Summary
Denne studien rapporterer to ulike metoder for analyse av cellen invasjon og migrering: Boyden kammeret analysen og i vitro video mikroskop-baserte sårhelende analysen. Protokollene for disse to eksperimenter er beskrevet, og sine fordeler og ulemper sammenlignes.
Abstract
Invasjonen og migrasjon evnene av kreftceller er viktigste bidragsyterne til kreft progresjon og regelmessighet. Mange studier har utforsket migrasjon og invasjonen evner til å forstå hvordan kreftceller spre, med sikte på å utvikle nye behandling strategier. Analyse av mobilnettet og molekylære grunnlaget for disse evner har ført til karakterisering av cellen mobilitet og mekanisk-egenskaper cytoskjelett og mobil microenvironment. I mange år, har Boyden kammeret analysen og scratch såret analysen vært standard teknikker å studere celle invasjon og overføring. Disse to teknikker har imidlertid begrensninger. Boyden kammeret analysen er vanskelig og tidkrevende scratch såret analysen har lav reproduserbarhet. Utviklingen av moderne teknologi, spesielt i mikroskopi, økt reproduserbarhet til scratch såret analysen. Bruker kraftig analyse systemer, kan en "i-inkubator" video mikroskop brukes til å gi automatisk og sanntids analyse av celle migrasjon og invasjon. Målet med denne utredningen er å rapportere og sammenligne de to analyser brukes cellen invasjonen og migrering: Boyden kammeret analysen og en optimalisert i vitro video mikroskop-baserte scratch sår analysen.
Introduction
Cellen invasjon og migrasjon er involvert i formidling av kreftceller, som er den viktigste årsaken til motstand til behandling1 og kan føre til locoregional eller metastatisk tilbakefall etter kreft behandling2. Epitel-mesenchymal overgangen (EMT) er den første prosessen med celle invasjonen-migrasjon i som kreft celler bytte fra en epithelial til en mesenchymal fenotypen. E-Cadherin er en ekstracellulære markør av epitelial fenotypen3økt uttrykk for N-cadherin og vimentin er karakteristisk av mesenchymal fenotypen4. Migrasjon også avhengig av iboende antall celler å invadere den ekstracellulære matrisen (EFM) gjennom handling i matrise metalloproteases5.
Denne invasjonen-overføring mekanisme har blitt beskrevet for kreft på mange steder, spesielt i hode og nakke kreft6. Mange forskere har fokusert på migrasjon og invasjonen prosesser å forstå bedre hvordan kreftceller spre i håp om at denne kunnskapen vil føre til ny behandling strategier. Det er avgjørende at disse studiene utføres ved hjelp av pålitelige og reproduserbar analyser.
In vitro analyser av cellen motilitet kan være utfordrende. Utviklet for mange år siden, anses Boyden kammeret analysen å være standard for invasjonen-overføring analyse7. Men det er tidkrevende og er ofte unøyaktig. En andre test er sårhelende analysen8, som involverer å lage en ripe på en celle monolayer kultur og ta skjermbilder av cellen invasjon og migrasjon ved faste tidsintervaller. Denne teknikken har blitt mye kritisert på grunn av de store variasjonene mellom resultatene fra to etterfølgende tester. Men bedret anvendelsen av moderne teknologi, spesielt i mikroskopi, reproduserbarhet til scratch såret analysen. Video mikroskop lett kan innføres i inkubatorer og kan generere sanntid bilder av celle migrasjon. Disse enhetene registrere mikroskopiske data og gir automatisk analyse av såret celle samløpet over tid. Målet med denne utredningen er å beskrive Boyden kammeret analysen og optimalisert scratch såret analysen, og å diskutere fordeler og svakheter av hver tilnærming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: De Boyden chamber og bunnen analyser uten inkludering av ECM kalles overføring analysen, og de samme analyser med ECM kalles invasjonen analysen.
1. Boyden kammeret analysen
Merk: Denne protokollen er tilpasset SQ20B celle linjen, som er avledet fra en tilbakevendende hodet og nakken Squamous celle Carcinoma (HNSCC) strupekreft og ble Hentet fra John Little (Boston, MA, USA).
