Summary
Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een eenvoudige cellulaire fractionering voor de subcellular scheiding van cytoplasmatische en nucleaire eiwitten in menselijke verse en diepgevroren intestinale biopsieën.
Abstract
Het doel van dit protocol is aan menselijke intestinale weefsels verkregen door endoscopie in nucleaire en cytoplasmatische compartimenten voor de analyse van de lokalisatie van specifieke proteïnen of eiwitcomplexen in verschillende weefsels Staten (dat wil zeggen, gezonde fractionate VS. ziekte). Deze methode is handig voor de versplintering van zowel verse en diepgevroren intestinale weefselsteekproeven; het is gemakkelijk toegankelijk voor alle laboratoria en niet tijdrovend.
Introduction
Eiwitten nemen in bijna alle biologische functies binnen een cel en elke wijziging in hun structuur, de hoeveelheid of de locatie kan leiden tot een pathogene scenario. Weefsel monster fractionering methoden zijn een nuttige benadering naar het verminderen van de complexiteit van ziekte gerelateerde eiwit analyses. Sommige studies gebruik eiwit lokalisatie-informatie of verrijken van een eiwit van een specifieke cellulaire compartiment, zodat een protocol voor reproduceerbare fractionering van intacte eiwitten is nuttig om bepaalde biologische vragen te beantwoorden. Bepalen de subcellular localisatie van eiwitten en het toezicht op hun compartimentaire herverdeling of interacties op basale en ziekten zal helpen bij het identificeren van ziekte gerelateerde functionele verschillen1,2. Dus, wil deze methode reproducibly fractionate intestinale weefsel biopsieën, zowel vers als diepgevroren, in cytoplasmatische en nucleaire subcellular compartimenten.
Intestinale biopsie monsters worden routinematig verkregen tijdens de endoscopie procedures3 (Figuur 1) en effectief kunnen worden gebruikt voor eiwit kwantificering of immunoprecipitation studies. Aangezien weefselmonsters van intestinale epitheliale eiwitten die rechtstreeks kunnen worden betrokken bij de ziekte pathogenese4 bevatten zal, zijn intestinale biopsie monsters een zeer waardevolle bron voor de succesvolle identificatie van intestinale ziekte-specifieke eiwitten. Opgeslagen bevroren, geduldige weefselsteekproeven samen met de klinische informatie zijn nuttige middelen voor eiwit analyse, en een eenvoudige en reproduceerbare monstervoorbereiding is een belangrijke kwestie te informeren cel compartimentaire behulp van beperkende bedragen van bevroren weefsel5.
Er zijn verschillende commercieel beschikbare kits voor de scheiding van cellulaire breuken, maar deze zijn duurder en over het algemeen meer tijd in beslag dan het protocol hier gepresenteerd. Protocollen op basis van meerdere stappen kleurovergang centrifugeren en continu verlopen ook al eerder hebt gebruikt voor de versplintering van diverse cellulaire compartimenten in verschillende weefsels en6,7. Onderhouden van de consistentie van continue verlopen is echter vaak een moeilijke taak. Soortgelijke protocollen op basis van de sequentiële lysis van membranen zijn eerder beschreven maar ze moeten over het algemeen meer dan twee buffers en de handen op tijd is langer8 .
Wanneer van weefselmonsters, niet vergeten dat weefsel monsters huidige cel-cel en cel-matrix interacties die zowel niet aanwezig in gekweekte cellen zijn en belangrijk wanneer u eiwit extractie. De juiste verdeling tussen cellen en extracellulaire matrix zonder de kwaliteit van de eiwitten te beïnvloeden zullen een cruciale factor in de intestinale weefsel eiwit isolatie9. In dit protocol zijn cel-cel en cel-matrix contacten eerst gebroken, het vrijgeven van de cellen en waardoor de buffer te bereiken van de afzonderlijke cellen. Om te voorkomen dat eiwit-vaks mengen vóór fractionering, moet de verdeling van de contactpersonen plaatsvinden zonder dat de integriteit van de cellen of de nucleaire membranen.
