e o risco de ferimento ensaio foram as técnicas padrão para estudar a migração e invasão celular. No entanto, estas duas técnicas têm limitações. O ensaio de câmara Boyden é difícil e demorado, e o ensaio da ferida zero tem baixa reprodutibilidade. Desenvolvimento de tecnologias modernas, especialmente em microscopia, aumentou a reprodutibilidade do ensaio do risco de ferimento. Utilizando sistemas de análise poderosas, um microscópio de vídeo de "no-incubadora" pode ser usado para fornecer análise automática e em tempo real de migração celular e invasão. O objetivo deste trabalho é relatar e comparar os dois ensaios utilizados para estudar a migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e um otimizado em vitro vídeo microscópio com base em zero do ensaio de ferida.
Introduction
Migração e invasão celular estão envolvidas na disseminação das células cancerosas, que é a causa principal da resistência ao tratamento1 e podem levar a locorregional ou metastática recorrência após tratamento de câncer2. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é o processo inicial de invasão-migração celular no qual câncer células alternar de um epitélio para um fenótipo mesenquimal. E-caderina é um marcador extracelular do fenótipo epiteliais3e expressão aumentada de N-caderina e vimentina é característica do fenótipo mesenquimais4. Migração também depende da capacidade intrínseca das células cancerosas invadir a matriz extracelular (ECM) através da ação das metaloproteases de matriz5.
Esse mecanismo de invasão – migração tem sido descrito por câncer em muitos locais, particularmente no câncer de cabeça e pescoço6. Muitos pesquisadores têm incidido sobre os processos de migração e invasão de entender melhor como as células cancerosas se disseminar na esperança de que esse conhecimento vai levar a novas estratégias de tratamento. É fundamental que estes estudos são realizados utilizando ensaios confiáveis e reproduzíveis.
Análise in vitro da motilidade celular pode ser um desafio. O ensaio de câmara Boyden desenvolveu há muitos anos, é considerado para ser o padrão para análise de invasão – migração7. No entanto, é demorado e muitas vezes é impreciso. Um segundo teste é a cicatrização da ferida ensaio8, que envolve fazer um arranhão em uma cultura celular de monocamadas e captura de imagens da invasão celular e migração em intervalos de tempo fixo. Esta técnica tem sido criticada extensamente por causa das grandes variações entre os resultados de dois testes sucessivos. No entanto, a aplicação de tecnologias modernas, especialmente em microscopia, melhorou a reprodutibilidade do ensaio do risco de ferimento. Microscópios de vídeo podem ser facilmente introduzidos em incubadoras e podem gerar imagens em tempo real de migração celular. Estes dispositivos gravar dados microscópicos e fornecem análise automática de confluência de célula ferida ao longo do tempo. O objetivo deste trabalho é descrever o ensaio de câmara Boyden e o ensaio da ferida zero otimizada e discutir as vantagens e fraquezas de cada abordagem.
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Protocol
Nota: Os ensaios de câmara e zero de Boyden sem inclusão de ECM são referidos como o ensaio de migração, e os ensaios mesmos com o ECM é referido como o ensaio de invasão.
1. Boyden câmara de ensaio
Nota: Este protocolo é adaptado para a linha de celular SQ20B, que é derivada de um câncer de laringe recorrente de cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas (HNSCC) e foi obtida por John Little (Boston, MA, USA).
Dia 1
-
Célula de semeadura
- Semente 10 26 SQ20B células em 12 mL de meio de cultura (CM) em um balão de2 175 cm 72 h antes de um dia e permitem que as células a crescer a confluência de célula de 80%.
- Para preparar CM para as células SQ20B, suplemento meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bezerro (FCS), hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
- Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com solução salina tampão fosfato (PBS) e adicionar 2,5 mL de ácido de tripsina ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,5 g/L). Incube as celulas por 5 min a 37 ° C e em seguida, pare a reação adicionando 12,5 mL de CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.
- As sementes das células em balão de2 25 cm, com uma densidade de células de 10 6 células de5 para cada condição a ser avaliada. Incube as celulas por 24h em 3 mL de CM.
- Semente 10 26 SQ20B células em 12 mL de meio de cultura (CM) em um balão de2 175 cm 72 h antes de um dia e permitem que as células a crescer a confluência de célula de 80%.
Dia 2
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Fome de célula e preparação das câmaras revestidas
- Morrer de fome as células, substituindo o meio em cada frasco com 3 mL de meio de soro bovino fetal-baixo (FBS) usando 0.1% albumina de soro bovino (BSA) em vez de FBS. Morrer de fome as células por 24 h na incubadora.