Dag 1
-
Cellen såing
- Frø 2 106 SQ20B celler i 12 mL kultur medium (CM) i en 175 cm2 kolbe 72 h før dag én, og at cellene å vokse til 80% celle samløpet.
- For å forberede CM SQ20B celler, supplere Dulbeccos endret Eagle medium (DMEM) med 10% fosterets kalv serum (FCS), 0.04 mg/mL hydrocortisone, 100 U/mL penicillin og 0,1 finans streptomycin.
- Under laminær strømning hette, trypsinize cellene. Fjerne mediet, vaske cellene med sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) og legge til 2,5 mL av trypsin ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (0,5 g/L). Ruge celler for 5 min på 37 ° C og deretter stoppe reaksjonen ved å legge til 12,5 mL cm varmet til 37 ° C. Tell antall celler med en celle teller.
- Frø cellene i en 25 cm2 kolbe på en celle tetthet av 6-105 celler for hvert vilkår evalueres. Inkuber celler for 24 h i 3 mL CM.
- Frø 2 106 SQ20B celler i 12 mL kultur medium (CM) i en 175 cm2 kolbe 72 h før dag én, og at cellene å vokse til 80% celle samløpet.
Dag 2
-
Sult og utarbeidelse av belagt kammer
- Sulte cellene ved å erstatte mediet i hver kolbe med 3 mL av lav-fosterets bovin serum (FBS) medium med 0,1% bovin serum albumin (BSA) i stedet for FBS. Sulte celler for 24 h i inkubator.
- For å forberede sult CM (s-CM), supplement DMEM med 0,1% BSA, 0.04 mg/mL hydrocortisone, 100 U/mL penicillin og 0,1 finans streptomycin.
- Migrasjon analysen, gå til trinn 1.3.
- For invasjonen analysen forberede 12t før dag 3, belagt Boyden chambers ved å legge 500 μL s-CM hver belagt kammer. Bruke kommersielt forberedt belagt Boyden kamre og holde dem i 4 ° C før bruk. Plasser hver Boyden kammeret i følgesvenn platen og angi det i kuvøse på 37 ° C over natten.
- Sulte cellene ved å erstatte mediet i hver kolbe med 3 mL av lav-fosterets bovin serum (FBS) medium med 0,1% bovin serum albumin (BSA) i stedet for FBS. Sulte celler for 24 h i inkubator.
Dag 3
-
Cellen seeding i Boyden kammeret
- Bruk følgesvenn platen til å forberede til chemoattractant. Fyll hver brønn av 24-vel følgesvenn platen med 750 μL komplett medium med 10% FBS, 0.04 mg/mL hydrocortisone, 100 U/mL penicillin og 0,1 finans streptomycin.
- Tilpasse chemoattractant for hver celle linje og hver behandling tilstand. For å forberede chemoattractant CM (ca-CM), supplement DMEM med 10% FCS, 0.4 mg/mL hydrocortisone, 100 U/mL penicillin og 0,1 finans streptomycin.
- Overfør den øvre kammeret til forhåndsutfylte følgesvenn platen, ta vare for å unngå bobler.
- Invasjonen analysen, nøye fjerne 450 μL CM fra hver Boyden kammeret.
- Under laminær strømning hette, trypsinize cellene. Fjerne mediet, vaske cellene med sterilt PBS, Legg til 0,5 mL av trypsin EDTA (0,5 g/L) og deretter ruge celler for 5 min på 37 ° C. Stoppe reaksjonen ved å legge CM varmet til 37 ° C. Tell antall celler med en celle teller.
- Frø 3 104 SQ20B celler i 500 μL 0,1% BSA medium, gi en endelig fortynning av 6-104 celler/mL.
Merk: Cellen konsentrasjonen bør tilpasses for hver celle linje. - Plass platen i inkubator på 37 ° C for 24 timer.
