Summary
Это исследование доклады двух различных методов для анализа клеток вторжения и миграции: Бойден Пробирной палаты и в пробирке видео на базе микроскопа заживление assay. Описываются протоколы для этих двух экспериментов, и сравнение их преимущества и недостатки.
Abstract
Вторжения и миграции способности опухолевых клеток являются главными источниками прогрессии рака и повторения. Многие исследования изучили миграции и вторжения способности, чтобы понять, как распространение раковых клеток, с целью разработки новых стратегий лечения. Анализ клеточных и молекулярные основы этих способностей привело к характеристика клеток мобильности и физико-химических свойств цитоскелета и клеточных микроокружения. На протяжении многих лет Пробирной палаты Бойден и пробирного скретч раны были стандартные методы для изучения клеток вторжения и миграции. Однако эти два метода имеют ограничения. Пробирная палата Бойден, сложным и трудоемким, и пробирного скретч раны имеет низкая воспроизводимость. Развитие современных технологий, особенно в микроскопии, увеличилась воспроизводимость assay скретч рану. С помощью мощных аналитических систем, видео Микроскоп «инкубатор» может использоваться для обеспечения автоматического и в реальном времени анализ миграции клеток и вторжения. Целью этого документа является отчет и сравнить два анализов, используется для изучения клеток вторжения и миграции: Бойден Пробирной палаты и оптимизированный в vitro видео на базе микроскопа царапин РАН пробирного.
Introduction
Клетки вторжения и миграции участвуют в распространении раковых клеток, который является основной причиной резистентности к лечению1 и может привести к локорегионарной или метастатической рецидива после лечения рака2. Эпителиальный мезенхимальных переход (EMT) является начальный процесс клеток вторжения миграции в котором рака клеток переключиться из эпителиальных мезенхимальных фенотип. E-Кадгерины является внеклеточным маркер эпителиальных фенотипу3, и увеличение выражение N-Кадгерины и виментин характерно мезенхимальных фенотип4. Миграции также зависит от внутренней способности раковых клеток вторгнуться внеклеточного матрикса (ECM) через действие матрицы металлопротеаз5.
Этот механизм вторжения – миграции был описан для рака во многих местах, особенно в головы и шеи рак6. Многие исследователи сосредоточились на процессах миграции и вторжения, чтобы лучше понять, как распространение раковых клеток в надежде на то, что это знание приведет к новой стратегии лечения. Важно, что эти исследования выполняются с использованием надежных и воспроизводимых анализов.
В vitro анализа подвижности клеток может быть сложным. Разработаны много лет назад, Пробирной палаты Бойден считается стандартом для вторжения – миграции анализ7. Однако это занимает много времени и часто неточно. Второй тест является ранозаживляющим пробирного8, которая предполагает принятие царапина на культуру монослоя клеток и захвата изображения клетки вторжения и миграции в фиксированных временных интервалов. Этот метод широко подвергается критике из-за большого различия между результатами двух последовательных испытаний. Однако применение современных технологий, особенно в микроскопии, улучшилась воспроизводимость assay скретч рану. Видео Микроскопы могут быть легко введены в инкубаторы и может генерировать изображения в реальном времени миграции клеток. Эти устройства записи микроскопических данных и автоматического анализа слияния клеток рану со временем. Цель этого документа — для описания Бойден Пробирной палаты и пробирного оптимизированный скретч рану и обсудить преимущества и недостатки каждого подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Бойден камеры и нуля анализы без включения ECM упоминаются как assay переноса, и же анализов с ECM именуется как assay вторжения.
1. Бойден Пробирной палаты
Примечание: Этот протокол приспособлен для линии клеток SQ20B, который является производным от периодических головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC) рак гортани и был получен от Иоанна мало (Бостон, MA, США).
1 день
-
Заполнение ячеек
- Семенной 2 106 SQ20B клетки в 12 мл питательной среды (CM) в колбе2 175 см 72 h до один день и позволяют клеткам расти до 80% клеток слияния.