Door de verrijking van verschillende proteasen in de intestinale mucosa10is het belangrijk om te controleren de eiwit-afbraak tijdens extractie. Om te minimaliseren van de potentiële eiwit-afbraak, moet meerdere proteaseinhibitor worden opgenomen in de eiwit extractie buffers. Bovendien, als extracten worden gebruikt voor functionele testen gaat, is het essentieel om te voorkomen dat de denaturatie van eiwitten of proteolyse omdat dit leiden een verlies van eiwit activiteit11 tot zal. Voor dit doel, het protocol wordt uitgevoerd bij 4 ° C en verse phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) wordt toegevoegd aan de buffers op een eindconcentratie van 0.1 mM enkel voorafgaand aan het gebruiken om te remmen verder proteolyse.
De eerste stap in cel fractionering is verstoring van de weefsel en lysis van de cel. Zoals eerder vermeld, is het doel om het gedesag van de cellen en breken die ze met minimale schade open. Intestinale weefselsteekproeven moeten worden gehomogeniseerd en de cellen lysed om maximale breuk van de celmembraan. In dit protocol gebruiken we een gemotoriseerde stamper mixer te breken de intestinale weefsel dat is gehomogeniseerd binnen enkele seconden door middel van hoge snelheid vortexing actie. Na homogenisatie, weefselcellen geïncubeerd in een hypotone buffer die zal barsten het celmembraan, maar zal behouden de kernen, gevolgd door toevoeging van een niet-denaturering wasmiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) en een korte vortex te scheiden van de kernen uit de cytoplasmatische afvalfractie. Na de verwijdering van het cytoplasma, is de celmembraan van de kernen barstte in een hypertonic buffer met schudden.
De methode die hier gepresenteerd is een geschikte methode voor de subcellular fractionering van verse en diepgevroren intestinale biopsieën die zijn verkregen tijdens de Endoscopische procedures en bereik tussen 2 en 10 mg in gewicht. Het protocol is gemakkelijk en reproduceerbaar en kan worden uitgevoerd met behulp van elementaire laboratoriumapparatuur en reagentia in minder dan een uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Cruces Universiteit ziekenhuis Ethics Board en analyses werden uitgevoerd nadat toestemming is verkregen van alle onderwerpen of hun ouders.
1. biopsie collectie
Opmerking: Biopsie exemplaren van de distale twaalfvingerige darm van patiënten zijn verkregen tijdens routinematige diagnose endoscopie, biopten beheren dat bereik tussen 2 en 10 mg in gewicht. Biopsied weefsel is een complex weefsel dat bestaat uit verschillende soorten cellen met inbegrip van epitheliale, immuun en endotheliale cellen. Klinische gastroenterologen uitvoeren de endoscopie volgende klinische richtsnoeren opgesteld.
- Plaats de biopsie op een steriele filterpapier net na endoscopie.
- Pincet kunt door overdracht van de biopsieën in 1,5 mL buizen, geniet ze met PBS en leg deze in een cryotube.
- Houd buizen op ijs totdat ze in het laboratorium aankomen.
- Begonnen met de verwerking van verse biopsieën onmiddellijk.
- Voor bevroren biopsieën, flash bevriezen de biopsie met buizen en bewaren in vloeibare stikstof tot gebruik.
Opmerking: Het is belangrijk om te houden van het monster bevroren totdat de koude aangevuld buffer 1 wordt toegevoegd.
2. buffer voorbereiding
Opmerking: Voordat u begint, aanvulling van de buffers als volgt.
- Voeg 1 mM DTT (eindconcentratie) en protease en phosphatase remmer cocktail (1 x eindconcentratie) aan de hypotone buffer 1 en hypertonic buffer 2 (tabel 1).
- Bereiden van 1,5 mL buffer 1 en 150 µL van buffer 2 per monster. DTT zal het voorkomen van de oxidatie van de monsters.
- Bereiden kernen was buffer door 1% wasmiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) toe te voegen aan een definitieve concentratie van 0,1% aan de reeds aangevuld buffer 1. Bereiden 1 mL kernen was buffer per monster.
3. biopsie homogenisering
-
Verse biopten
- Plaats de wegwerp stamper in de gemotoriseerde mixer. Zorgen dat de stamper terechtkomt bij de onderkant van de buis.