- Bruk følgesvenn platen til å forberede til chemoattractant. Fyll hver brønn av 24-vel følgesvenn platen med 750 μL komplett medium med 10% FBS, 0.04 mg/mL hydrocortisone, 100 U/mL penicillin og 0,1 finans streptomycin.
Dag 4
-
Cellen fiksering og flekker
- Fastsette cellene før dobling gjelder for cellen linjen. Fastsette SQ20B celler før 24 timer.
- Fjern hver sette inn fra følgesvenn platen og nøye fjerne celler fra den øvre kammeret med en bomullspinne. Det er spesielt viktig å fjerne alle celler i det øvre kammeret.
- Fastsette og flekken hvert sett individuelt for å få mai-Grunwald Giemsa farge9 ved hjelp av flekker kit leveres. Alternativt bruke 4% paraformaldehyde i en annen følgesvenn plate for en 30 min fiksering.
- Vær som setter inn en tom 24-vel følgesvenn plate under laboratoriet hette tørke hvert kammer.
Dag 5
-
Mikroskopisk analyse
- Sett inn følgesvenn platen med innlegg på 20 kontrast mikroskop og telle hver overførte celle i nedre del av membranen. Optimalisere riktig fokus posisjonen ved å flytte målet fra bunnen til toppen, og stoppe posisjon på den nederste delen av membranen.
- Beregne forholdet mellom Antall overførte celler og seeded celler. Gjenta hver telling for betingelsene behandling i tre eksemplarer.
2. grunnen sår analysen: Celle migrasjon
Merk: Instruksjonene må tilpasses for hver celle.
Dag 1
-
Cellen såing
- Frø 2 x 106 SQ20B celler i 12 mL CM i en 175 cm2 kolbe 72 h før dag én, og at cellene å vokse til 80% celle samløpet.
- Under laminær strømning hette, trypsinize cellene. Fjerne mediet, vaske cellene med sterilt PBS, legge til 2,5 mL av trypsin EDTA (0,5 g/L) og ruge celler for 5 min på 37 ° C. Stoppe reaksjonen ved å legge til 12,5 mL cm varmet til 37 ° C. Tell antall celler med en celle teller.
- Generere en prediluted eksempel på en celle tetthet av 4 x 105/mL, gi en endelig tetthet av 4 104 celler per 100 μL i hver brønn. Denne konsentrasjonen må tilpasses for hver celle linje og bør være i området fra 1 x 104 til 6 104 celler.
- Frø celler i hver brønn av en 96-brønns plate av innskudd 100 μL av løsningen i trinn 2.1.2.
- La platen ved romtemperatur for 5 min å spre cellene jevnt på bunnen av brønnene.
- Plasser platen i inkubator, og at cellene å overholde platen i 12 til 16 h (maks) på 37 ° C.
Dag 2
-
Scratch såret analysen
- Fjern platene i trinn 2.1 fra inkubator.
- Under panseret, gjør et sår med kommersielle såret enhet ifølge produsentens protokollen.
- Umiddelbart fjerne mediet fra hver brønn ved å en pipette med en tilpasset konisk tips, ta vare ikke for å berøre såret.
- Vask cellene to ganger ved gjentatt aspirasjon og bruke 100 μL CM varmet til 37 ° C i hver brønn.
- Fjerne CM med en pipette med en tilpasset koniske spissen etter vask trinnene.
- Tilsett 100 μL av medium spesifikke for hver behandling tilstand i hver brønn.
- Prøv å unngå å skape bobler i brønnene. En omvendt-pipettering teknikk kan være nyttig her. Du kan også fjerne bobler med en sprøyte nål.
- Plass platen i tilpasset rack med video mikroskopet.
- For å forbedre bildekvaliteten, kan platen til varme i minst 15 minutter før første skanningen å unngå kondens på nedre side av platen.
- Programmet tidsplanen skanninger, bruker programmet video mikroskopet på ett bilde per brønn. 2-h Maksimumsintervall er nødvendig for et eksperiment for invasjonen-migrering. Hvis målet for eksperimentet er å produsere en video, foretrekkes et intervall på 30 min maksimal.