- Para preparar a fome CM (s-CM), suplemento DMEM com 0,1% BSA, hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
- Para o ensaio de migração, vá para a etapa 1.3.
- Para o ensaio de invasão, 12h antes do dia 3, prepare as câmaras revestidas de Boyden adicionando 500 μL de s-CM para cada câmara revestida. Usar comercialmente preparadas câmaras revestidas de Boyden e mantê-los em 4 ° C antes do uso. Coloque cada câmara Boyden na placa companheiro e defini-la em incubação a 37 ° C durante a noite.
- Morrer de fome as células, substituindo o meio em cada frasco com 3 mL de meio de soro bovino fetal-baixo (FBS) usando 0.1% albumina de soro bovino (BSA) em vez de FBS. Morrer de fome as células por 24 h na incubadora.
Dia 3
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Célula semear na câmara Boyden
- Utilize a placa de companheiro para preparar o quimiotático. Encha cada um bem da placa 24-bem companheiro com 750 µ l de meio completo com 10% FBS, hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
- Adapte o quimiotático para cada linha de célula e de cada condição de tratamento. Para preparar o quimiotático CM (ca-CM), suplemento DMEM com 10% FCS, hidrocortisona 0,4 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
- Transferi a câmara superior para a placa de companheiro pré-carregadas, tendo o cuidado de evitar bolhas.
- Para o ensaio de invasão, Retire cuidadosamente 450 μL de CM de cada câmara de Boyden.
- Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com PBS estéril, adicionar 0,5 mL de tripsina EDTA (0,5 g/L) e em seguida Incube as celulas por 5 min a 37 ° C. Pare a reação adicionando CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.
- Semente 10 34 SQ20B células em 500 μL de médio de 0,1% BSA, dando uma diluição final de 6 104 células/mL.
Nota: A concentração de células deve ser adaptada para cada linha de celular. - Coloque a placa na incubadora a 37 ° C por 24 h.
- Utilize a placa de companheiro para preparar o quimiotático. Encha cada um bem da placa 24-bem companheiro com 750 µ l de meio completo com 10% FBS, hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
Dia 4
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Fixação da pilha e coloração
- Conserte as células antes que o tempo de duplicação específico para essa linha de celular. Fix SQ20B células antes de 24 h.
- Remova cada inserção da placa de companheiro e cuidadosamente, remover as células da câmara superior usando um cotonete. É particularmente importante remover todas as células localizadas na câmara alta.
- Correção e mancha cada inserem individualmente para obter maio-Grunwald Giemsa coloração9 usando o kit de coloração fornecido. Como alternativa, use paraformaldeído 4% em outro prato de companheiro para uma fixação de 30 min.
- Manter as inserções em um prato vazio 24-bem companheiro sob uma capa de laboratório para secar cada câmara.
Dia 5
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Análise microscópica
- Insira a placa de companheiro com as inserções em um microscópio de contraste de fase 20 e contar cada célula migrada na parte inferior da membrana. Otimizar a posição do foco certo movendo o objectivo do fundo ao topo e parar a posição na parte inferior da membrana.
- Calcule a relação entre os números de células migradas e semeado de células. Repita cada contagem para cada condição de tratamento em triplicado.
2. risque ferida ensaio: Migração de células
Nota: As instruções devem ser adaptadas para cada tipo de célula.
Dia 1
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Célula de semeadura
- Semente de 2 x 106 SQ20B células em 12 mL de CM em um balão de2 175 cm 72 h antes de um dia e permitem que as células a crescer a confluência de célula de 80%.
- Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com PBS estéril, adicionar 2,5 mL de tripsina EDTA (0,5 g/L) e incube as celulas por 5 min a 37 ° C. Pare a reação adicionando 12,5 mL de CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.
- Gere uma amostra pré-diluído em uma densidade de célula de 4 x 105/mL, dando uma densidade final de 10 4 células de4 por 100 μL de cada poço. Esta concentração deve ser adaptada para cada linha de celular e deve estar no intervalo de 1 x 104 6 104 células.
- Células de semente em cada cavidade de uma placa de 96 poços por depositar 100 μL de solução preparada na etapa 2.1.2.
- Deixe a placa à temperatura ambiente por 5 min dispersar as células uniformemente no fundo dos poços.
- Colocar a placa para a incubadora e permitir que as células aderir à placa para 12 a 16 h (máximo) a 37 ° C.
Dia 2
-
Coçar a ferida do ensaio
- Retire as placas preparadas na etapa 2.1 da incubadora.