- Чтобы подготовить см для SQ20B клеток, дополнение Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), гидрокортизон 0,04 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
- Под капотом ламинарного потока trypsinize клетки. Удалите носитель, вымыть клетки с стерильных фосфат амортизированное saline (PBS) и добавить 2,5 мл трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (0,5 г/Л). Инкубировать клетки для 5 минут при 37 ° C и затем остановить реакции, добавив 12,5 мл см прогреты до 37 ° C. Подсчитать количество ячеек с помощью счетчик соматических клеток.
- Заполнить клетки в колбе2 25 см на плотность клеток 6 10 клеток5 для каждого проверяемое условие. Инкубируйте клетки для 24 часа в 3 мл см.
- Семенной 2 106 SQ20B клетки в 12 мл питательной среды (CM) в колбе2 175 см 72 h до один день и позволяют клеткам расти до 80% клеток слияния.
День 2
-
Голодание клеток и подготовка покрытием камер
- Голодать клетки, заменив средних в каждый флакон 3 мл low плода бычьим сывороточным (ФБС) среды с помощью 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) вместо FBS. Голодать клетки для 24 h в инкубаторе.
- Чтобы подготовить голода (s-см), дополнение DMEM с 0.1% BSA, гидрокортизон 0,04 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
- Для анализа миграции перейдите к шагу 1.3.
- Для вторжения assay, 12 h до дня 3 Подготовьте покрытием камер Бойден, добавив 500 мкл s-см к каждой камере с покрытием. Использование коммерчески подготовленные покрытием Бойден камер и держать их на 4 ° C перед использованием. Место каждой камеры Бойдена в пластину компаньон и установите его в инкубаторе при 37 ° C на ночь.
- Голодать клетки, заменив средних в каждый флакон 3 мл low плода бычьим сывороточным (ФБС) среды с помощью 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) вместо FBS. Голодать клетки для 24 h в инкубаторе.
День 3
-
Ячейка, посева в зале Бойдена
- Используйте пластину компаньон для подготовки хемотаксического. Заполните каждый хорошо из 24-ну компаньон пластины с 750 мкл полной среды с 10% FBS, гидрокортизон 0,04 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
- Адаптировать хемотаксического для каждой ячейки строки и каждое условие лечения. Чтобы подготовить хемотаксического см (ca см), дополнение DMEM с 10% FCS, гидрокортизон 0,4 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
- Передача верхняя палата в пластину преднаполненных компаньон, заботясь, чтобы избежать пузырей.
- Для вторжения assay осторожно удалите 450 мкл см от каждой камеры Бойден.
- Под капотом ламинарного потока trypsinize клетки. Удалите носитель, вымыть клетки с стерильных PBS, добавить 0,5 мл трипсина ЭДТА (0,5 г/Л) и затем инкубации клеток для 5 минут при 37 ° C. Остановить реакции, добавив см прогреты до 37 ° C. Подсчитать количество ячеек с помощью счетчик соматических клеток.
- Семенной 3 104 SQ20B клетки в 500 мкл 0,1% BSA среды, давая окончательного растворения4 6 10 клеток/мл.
Примечание: Концентрация клеток должны быть адаптированы для каждой ячейки строки. - Место пластину в инкубаторе при 37 ° C за 24 ч.
- Используйте пластину компаньон для подготовки хемотаксического. Заполните каждый хорошо из 24-ну компаньон пластины с 750 мкл полной среды с 10% FBS, гидрокортизон 0,04 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 г/Л.
День 4
-
Клетки фиксации и окраски
- Исправьте клетки до удвоения времени, характерные для этой линии клеток. Исправьте SQ20B клетки до 24 ч.
- Снять пластину компаньон каждой вставки и тщательно удалить ячейки из верхней камеры с помощью ватного тампона. Это особенно важно, чтобы удалить все ячейки, расположенные в верхней палате.