- På slutten av eksperimentet, vask såret enheten nøye, og følge alle fire vask trinnene som er angitt av produsenten.
Dager 3, 4 og 5
-
Analyse av overføring av video mikroskopet
- Minimum 24 h og opp til 5 dager, overvåke og kontrollere celle migrasjon.
- Bruke en aktuelle cellen maske tilpasset for hver celle for å analysere celle migrasjon. For å få en celle maske tilpasset hver celle linje, generere en celle behandling definisjon fra programvaren ved hjelp av en bestemt celle bildesamlingen.
- Spore kurvene og eksportere dataene til et regneark, som kan brukes til å analysere og sammenligne resultatene.
3. grunnen sår analysen: Cellen invasjon
Merk: Instruksjonene må tilpasses for hver celle.
Dag 1
-
Cellen såing
- Bruke samme protokoll for cellen frø som beskrevet i trinn 2.1.
Dag 2
-
Forbereder ECM
- Defrost matrix minst 12 h før bruk 4 ° C. Kontroller at ingen oppsamlinger er synlige. Hvis aggregater vises, holde matrisen på 4 ° C for en lengre periode før aggregatene forsvinner. Holde matrisen på is. Bruk forkjøles pipette-spisser.
Merk: Matrix stivner dersom ikke holdt på 4 ° C. - Chill microcentrifuge rør på is 5 min.
- Ta CM kjølt ned til 4 ° C fra kjøleskap og fortynne matrix i forkjøles microcentrifuge rør for å få en endelig konsentrasjon av 300 μg/mL.
- Returner microcentrifuge rør med prediluted matrise i kjøleskapet i 4 ° C.
Merk: En avkjølende rack tilpasset microcentrifuge rør er nyttig for å opprettholde rørene på 4° C hele eksperimentet.
- Defrost matrix minst 12 h før bruk 4 ° C. Kontroller at ingen oppsamlinger er synlige. Hvis aggregater vises, holde matrisen på 4 ° C for en lengre periode før aggregatene forsvinner. Holde matrisen på is. Bruk forkjøles pipette-spisser.
Dag 2
-
Scratch såret analysen og behandling av ECM
- Fjerne platen i trinn 3.1 settefiskanlegg.
- Under panseret, gjøre såret med kommersielle såret enhet ifølge produsentens protokollen.
- Umiddelbart fjerne mediet fra hver brønn ved å en pipette med en tilpasset koniske spissen ta vare ikke for å berøre såret.
- Vask cellene to ganger ved å gjenta prosedyren aspirasjon og bruke 100 μL CM varmet til 37 ° C.
- Etter andre vask, plass platen på 4 ° C inkubator å equilibrate sin temperatur i 5 min.
- Fjern den kalde mediet fra hver brønn med aspirasjon pipette med en konisk tips, ta vare å Pipetter forsiktig fra kanten og unngå å berøre såret.
- Tilsett 50 μL av prediluted matrise i hver brønn ved hjelp forkjøles konisk tips på 4 ° C.
- Plass platen i kuvøse på 37 ° C i 30 min.
Merk: En prewarmed støtte rack på 37 ° C er nyttig å akselerere global oppvarming av 96-brønns plate. - Fjern platen settefiskanlegg og tilsett 100 μL av tilpasset CM hver brønn som angitt for hver behandling betingelse.
- Prøv å unngå å skape bobler i brønnene. En omvendt-pipettering teknikk kan være nyttig her. Du kan også fjerne bobler med en sprøyte nål.
- Plass platen i tilpasset racket på video mikroskopet.
- For å forbedre bildekvaliteten, kan platen til varme i minst 15 minutter før første skanningen å unngå kondens på nedre side av platen.
- Programmet tidsplanen skanninger, bruke video mikroskop programvaren på ett bilde per Vel, i skannemodus Scratch sår. 2-h Maksimumsintervall i nødvendig for et eksperiment for invasjonen-migrering. Hvis målet for eksperimentet er å produsere en video, foretrekkes et intervall på 30 min maksimal.