- Sob o capô, fazer uma ferida usando o dispositivo ferindo comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Retire o meio de cada poço usando uma pipeta com uma ponta cónica adaptada, tomando cuidado para não tocar a ferida.
- Lave as células duas vezes, repetindo a aspiração e usando 100 μL de CM aquecido a 37 ° C para cada poço.
- Remova o CM com uma pipeta com uma ponta cónica adaptada após as etapas de lavagem.
- Adicione 100 μL de meio específico para cada condição de tratamento para cada poço.
- Tente evitar criar quaisquer bolhas nos poços. Uma técnica de pipetagem reversa pode ser útil aqui. Como alternativa, remova as bolhas com uma agulha de seringa.
- Coloque a placa dentro do rack adaptado do vídeo microscópio.
- Para melhorar a qualidade de imagem, permitem que a placa aquecer durante pelo menos 15 minutos antes do primeiro scan para evitar condensação na parte inferior da placa.
- Programa a agenda de exames, utilizando o software de vídeo microscópio em uma imagem por bem. Um intervalo máximo de 2-h é necessário para uma experiência de migração de invasão. Se o objetivo do experimento é produzir um vídeo, um intervalo de 30 min máximo é preferencial.
- No final do experimento, lave o dispositivo ferindo com cuidado e siga cada uma das quatro etapas lavagem indicadas pelo fabricante.
Dias 3, 4 e 5
-
Análise de migração usando o vídeo microscópio
- Por um período mínimo de 24 h e até 5 dias, monitorar e verificar a migração celular.
- Use uma máscara de célula apropriada adaptada para cada tipo de célula para analisar a migração celular. Para obter uma máscara de célula adaptada para cada linhagem celular, gere uma célula processamento definição do software usando uma coleção de imagens de célula específica.
- Traçar as curvas e exportar os dados para uma planilha, o que pode ser usada para analisar e comparar os resultados.
3. risque ferida ensaio: Invasão de célula
Nota: As instruções devem ser adaptadas para cada tipo de célula.
Dia 1
-
Célula de semeadura
- Use o mesmo protocolo para semeadura de células conforme descrito no passo 2.1.
Dia 2
-
Preparando o ECM
- Descongelar a matriz para pelo menos 12 h antes de usar a 4 ° C. Certifique-se que os agregados não são visíveis. Se agregados são visíveis, manter a matriz a 4 ° C por um período mais longo, até que desapareçam os agregados. Manter a matriz no gelo. Utilize pontas de pipetas pré-resfriada.
Nota: A matriz solidify se não manteve a 4 ° C. - Relaxa os tubos microcentrifuga no gelo por 5 min.
- CM do refrigerador de refrigeração a 4 ° C e diluir a matriz nos microcentrifuga pré-resfriado tubos para obter uma concentração final de 300 μg/mL.
- Retornar os tubos microcentrifuga com matriz pré-diluído na geladeira a 4 ° C.
Nota: Uma grade adaptada para tubos microcentrifuga é útil para manter os tubos em 4° C, durante todo o experimento.
- Descongelar a matriz para pelo menos 12 h antes de usar a 4 ° C. Certifique-se que os agregados não são visíveis. Se agregados são visíveis, manter a matriz a 4 ° C por um período mais longo, até que desapareçam os agregados. Manter a matriz no gelo. Utilize pontas de pipetas pré-resfriada.
Dia 2
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Coçar a ferida ensaio e tratamento de ECM
- Remova a placa preparada na etapa 3.1 da incubadora.
- Sob o capô, certifique-se da ferida usando o dispositivo ferindo comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Retire o meio de cada poço usando uma pipeta com uma ponta cónica adaptada, tomando cuidado para não tocar a ferida.
- Lavar as células duas vezes, repetindo o procedimento de aspiração e usando 100 μL de CM aquecido a 37 ° C.
- Após a segunda lavagem, coloque a placa sobre a incubadora de 4 ° C para equilibrar a sua temperatura por 5 min.
- Remova o meio frio de cada poço com a pipeta de aspiração com uma ponta cónica, cuidando para pipetar cuidadosamente da borda e evite tocar a ferida.
- Adicionar 50 μL de matriz pré-diluído a cada poço usando pontas cônicas pré-resfriado a 4 ° C.
- Coloque a placa na incubadora a 37 ° C por 30 min.
Nota: Um rack de apoio escaldadas a 37 ° C é útil para acelerar o aquecimento da placa de 96 poços. - Retirar a placa da incubadora e adicione 100 μL do CM adaptada a cada poço conforme indicado para cada condição de tratamento.