- Исправление и пятно вставить индивидуально для получения мая-Грюнвальд Гимза окраска9 с помощью окрашивания комплекта предусмотрено. В качестве альтернативы используйте параформальдегида 4% другой спутник пластина для фиксации 30 мин.
- Держите вставок в пустой 24-ну компаньон пластине под капотом лаборатории для просушки каждой палаты.
День 5
-
Микроскопический анализ
- Вставьте пластину компаньон с вставками на 20 фазово контрастной микроскопа и рассчитывать каждый миграции клеток в нижней части мембраны. Оптимизировать правый фокус позицию путем перемещения цель от дна к верхней и остановить позицию на нижней части мембраны.
- Рассчитайте соотношение между количеством миграции клеток и клеток в сеяный. Повторите каждое количество для каждого условия лечения в трех экземплярах.
2. нуля ранение пробирного: Миграция клеток
Примечание: Инструкции должны быть адаптированы для каждого типа клеток.
1 день
-
Заполнение ячеек
- Семенной 2 x 10-6 SQ20B клетки в 12 мл см в колбе2 175 см 72 h до один день и позволяют клеткам расти до 80% клеток слияния.
- Под капотом ламинарного потока trypsinize клетки. Удалите носитель, вымыть клетки с стерильных PBS, добавить 2,5 мл трипсина ЭДТА (0,5 г/Л) и инкубации клеток для 5 минут при 37 ° C. Остановить реакции, добавив 12,5 мл см прогреты до 37 ° C. Подсчитать количество ячеек с помощью счетчик соматических клеток.
- Создайте образец prediluted на клетки плотности 4 x 105/мл, давая окончательный плотность клеток4 4 10 100 мкл в каждой скважине. Эта концентрация должна быть адаптирована для каждой ячейки строки и должно быть в диапазоне от4 1 x 10-6 104 клетки.
- Семя клеток в каждой скважине 96-луночных плиты сдачи 100 мкл раствора, подготовленную на этапе 2.1.2.
- Оставьте при комнатной температуре за 5 мин для разгона ячейки равномерно в нижней части скважины пластину.
- Место пластину в инкубаторе и позволяют клеткам присоединиться к пластине для 12-16 ч (максимальная) при 37 ° C.
День 2
-
Поцарапать рану пробирного
- Снимите крышки, подготовленные на шаге 2.1 из инкубатора.
- Под капотом чтобы раны с использованием коммерческих ранив устройства согласно протоколу производителя.
- Немедленно удалите средство из каждой хорошо с помощью пипетки с адаптированы конический наконечник, стараясь не коснуться рану.
- Вымойте клетки дважды, повторяя стремление и используя 100 мкл см, разогретую до 37 ° C для каждой скважины.
- Удалите с помощью пипетки с адаптированных конический наконечник после стирки шагов см.
- Добавьте 100 мкл среды, конкретных для каждого условия лечения в каждой скважине.
- Старайтесь избегать создания любые пузыри в скважинах. Реверс дозирование технику могут быть полезны здесь. Кроме того Удалите пузырьки с иглой шприца.
- Место пластину в адаптированных стойку видео Микроскоп.
- Чтобы улучшить качество изображения, позволяют плита тепло для по крайней мере 15 минут до первого сканирования, чтобы избежать конденсации на нижней стороне пластины.
- Программа расписание сканирования, используя программное обеспечение видео Микроскоп на одно изображение на хорошо. Для эксперимента вторжения миграции требуется максимальный интервал 2-h. Если Цель эксперимента для производства видео, интервал 30 мин Максимальная является предпочтительным.
- В конце эксперимента тщательно вымыть ранив устройства и следовать за каждый из четырех шагов Стиральная, указанных заводом-изготовителем.
3, 4 и 5 дней
-
Анализ миграции с помощью видео Микроскоп
- Минимум 24 h и до 5 дней мониторинг и Проверка миграции клеток.