- På slutten av eksperimentet, vask såret enheten nøye, og følge alle fire vask trinnene som er angitt av produsenten.
Dager 3, 4 og 5
-
Analyse av cellen invasjonen bruker video mikroskop.
- Gjenta trinn 2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi rapporterer her to forskjellige metoder for å analysere celle invasjon og overføring. Figur 1 viser Boyden chamber eksperiment. Skivene er plassert i en følgesvenn plate med chemoattractant medium, og cellene er sådd i CM. Membranen kan ubestrøket (migrasjon analysen) eller bestrøket (invasjonen analysen). Celler er sådd i det øvre kammeret i s-CM. Nedre kammeret er fylt med CM som en chemoattractant. Cellene er løst før dobling.
Figur 2 viser Boyden membranen etter celle fiksering. Figur 2A viser en suboptimal resultatet med cellen klynger på oversiden av membranen. Figur 2B viser et optimalt resultat med celler fast og farget i blått membranen.
Figur 3 viser et optimalt resultat av scratch såret analysen. Lineær såret ses i figur 3A. Ingen celler er observert i såret, og sårheling oppstod i 30 timer. Tid til å lege såret er avhengig av cellen linje og varierer fra 24 til 50 h.
Figur 3B er en grafisk fremstilling av sårheling med fire behandling forhold: kontroll, ABT-199 (anti-Bcl-2), cetuximab (anti-EGFR) og ABT-199 + cetuximab. ABT-199 + cetuximab kombinasjon betydelig redusert celle migrasjon. Kurvene er oppnådd ved hjelp av video mikroskop programvare, som gir sikre dataanalyse av celle migrasjon med tid. Feilfelt representerer standardavviket (SD) for hver brønn.
Nitti prosent samløpet er optimal celle tettheten for sårhelende analysen. Den optimale celle seeding avhengig celle linjen og varierer fra 3 x 104 til 6 x 104 celler. Figur 4A viser den optimale celle tettheten, og figur 4C viser lav celle tetthet. Brønner skal bli vasket to ganger for å unngå celle klynger, som vist i figur 4B.
Figur 1: skjematisk fremstilling av Boyden kammeret eksperimentet. Setter inn plasseres i en følgesvenn plate med chemoattractant medium, og cellene er sådd i CM. Membranen kan være ubestrøket (A) eller belagt (B).
Figur 2: Suboptimal og optimal mikroskopiske resultatene i Boyden kammeret eksperimentet. (A) Suboptimal membran med cellen klynger på oversiden av membranen og uninterpretable resultater. Skala bar = 300 µm. (B) Optimal membran med countable celler i nedre del av membranen farget i blått. Skala bar = 300 µm.
Figur 3: optimale resultater oppnådd i sårhelende eksperimentet. (A) representativt bilde fra scratch såret analysen vises sårheling observert på 0, 15 og 30 timer. Kriteriene for en kvalitet eksperiment er en lineær såret, ingen cellen fragmenter observert i såret og optimal celle samløpet. Skala bar = 300 µm. (B) grafisk representasjon av sårheling viser kvantifisering av såret celle samløpet (prosent) i henhold til tid (h). Fire behandling betingelsene analyseres her, og dataene vises med SD.
Figur 4: Suboptimal resultatene i sårhelende eksperimentet. (A) ideelle celle tetthet. (B) problemer vaske celle pellets. (C) lav celle tetthet. Skalere barer = 300 µm
| Fordeler | Ulemper | |
| Boyden kammeret eksperiment | -3D-celle Chemotaxis | -Tidkrevende |
| -Både invasjonen og migrering med belagt og ikke belagt lag matrise | -Lav reproduserbarhet | |
| -Dyre setter | ||
| -Ingen Time-Lapse leting | ||
| -Trenger tilhenger celler | ||
| Sårtilheling analysen | -Automatisk svært reproduserbar sår | -2D-celle motilitet |
| -Både invasjonen og migrering med belagt og ikke belagt lag matrise | -Trenger tilhenger celler | |
| -Celle spredning inkludert i analysen | ||
| -Time-Lapse mikroskopiske visuell analyse | ||
| -Data eksport av sår helbredelse beregninger med analyse | ||
| -Etter behandling robust programvare for celle migrasjon og invasjonen kurver |
Tabell 1: fordeler og ulemper ved Boyden chamber eksperiment og video mikroskop sårhelende analysen. Fordeler og ulemper av Boyden kammeret eksperimenter og bunnen sår analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer her to ulike modaliteter for å studere celle invasjon og migrasjon prosessen. Analyse av denne prosessen er viktig å forstå faktorene som er involvert i metastatisk regelmessighet som kan forklares med økte motilitet av en subpopulasjon av kreftceller kalt kreft stamceller10,11.