- Neem de biopsie uit de cryotube en plaats deze in een 1,5 mL tube met een pipet tip.
- Voeg 200 µL van aangevuld buffer 1 aan de 1,5 mL-buis.
- Meng de biopsie met de stamper tot het weefsel wordt volledig verstoord en bewaar deze op ijs.
- Zodra alle de biopten worden gehomogeniseerd gaat u verder met stap 4.
Opmerking: Disposable pestles moeten worden gewijzigd tussen biopsieën.
-
Bevroren biopten
Let op: Voorzichtig vloeibare stikstof; contact van vloeibare stikstof met de huid of ogen kan ernstige schade kan bevriezen. Bescherm handen en ogen altijd bij het werken met vloeibare stikstof.- Neem sommige vloeibare stikstof in een doos voor het opslaan van de cryotubes ontvangen van de stikstof tank.
- De biopsie in de stikstof tank zoeken en plaatsen van de cryotube in het vak met de vloeibare stikstof. Herhaal deze stap voor alle de biopten.
- De biopsie van de cryotube tot een 1,5 mL koker overbrengen.
Opmerking: Biopsieën zal worden gehecht aan de bevroren buis. Duw de biopsie met een steriele Pipetteer tip dus het van de buis losmaken zal. - Voeg 200 µL van aangevuld buffer 1.
- Meng het weefsel met behulp van de stamper en vijzel, tot het weefsel is helemaal verstoord, de maximumtemperatuur bij 4 ° C gedurende al de procedure.
Opmerking: Laat geen biopsieën ontdooien voordat de buffer wordt toegevoegd.
4. cytoplasma isolatie
- Incubeer de gehomogeniseerde biopsie op ijs gedurende 10 minuten.
- 10 µL van 1% wasmiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) aan elk monster voor een eindconcentratie van 0,05% toevoegen.
Opmerking: Cellen zal zwellen en barsten door osmotische lysis zoals de mild schoonmaakmiddel de celmembraan verstoren zal. - Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
- Vortex kort en centrifugeer bij 400 x g bij 4 ˚C gedurende 2 min.
- Na vortexing, verwijder het supernatant en overbrengen naar een nieuwe schone 1,5 mL-buis; Dit zal de cytoplasmatische breuk. Gooi niet de pellet.
5. nucleaire isolatie
- Resuspendeer de pellet in de vorige stap met 200 µL van kernen was buffer.
- Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 400 x g- en 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en herhaal de procedure wassen twee meer tijden.
Opmerking: De wasbeurten verwijdert cytoplasmatische verontreiniging in de nucleaire Fractie. - Na de derde wash, resuspendeer de pellet in 100 µL van buffer 2.
- Goed schudden het monster op 4 ˚C voor 30 min. alternatief, Incubeer het monster op ijs en vortex elke 5 min.
- Na schudden, Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op topsnelheid (> 12.000 x g) en 4 ° C.
- Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe schone 1.5 na vortexing. mL-buis. Dit zal de nucleaire breuk.
6. eiwit kwantificering
Let op: De eiwitten met een bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit te kwantificeren. De concentratie van proteïnen toe in de fracties zullen variëren tussen de 0.5 en 5 µg/µL, lager in het nucleaire fractie (eiwit concentratie van 2 mg biopsieën resulterende Zie tabel 2 ).
- Voorbereiden van een standaard kromme met de volgende bedragen (µg) bovien serumalbumine (BSA)-12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- Voorbereiden van de reagentia die nodig zijn voor het gebruik van 100 µL van definitieve BCA mix per monster.
- Pipetteer 2 µL van elke eiwitoplossing in een 96 goed bord, voeg de BCA-mix en volg de instructies van de fabrikant voor de lezing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een Haematoxyline eosine-kleuring van een gedeelte van de intestinale biopsie met intact villi en crypte structuren.