- Используйте маску соответствующую ячейку, адаптированы для каждого типа клеток для анализа миграции клеток. Для получения клеток маска, адаптированы для каждой ячейки строки, генерировать обработки определения от программного обеспечения, используя коллекцию изображений определенных ячеек ячейки.
- Трассировки кривых и экспортируйте данные в электронную таблицу, которая может использоваться для анализа и сравнения результатов.
3. нуля раны пробирного: Вторжение ячейки
Примечание: Инструкции должны быть адаптированы для каждого типа клеток.
1 день
-
Заполнение ячеек
- Используйте тот же протокол для заполнения ячейки, как описано в шаге 2.1.
День 2
-
Подготовка ECM
- Размораживание матрица для по крайней мере 12 h перед использованием при 4 ° C. Убедитесь, что нет агрегатов являются видимыми. Если статистические выражения являются видимыми, держите матрица на 4 ° C для более длительного периода, до тех пор, пока агрегатов исчезают. Сохраните матрицу на льду. Использование охладить наконечники.
Примечание: Матрица будет закрепить, если не держал при 4 ° C. - Холод microcentrifuge трубы на льду на 5 мин.
- Возьмите см охлаждается до 4 ° C из холодильника и разбавленных матрицы в помощи microcentrifuge трубы для получения конечной концентрации 300 мкг/мл.
- Возвращение microcentrifuge трубки с разбавленной матрицы в холодильник на 4 ° C.
Примечание: Охлаждение стойки адаптированы для труб microcentrifuge полезен для поддержания трубы на 4° C на протяжении всего эксперимента.
- Размораживание матрица для по крайней мере 12 h перед использованием при 4 ° C. Убедитесь, что нет агрегатов являются видимыми. Если статистические выражения являются видимыми, держите матрица на 4 ° C для более длительного периода, до тех пор, пока агрегатов исчезают. Сохраните матрицу на льду. Использование охладить наконечники.
День 2
-
Assay скретч раны и лечение ECM
- Снять пластину, подготовленный на шаге 3.1 из инкубатора.
- Под капотом чтобы раны, с использованием коммерческих ранив устройства согласно протоколу производителя.
- Немедленно удалите средство из каждой хорошо с помощью пипетки с адаптированных конический наконечник, стараясь не коснуться рану.
- Вымыть клетки дважды, повторяя процедуру аспирации и используя 100 мкл см прогреты до 37 ° C.
- После второго мыть место пластину на 4 ° C инкубатор для сбалансировать ее температуры на 5 мин.
- Удалите средство холодной из каждой скважины с пипеткой аспирации с коническим наконечником, заботясь Пипетка тщательно от края и не прикасайтесь к ране.
- Добавьте 50 мкл разбавленной матрицы для каждой скважины с использованием помощи конической советы при 4 ° C.
- Место пластину в инкубаторе при 37 ° C за 30 мин.
Примечание: Подогретую поддержки стойку при 37 ° C целесообразно ускорить потепление 96-луночных пластины. - Снять пластину из инкубатора и добавить 100 мкл адаптированы см к каждой скважины, как указано для каждого условия лечения.
- Старайтесь избегать создания любые пузыри в скважинах. Реверс дозирование технику могут быть полезны здесь. Кроме того Удалите пузырьки с иглой шприца.
- Место пластину в адаптированных стойку в видео Микроскоп.
- Чтобы улучшить качество изображения, позволяют плита тепло для по крайней мере 15 минут до первого сканирования, чтобы избежать конденсации на нижней стороне пластины.
- Программа расписание сканирования, используя программное обеспечение видео Микроскоп на одно изображение на колодец, в режиме сканирования поцарапать раны. Максимальный интервал 2-h в необходимых для эксперимента вторжения миграции. Если Цель эксперимента для производства видео, интервал 30 мин Максимальная является предпочтительным.
- В конце эксперимента тщательно вымыть ранив устройства и следовать за каждый из четырех шагов Стиральная, указанных заводом-изготовителем.
3, 4 и 5 дней
-
Анализ вторжения клеток под микроскопом видео.