Boyden kammeret eksperimentet er en de mest brukte teknikker for å utforske celle invasjon og overføring. En fordel med denne tilnærmingen er dens reproduserbarhet, selv om denne teknikken er svært avhengig av eksperimentator kompetanse. Cellen teller er manuell og kan variere mellom forskere. Mange viktige skritt må være standardisert og fulgte med forsiktighet, slik som å sikre bruk av riktig chemoattractant og sult medium som er spesifikke for hver celle linje. Fjerne celler fra øvre membranen med en bomullspinne er også avgjørende for å sikre optimale resultater og unngå suboptimal resultatene som vises i figur 2A. Hvis denne analysen brukes til å evaluere celle motilitet, invasjon og overføring kapasitet gjennom en tredimensjonal (3D) porøs membran, er det ikke mulig å spore celler gjennom en time-lapse eksperiment. Videre er kommersiell setter med en porøs membran ofte dyre.
Video mikroskop-baserte scratch såret analysen presenteres her er en robust teknikk for å vurdere celle migrasjon og invasjon. Analysen er utført med en mekanisk såret maker og gir en reproduserbar sammenligning mellom behandling forhold. Den mikroskopiske videoanalyse kan brukes til å generere nøyaktige kvantitative data for sår helbredelse og celle samløpet gjennom en time-lapse eksperiment. Tid til annen analyse av annen behandling kan være bekreftet av mikroskopiske observasjoner. Denne analysen integrerer celle spredning under analysen og tar hensyn til celle-dobling tid. Video eller rådata innhold kan eksporteres for å få en svært visuell fremstilling av resultatene som vises i celle migrasjon kurvene i figur 3B.
Mange viktige trinn kreves for å få interpretable resultater. Optimale forhold for cellen seeding er avhengige av cellen linjen og må testes med forskjellige fortynninger å få 90% celle samløpet i brønnene. For å få en lineær såret, må celle plating ikke overskride 16 h. Vask trinnet må gjøres to ganger og raskt å unngå presenterer celle rusk i såret som kan endre resultatet. For invasjonen scratch såret, lated bekymre av ECM er også et avgjørende skritt. Kjøling priser må være konstant, og ECM skal manipuleres med kjølt pipette-spisser og opprettholdt på 4 ° C.
Disse teknikkene har mange fordeler som er oppsummert i tabell 1. Tilhenger celler er nødvendig for denne teknikken. Skrape årsaker mekanisk skade på cellene, som fører til utgivelsen av mobilnettet innholdet til omkringliggende medium og kan påvirke overføringsprosessen. Scratch såret analysen gir et anslag av 2D celle motilitet men ikke cellen chemotaxis, som kan studeres ved hjelp av denne teknikken. Vi har nylig utviklet en video mikroskopiske chemotaxis analysen ved å bruke en kommersiell plating. Denne analysen må celler med en høy overføring evne, for eksempel kreft stamceller, som beskrevet tidligere12. Denne nye teknikken kan bli gullstandarden for invasjonen-migration analyser i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Disse teknikkene ble utviklet med støtte fra LabEx PRIMTALL (ANR-11-LABX-0063), Contrat Plan-Etat-regionen (CPER) innen vitenskapelige rammen av ETOILE (CPER 2009-2013) og lyriske Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
