Summary
Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un frazionamento cellulare semplice per la separazione subcellulare delle proteine citoplasmatiche e nucleari in biopsie intestinali umane fresche e congelate.
Abstract
Lo scopo del presente protocollo è quello di frazionare il tessuto intestinale umano ottenuto dall'endoscopia in compartimenti nucleari e citoplasmatici per l'analisi di localizzazione di specifiche proteine o complessi proteici in stati differenti del tessuto (cioè, sano vs malattia). Questo metodo è utile per il frazionamento di entrambi i campioni freschi e congelati di tessuto intestinale; è facilmente accessibile per tutti i laboratori e non richiede molto tempo.
Introduction
Proteine partecipano a quasi tutte le funzioni biologiche all'interno di una cella e qualsiasi variazione nella loro struttura, la quantità o la posizione può portare a uno scenario di patogeno. Metodi di frazionamento dei campioni del tessuto sono un utile approccio per ridurre la complessità della malattia relative analisi di proteine. Alcuni studi utilizzano informazioni di localizzazione della proteina o arricchiscono una proteina da un compartimento cellulare specifico, quindi un protocollo per il frazionamento riproducibile di proteine intatte è utile per rispondere a taluni quesiti biologici. Determinare la localizzazione subcellulare delle proteine e monitoraggio loro ridistribuzione compartimentali o interazioni al basale e condizioni di malattia verranno aiuterà a identificare la malattia relative differenze funzionali1,2. Questo metodo intende quindi, riproducibile frazionare le biopsie del tessuto intestinale sia fresche che congelate, in compartimenti subcellulari citoplasmatici e nucleari.
I campioni di biopsia intestinale sono ordinariamente ottenuti durante l'endoscopia procedure3 (Figura 1) e possono essere efficacemente utilizzati per la quantificazione della proteina o studi di immunoprecipitazione. Dal momento che i campioni di tessuto da intestinale epiteliali conterrà le proteine che possono essere direttamente coinvolti in patogenesi malattia4, campioni di biopsia intestinale sono una fonte molto preziosa per l'identificazione di successo di specifica di malattia intestinale proteine. Campioni di tessuto congelato, paziente memorizzati insieme con le informazioni cliniche sono risorse utili per l'analisi della proteina, e una preparazione del campione semplice e riproducibile è una questione chiave per fornire informazioni compartimentali cella utilizzando quantità limitante di congelati tessuto5.
Ci sono diversi kit disponibile in commercio per la separazione di frazioni cellulari, ma questi sono più costosi e in genere richiede più tempo rispetto al protocollo presentato qui. Protocolli basati su centrifugazione in gradiente di più-passaggio e pendenze continue inoltre sono state usate in precedenza per il frazionamento dei diversi compartimenti cellulari in diversi tessuti6,7. Tuttavia, mantenendo la coerenza delle pendenze continue è spesso un compito difficile. Simili protocolli basati sulla sequenza lisi delle membrane precedentemente sono stati descritti, ma hanno bisogno generalmente più di due buffer e le mani sul tempo è più lungo di8 .
Quando i campioni di tessuto di frazionamento, tenete a mente che il tessuto campioni presenti cellula-cellula e cellula-matrice interazioni che sono presenti nelle cellule in coltura non sia importante quando si procede all'estrazione della proteina. La corretta ripartizione tra cellule e matrice extracellulare senza compromettere la qualità di proteina sarà un fattore critico nel tessuto intestinale della proteina isolamento9. In questo protocollo, contatti cellula-cellula e cellula-matrice in primo luogo sono rotti, liberando le cellule e permettendo che il buffer raggiungere le singole celle. Per evitare la proteina-vano di miscelazione prima del frazionamento, la ripartizione dei contatti deve avvenire senza alterare l'integrità delle membrane nucleari o le celle.
Dovuto l'arricchimento di varie proteasi nella mucosa intestinale10, è importante controllare la degradazione della proteina durante l'estrazione. Per ridurre al minimo il potenziale degradazione della proteina, più l'inibitore della proteasi deve essere incluso nei buffer di estrazione di proteine. Inoltre, se estratti stanno per essere utilizzati per analisi funzionali, è essenziale per evitare la denaturazione delle proteine o proteolisi ciò causerebbe una perdita di proteina attività11. Per questo scopo, il protocollo viene eseguito a 4 ° C e fluoruro di phenylmethylsulfonyl fresco (PMSF) viene aggiunto al buffer ad una concentrazione finale di 0,1 mM appena prima dell'uso per inibire ulteriore proteolisi.