- Повторите шаг 2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы приводим здесь два различных метода для анализа клеток вторжения и миграции. Рисунок 1 показывает Бойден камеры эксперимента. Вставки помещаются в компаньоны плита с хемотаксического среднего, и клетки являются семенами в см. Мембрана может быть без покрытия (миграции проба) или с покрытием (вторжения проба). Клетки будут посеяны в верхней палаты в s см. Нижняя палата заполняется с см как хемотаксического. Клетки фиксируются до удвоения времени.
Рисунок 2 показывает Бойден мембраны после фиксации ячейки. Рисунок 2A показывает неоптимальный результат, кластеры клеток на верхней стороне мембраны. Рисунок 2B показывает оптимального результата с фиксированной и окрашенных в синий на мембране клеток.
Рисунок 3 показывает оптимальный результат анализа скретч рану. Линейный рану можно увидеть на рисунке 3A. Ячейки не наблюдаются в рану, и заживление ран происходит в течение 30 ч. Время, чтобы залечить раны зависит от линии клетки и колеблется от 24 до 50 ч.
Рисунок 3B является графическое представление заживления ран в четырех условий лечения: управления, ABT-199 (анти Bcl-2), cetuximab (анти EGFR) и авт-199 + cetuximab. АВТ-199 + cetuximab сочетание значительно сократилось миграции клеток. Кривые получаются с помощью программного обеспечения видео Микроскоп, который обеспечивает надежные данные анализа миграции клеток с течением времени. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD) для каждой скважины.
Девяносто процентов слияния является плотность оптимальный клеток для заживления ран assay. Заполнение оптимальное ячейки зависит от линии клетки и колеблется от 3 х 104 до 6 x 104 клетки. Рисунок 4A показывает плотность оптимальный клеток, и Рисунок 4 c показывает плотность низкая клеток. Скважины следует мыть дважды, чтобы избежать скоплений клеток, как показано на рисунке 4В.
Рисунок 1: Схематическое изображение камеры эксперимента Бойден. Вставки помещаются в компаньоны плита с хемотаксического среднего, и клетки являются семенами в см. Мембрана может быть без покрытия (A) или с покрытием (B).
Рисунок 2: неоптимальной и оптимального микроскопических результаты, полученные в эксперименте камеры Бойден. (A) субоптимальные мембраны с кластеры клеток на верхней стороне мембраны и нечитаемое результатов. Шкалы бар = 300 µm. (B) оптимальное мембраны с countable клетки в нижней части мембраны, окрашенных в синий. Шкалы бар = 300 мкм.
Рисунок 3: оптимальные результаты, полученные в эксперименте ранозаживляющим. (A) представитель изображение от нуля рану assay показано, заживление ран, наблюдается на 0, 15 и 30 h. Критерии качества эксперимента являются линейной рану, не фрагменты клеток наблюдается в рану и оптимальное ячейки слияния. Шкалы бар = 300 µm. (B) графическое представление заживление показаны количественной оценки параметров слияния клеток раны (в процентах) по времени (h). Здесь анализируются четыре условия лечения, а данные отображаются с SD.
Рисунок 4: субоптимальные результаты, полученные в эксперименте ранозаживляющим. (A) плотность ячеек. (B) проблемы мытья клетки Пелле. (C) плотность низкая клеток. Масштаб баров = 300 µm
| Преимущества | Недостатки | |
| Бойден палата эксперимент | -3D-Cell хемотаксис | -Времени |
| -Как вторжения, так и миграции с покрытием и без покрытия слоя матрица | -Низкая воспроизводимость | |
| -Дорогие вставок | ||
| -Отсутствие покадровой разведки | ||
| -Необходимость адэрентных клеток | ||
| Заживление ран Assay | -Автоматическая высокую воспроизводимость раны | -2D-клеточной подвижности |
| -Как вторжения, так и миграции с покрытием и без покрытия слоя матрица | -Необходимость адэрентных клеток | |
| -Клеточной пролиферации, включенных в анализ | ||
| -Покадровой микроскопических визуальный анализ | ||
| -Экспорт данных заживления раны метрик с точный анализ | ||
| -После лечения программное обеспечение для клеток миграции и вторжения кривых |
Таблица 1: преимущества и недостатки Бойден камеры эксперимента и видео Микроскоп-заживление пробирного. Преимущества и недостатки камеры Бойден экспериментировать и нуля рану пробирного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы приводим здесь два различных механизмов для изучения процесса вторжения и миграции клеток. Анализ этого процесса имеет важное значение для понимания факторов, участвующих в метастатических повторения, которые могут быть объяснены повышенной подвижности субпопуляции клеток рака называется Рак стволовых клеток10,11.