- Tente evitar criar quaisquer bolhas nos poços. Uma técnica de pipetagem reversa pode ser útil aqui. Como alternativa, remova as bolhas com uma agulha de seringa.
- Coloque a placa dentro do rack adaptado no vídeo microscópio.
- Para melhorar a qualidade de imagem, permitem que a placa aquecer durante pelo menos 15 minutos antes do primeiro scan para evitar condensação na parte inferior da placa.
- Programe o horário de exames, utilizando o software de vídeo microscópio em uma imagem por alvéolo, no modo de varredura de coçar a ferida. Um intervalo máximo de 2-h em necessários para uma experiência de migração de invasão. Se o objetivo do experimento é produzir um vídeo, um intervalo de 30 min máximo é preferencial.
- No final do experimento, lave o dispositivo ferindo com cuidado e siga cada uma das quatro etapas lavagem indicadas pelo fabricante.
Dias 3, 4 e 5
-
Análise de invasão de pilha usando um microscópio de vídeo.
- Repita a etapa 2.3.
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Representative Results
Nós relatamos aqui dois métodos diferentes para analisar a migração e invasão celular. A Figura 1 mostra a Boyden experimento de câmara. As inserções são colocadas em uma placa de companheiro com quimiotático médio, e as células são semeadas em CM. A membrana pode ser sem revestimento (ensaio de migração) ou revestido (teste de invasão). As células são semeadas na câmara superior em s-CM. A câmara baixa é preenchida com CM como um quimiotático. As células são fixadas antes do tempo de duplicação.
A Figura 2 mostra a membrana Boyden após a fixação da célula. Figura 2A mostra um resultado de qualidade inferior, com os conjuntos de células na parte superior da membrana. Figura 2B mostra um resultado ideal com células fixadas e coradas em azul na membrana.
A Figura 3 mostra um resultado ideal do ensaio do risco de ferimento. A ferida linear pode ser vista na Figura 3A. Não há células são observadas na ferida e cicatrização ocorreu dentro 30 h. O tempo para curar a ferida é dependente da linhagem de células e intervalos de 24 a 50 h.
Figura 3B é uma representação gráfica de cicatrização sob quatro condições de tratamento de feridas: controle, ABT-199 (anti-Bcl-2), cetuximabe (anti-EGFR) e ABT-199 + cetuximab. A ABT-199 + combinação de cetuximab diminuiu significativamente a migração celular. As curvas são obtidas usando o software de vídeo microscópio, que fornece a análise de dados robusto de migração celular, com o tempo. Barras de erro representam o desvio padrão (SD) para cada poço.
Confluência de noventa por cento é a densidade de célula ideal para o ensaio de cicatrização de feridas. A semeadura de célula ideal depende da linhagem celular e varia de 3 x 104 a 6 x 104 células. Figura 4A mostra a densidade de célula ideal, e a Figura 4 mostra a densidade celular baixa. Poços devem ser lavados duas vezes para evitar aglomerados de células, como mostrado na Figura 4B.
Figura 1: representação esquemática do experimento câmara Boyden. As inserções são colocadas em uma placa de companheiro com quimiotático médio, e as células são semeadas em CM. A membrana pode ser sem revestimento (A) ou revestido (B).
Figura 2: Suboptimal e óptimos resultados microscópicos obtidos no experimento de câmara de Boyden. (A) membrana Suboptimal com clusters de célula no lado superior da membrana e difíceis de interpretar resultados. Barra de escala = 300 µm. (B) ideal da membrana com células contáveis na parte inferior da membrana corada em azul. Barra de escala = 300 µm.
Figura 3: óptimos resultados obtidos no experimento cicatrização. (A) imagem representativa da ferida zero ensaio mostrado cicatrização observada em 0, 15 e 30 h. Os critérios para uma experiência de qualidade são uma ferida linear, sem fragmentos de células observaram na ferida e confluência de célula ideal. Barra de escala = 300 µm. (B) representação gráfica de cicatrização mostrando a quantificação dos parâmetros da confluência de célula de ferida (porcentagem) de acordo com o tempo (h). Quatro condições de tratamento são analisadas aqui, e os dados são mostrados com SD.