Representatieve resultaten van nucleaire en cytoplasmatische fractionering met behulp van dit protocol worden weergegeven in de figuren 2 en 3. In het experiment wordt weergegeven in Figuur 2, een vers (Fh) en een bevroren (Fz) biopsie werden gelijktijdig gefractioneerde volgens het protocol hier gepresenteerd en een westelijke vlek werd uitgevoerd met behulp van 20 μg van elk monster. Eiwit concentraties in elke fractie en biopsie worden weergegeven in tabel 2, en de eiwit-concentraties zijn niet zeer verschillend tussen de vers en het bevroren weefsel. De opbrengst van eiwit geëxtraheerd uit de 2 mg biopsieën is rond 3-4 µg/µL in de cytoplasmatische breuk en ongeveer 1,5 µg/µL in de nucleaire Fractie. Om te controleren op de zuiverheid van de fracties, HSP90 en tubuline werden gebruikt als een cytoplasmatische besturingselementen en HDAC1 en H3 als een nucleaire besturingselementen13. Het kan worden waargenomen dat HSP90 en tubuline primaire gelegen in het cytoplasma zijn en HDAC1 en H3 bevinden zich in de kern met zeer minimale mengen tussen de twee breuken. Om te beoordelen of het protocol celdood beïnvloedt, wiste we ook voor de aanwezigheid van caspase-3. Uit Figuur 2presenteren beide monsters een zeer minimale kleuring voor het caspase-3 bevestigen dat de procedure heeft geen invloed op de cel dood pathway zelfs na flitser bevriezing van de biopten. Het was ook geanalyseerd als eiwit wijzigingen worden gehandhaafd na de ingreep, zodat eiwitten kunnen worden gebruikt voor downstream functionele testen. PhosphoSTAT1 werd gebruikt voor de kleuring zoals de bevroren biopsie gebruikt in deze fractionering kwam van een individu met een intestinale inflammatoire aandoening; Dit geldt niet voor de verse biopsie. Zoals verwacht, bevindt zich in het cytoplasma van de bevroren biopsie, waarin wordt bevestigd dat de eiwit-wijzigingen worden gehandhaafd na fractionering phosphoSTAT1.
De reproduceerbaarheid van de methode met behulp van bevroren biopsieën is afgebeeld in Figuur 3. Een westelijke vlek na fractionering van drie onafhankelijke bevroren biopsies werd uitgevoerd, en de breuken zijn schoon met minimale compartiment eiwit mengen (figuur 3A): HSP90 gelegen in de cytoplasmatische breuk en HDCA1 in de nucleaire breuk. Daarnaast werd ook het XPO1 eiwit dat aanwezig is in zowel nucleaire en cytoplasmatische breuken14 uitgewist. Het kan worden geconstateerd dat de niveaus van XPO1 gekwantificeerd door ImageJ stabiel in elke fractie (figuur 3B), bevestiging van de reproduceerbaarheid van de resultaten met behulp van verschillende biopsieën.
Figuur 1 : Lichte opname van een intestinale epitheliale sectie, gekleurd met Haematoxyline-eosine, uit een biopsie overgenomen door Endoscopische procedure. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Vertegenwoordiger westelijke vlek voor een subcellular fractionering uitgevoerd in een frisse (Fh) en een bevroren (Fz) biopsie. HSP90 en tubuline werden gebruikt als cytoplasmatische controles, HDAC1 en H3 als nucleaire besturingselementen. De aanwezigheid van CASP3 en phosphoSTAT3 werden ook beoordeeld.
Figuur 3 : Fractionering resultaten van drie onafhankelijke bevroren biopsieën. (A) vertegenwoordiger westelijke vlek voor een subcellular fractionering uitgevoerd in drie bevroren biopten (1, 2 en 3). HSP90 werd gebruikt als een cytoplasmatische controle- en HDAC1 als een nucleaire controle. De lokalisatie van XPO1, werden ook beoordeeld. (B) relatieve kwantificering van XPO1 in elk van de breuk gedaan ImageJ softwarematig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Buffer | Onderdelen | Notities |
| Hypotone buffer 1 | 10 mM HEPES pH 7,9 | 1,5 ml buffer/monster |
| 10 mM KCl | ||
| 0.1 nmM EDTA | ||
| Hypertonic buffer 2 | 20 mM HEPES pH 7,9 | 150 µl buffer/monster |
| 400 mM NaCl | ||
| 0.1 mM EDTA | ||
| * Opmerking: Buffers kunnen worden achtergelaten bij 4ºC voor een maand. | ||
| ** Opmerking: Buffers moeten worden aangevuld met proteïnase en phosphatase inhibitors en DTT vóór gebruik | ||
Tabel 1: Buffer samenstelling.