Бойден камеры эксперимента является одним наиболее часто используемые методы для изучения клеток вторжения и миграции. Одним из преимуществ такого подхода является его воспроизводимости, хотя этот метод очень сильно зависит от опыта экспериментатора. Подсчет ячеек вручную и может варьироваться от экспериментаторов. Многие важнейшие шаги необходимо стандартизировать и следует с осторожностью, например обеспечения использования надлежащих хемотаксического и голода среднего, специфичные для каждой ячейки строки. Удаление ячеек из верхней мембраны с ватным тампоном также имеет решающее значение для обеспечения оптимальных результатов и избежания субоптимальные результаты, показанные на рисунке 2A. Если этот assay используется для оценки подвижности клеток, вторжения и потенциала миграции посредством трехмерной (3D) пористые мембраны, это не позволяет отслеживать клетки через промежуток времени эксперимент. Кроме того коммерческие пластины пористые мембраны часто дорого.
Видео на базе микроскопа скретч рану assay, представленные здесь это надежный метод для оценки миграции клеток и вторжения. Производится с механическим заводом maker и обеспечивает воспроизводимое сравнение условий лечения. Видео микроскопический анализ может использоваться для создания точных количественных данных для исцеления и клеток слияния рану через промежуток времени эксперимент. Время от времени анализ условий различных лечения может быть подтвержден микроскопические наблюдения. Этот анализ интегрируется в assay пролиферации и учитывает время удвоения клеток. Видео или содержимое исходных данных могут быть экспортированы для получения высоко визуальное представление результатов, как показано в кривых миграции клеток на рисунке 3B.
Многие важнейшие шаги требуются для получения интерпретации результатов. Оптимальные условия для заполнения ячейки зависит от линии клетки и должны быть протестированы с различных разведениях получить 90% клеток слияния в скважинах. Чтобы получить линейную рану, ячейки покрытия не должна превышать 16 h. Стиральная шаг должно быть сделано быстро и дважды избежать введения мусора клеток в рану, которая может изменить результаты. Для вторжения скретч рану надлежащий уход ECM является также важным шагом. Скорости охлаждения должен быть постоянным, и ECM должны манипулировать с охлажденной наконечники и поддерживается на 4 ° C.
Эти методы имеют много преимуществ, которые кратко излагаются в таблице 1. Адэрентных клеток необходимы для этой техники. Царапин причины механических повреждений клеток, которая вызывает выпуск клеточного содержания в окружающей среде и может повлиять на процесс миграции. Assay скретч рану дает оценку моторики 2D ячейки, но не хемотаксис клеток, которые не могут быть изучены с помощью этой техники. Мы недавно разработали видео микроскопических хемотаксис пробирного, используя систему коммерческого покрытия. Этот assay нуждается клетки с высокой миграции способности, такие как рак стволовых клеток, как описано ранее12. Этот новый метод может стать золотым стандартом для анализов вторжения миграции в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эти методы были разработаны при поддержке LabEx PRIMES (АНР-11-LABX-0063), Contrat план-Etat-региона (CPER) в рамках научных ETOILE (CPER 2009-2013), и лиричные Грант инков-DGOS-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