Figura 4: Suboptimal resultados obtidos no experimento cicatrização. (A) densidade de célula Ideal. (B) problemas lavando o centrifugado. (C) densidade de célula de baixo. Escala de barras = 300 µm
| Vantagens | Desvantagens | |
| Experimento de câmara Boyden | -Quimiotaxia 3D-celular | -Time-consuming |
| -Invasão e a migração com matriz camada revestidos e não revestidos | -Baixa reprodutibilidade | |
| -Caras inserções | ||
| -A não exploração de lapso de tempo | ||
| -Necessidade de células aderentes | ||
| Ensaio de cicatrização de feridas | -Automatic altamente reprodutível e ferida | -2D-célula motilidade |
| -Invasão e a migração com matriz camada revestidos e não revestidos | -Necessidade de células aderentes | |
| -Incluída na análise de proliferação de células | ||
| -Time-Lapse microscópico análise visual | ||
| -Exportação dados de métricas de cura ferida com análises precisas | ||
| -Pós-tratamento software robusto para curvas de migração e invasão celular |
Tabela 1: vantagens e desvantagens da Boyden câmara experimento e ensaio de cicatrização vídeo microscópio. As vantagens e desvantagens da câmara Boyden experimentar e zero ferida do ensaio.
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Discussion
Nós relatamos aqui duas modalidades diferentes para estudar o processo de migração e invasão celular. A análise deste processo é importante para a compreensão dos factores envolvidos na recorrência metastática, que pode ser explicada pelo aumento da mobilidade de uma subpopulação de células de câncer chamado câncer células-tronco10,11.
O experimento de câmara de Boyden é uma o mais frequentemente usado invasão e migração de células de técnicas para explorar. Uma vantagem dessa abordagem é sua reprodutibilidade, embora esta técnica é altamente dependente da experiência do experimentador. Contagem de células é manual e pode variar entre experimentadores. Muitos passos críticos devem ser padronizados e seguidos com cuidado, como garantir a utilização o meio apropriado de quimiotático e fome específica para cada linha de celular. Remoção de células da membrana superior com um cotonete de algodão também é crucial para garantir melhores resultados e evitando os suboptimal resultados mostrados na Figura 2A. Se este ensaio é usado para avaliar a motilidade celular, invasão e as capacidades de migração através de uma membrana de poroso tridimensional (3D), não é possível rastrear as células através de um experimento de lapso de tempo. Além disso, as inserções comerciais com uma membrana porosa muitas vezes são caras.
O ensaio de vídeo baseados em microscópio zero ferida aqui apresentado é uma técnica robusta para avaliar a invasão e a migração celular. O ensaio é realizado com um fabricante de ferimento mecânico e fornece uma comparação reprodutível entre as condições de tratamento. O análise microscópico de vídeo pode ser usado para gerar dados quantitativos precisos para ferida confluência de cura e célula através de um experimento de lapso de tempo. Análise de tempos a tempos de condições de tratamento diferentes pode ser confirmado por observações microscópicas. Esta análise integra a proliferação celular durante o ensaio e leva em conta o tempo de duplicação da célula. Vídeo ou conteúdo de dados brutos pode ser exportado para obter uma representação altamente visual dos resultados, conforme as curvas de migração celular na Figura 3B.
São necessárias muitas etapas críticas para obter resultados interpretáveis. As condições ideais para a semeadura de célula são dependentes da linhagem celular e devem ser testadas com diferentes diluições para obter a confluência de célula de 90% dos poços. Para obter uma ferida linear, chapeamento de célula não deve exceder 16 h. A etapa de lavagem deve ser feita duas vezes e rapidamente para evitar a introdução de fragmentos de célula dentro da ferida que pode alterar os resultados. Para a ferida de risco de invasão, cuidado o ECM adequado também é um passo crítico. As taxas de resfriamento devem ser constantes, e o ECM deve ser manipulado com pontas de pipetas refrigerados e mantido a 4 ° C.
Estas técnicas têm muitas vantagens, que estão resumidas na tabela 1. As células aderentes são necessários para esta técnica. Arranhando causas mecânicas lesão às células, que provoca a liberação do conteúdo celular para o meio circundante e pode influenciar o processo de migração. O risco de ferimento fornece uma estimativa da motilidade celular 2D mas não da quimiotaxia de células, que não pode ser estudada usando esta técnica. Recentemente desenvolvemos um ensaio de vídeo quimiotaxia microscópico, usando um sistema comercial. Este ensaio necessita células com uma capacidade de alta migração, tais como câncer células-tronco, conforme descrito anteriormente,12. Esta nova técnica pode tornar-se o padrão de ouro para os ensaios de migração de invasão no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Estas técnicas foram desenvolvidas com o apoio do LabEx PRIMES (ANR-11-LABX-0063), o plano Contrat-Etat-região (CPER) no âmbito científico da ETOILE (CPER 2009-2013) e lírica Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