| Vers | Bevroren | |
| Cytoplasma | 2.975 | 4.612 |
| Nucleus | 1.516 | 1.385 |
Tabel 2: Eiwitconcentratie van elk van de fracties in een biopsie van de verse en diepgevroren 2 mg gebruikt in Figuur 2; concentratie wordt gepresenteerd in μg/μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven wordt gebruikt voor de nucleaire en cytoplasmatische fractionering van intestinale biopsieën. De gezuiverde eiwitten zijn niet gedenatureerd en kan worden gebruikt, niet alleen in westelijke vlekkenanalyse zoals weergegeven in Figuur 2 en 3 , maar ook in tests vereisen native-gevouwen eiwitten zoals immunoprecipitation, elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) of native polyacrylamide gelelektroforese (pagina).
De beschreven methode is afhankelijk van mechanische homogenisering van het weefsel samen met osmotische lysis te barsten van de celmembraan zonder het kernmembraan. Het resultaat is een schone fractionering van zowel de cytoplasmatische en nucleaire eiwitten worden gebruikt voor downstream analyses. Het is belangrijk om te controleren de afbraak van de eiwitten tijdens het proces door de toevoeging van eiwit en phosphatase inhibitors. Bovendien, als uitgepakte eiwitten die moeten worden gebruikt voor downstream functionele testen, is het ook belangrijk te voorkomen dat denaturatie- en proteolyse van de monsters. De processen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C en PMSF moet ook worden toegevoegd aan de buffers.
De in dit protocol omschreven procedure is eenvoudig en betaalbaar, en de verwerkingstijd van de steekproef is minimaal. Problemen zoals lange doorlooptijden en het gebruik van dure fractionering kits zijn geen beperkingen in dit protocol.
Verse en diepgevroren biopten kunnen zowel worden gebruikt in dit protocol, met bevroren biopsieën die heel schoon en reproduceerbare fractionering resultaten oplevert zoals te zien in Figuur 2 en 3. Als er besmetting van het compartiment, de tijd van de lysis van de cel kan worden verminderd om te voorkomen dat de release van nucleaire naar het cytoplasma en wassen stappen kan worden toegevoegd om cytoplasmatische verontreiniging in de nucleaire compartiment te voorkomen.
De mogelijkheid van het gebruik van bevroren weefsels voor de onafhankelijke analyse voor nucleaire en cytoplasmatische eiwitfracties kunt vergroten onze kennis over intestinale ontstekingsziekten waarin bevroren biopten worden opgeslagen. Bovendien, deze techniek kan worden aangepast aan andere soorten menselijke weefsels verkregen door biopsieën. Het volume van buffers gebruikt moet worden aangepast afhankelijk van de grootte van de biopsie.
Het protocol hier beschreven is ontworpen om tot reproduceerbare weefsel breuken; echter, sommige intrinsieke variabiliteit binnen het monster, met inbegrip van de grootte en de status van het weefsel kan leiden tot afwijkingen in de eiwit bedrag en distributie in elke fractie wordt beheerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Auteurs erkennen de hulp van Ander Lopez en Miren Telletxea voor video opnemen en bewerken. ACR is gefinancierd door een beurs Ikerbasque en een onderzoeksproject van de Asociación de Celiacos Madrid (ACM). RGI is gefinancierd door Project ISCIII-PI16/00258 en medegefinancierd door de Europese Unie EFRO/ESF "Een manier om Europa te maken". IS wordt gefinancierd door een projectsubsidie onderzoek 2015111068 van het Baskische ministerie van volksgezondheid. IRG en AJM worden ondersteund door predoctoraal fellowship subsidies uit de UPV/EHU en het Baskische ministerie van onderwijs, respectievelijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