Il primo passo nel frazionamento delle cellule è la rottura del tessuto e lisi cellulare. Come accennato in precedenza, l'obiettivo è quello di disaggregare le cellule e la rottura che li aperto con danni minimi. Campioni di tessuto intestinale devono essere omogeneizzati, e le cellule lisate per ottenere massima rottura della membrana cellulare. In questo protocollo, usiamo un mixer motorizzato pestello per rompere il tessuto intestinale che è omogeneizzato in pochi secondi mediante azione Vortex ad alta velocità. Dopo omogeneizzazione, cellule del tessuto vengono incubate in un buffer ipotonico che scoppierà la membrana delle cellule, ma manterrà i nuclei intatti, seguita dalla aggiunta di un detergente non-denaturante (nonil phenoxypolyethoxylethanol) e un breve vortice per separare i nuclei dalla frazione citoplasmatica. Dopo la rimozione del citoplasma, la membrana di nuclei delle cellule è scoppiò in un buffer ipertonico con agitazione.
Il metodo presentato qui è un metodo appropriato per il frazionamento subcellulare di biopsie intestinali freschi e congelati che sono stati ottenuti durante le procedure endoscopiche e intervallo tra 2 e 10 mg di peso. Il protocollo è semplice e riproducibile e può essere eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio di base e i reagenti in meno di un'ora.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal comitato di etica di Cruces University Hospital e analisi sono state eseguite dopo consenso informato è stato ottenuto da tutti gli oggetti o i loro genitori.
1. biopsia collezione
Nota: Gli esemplari di biopsia dal duodeno distale dei pazienti sono ottenuti durante l'endoscopia di diagnosi sistematica gestione biopsie comprese tra 2 e 10 mg di peso. Tessuto biopsiato è un tessuto complesso composto da diversi tipi cellulari tra cui cellule epiteliali, immuni ed endoteliali. I gastroenterologi clinici eseguire l'endoscopia segue stabilito linee guida cliniche.
- Posto la biopsia su una carta da filtro sterile subito dopo l'endoscopia.
- Utilizzare pinze per trasferire le biopsie in provette da 1,5 mL, metterli a bagno con PBS e posizionarlo in un stoccaggio provette criogenia.
- Mantenere i tubi sul ghiaccio fino ad arrivare al laboratorio.
- Avviare l'elaborazione delle biopsie fresche immediatamente.
- Per le biopsie congelate, flash congelare la biopsia contenente tubi e conservare in azoto liquido fino all'utilizzo.
Nota: È importante mantenere il campione congelato finché non viene aggiunto il buffer completato freddo 1.
2. preparazione buffer
Nota: Prima di iniziare, completare i buffer come segue.
- Aggiungere 1 millimetro DTT (concentrazione finale) e proteasi e fosfatasi inibitore cocktail (1x concentrazione finale) al buffer ipotonico ipertonico e 1 tampone 2 (tabella 1).
- Preparare 1,5 mL di tampone 1 e 150 µ l di tampone 2 per campione. DTT impedirà l'ossidazione dei campioni.
- Preparare il tampone di lavaggio nuclei aggiungendo 1% detergente (nonil phenoxypolyethoxylethanol) a una concentrazione finale di 0,1% al buffer già completati 1. Preparare 1 mL di tampone di lavaggio di nuclei per campione.
3. biopsia omogeneizzazione
-
Biopsie fresche
- Posto il pestello monouso nel mixer motorizzato. Assicurarsi che il pestello raggiunge il fondo del tubo.
- Estrarre la biopsia dallo stoccaggio provette criogenia e metterlo in una provetta da 1,5 mL con un puntale.
- Aggiungere 200 µ l di tampone completati 1 la provetta da 1,5 mL.
- Omogeneizzare la biopsia con il pestello fino a quando il tessuto è completamente sconvolta e tenerlo sul ghiaccio.
- Una volta che tutte le biopsie sono omogeneizzate procedere con il passaggio 4.
Nota: Pestelli monouso devono essere modificati tra le biopsie.
-
Biopsie congelate
Attenzione: Maneggiare azoto liquido; dell'azoto liquido con la pelle o gli occhi può provocare gravi lesioni di congelamento. Proteggere le mani e gli occhi sempre quando si lavora con l'azoto liquido.- Prendere alcuni azoto liquido in una scatola per conservare le provette per criogenia Estratto dal serbatoio di azoto.
- Trovare la biopsia nel serbatoio di azoto e posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA nella finestra con l'azoto liquido. Ripetere questo passaggio per tutte le biopsie.
- Trasferire la biopsia dallo stoccaggio provette criogenia per un tubo da 1,5 mL.
Nota: Le biopsie saranno allegate al tubo congelato. Spingere la biopsia con una pipetta sterile così staccherà dal tubo. - Aggiungere 200 µ l di tampone completati 1.
- Omogeneizzare il tessuto usando il mortaio e il pestello fino a quando il tessuto è completamente sconvolta, mantenendo la temperatura a 4 ° C durante tutta la procedura.
Nota: Non lasciare che le biopsie scongelare prima di aggiungere il buffer.
4. citoplasma isolamento
- Incubare la biopsia omogeneizzata in ghiaccio per 10 min.
- Aggiungere 10 µ l di 1% detergente (nonil phenoxypolyethoxylethanol) per ogni campione a una concentrazione finale di 0.05%.
Nota: Le cellule saranno gonfiarsi e scoppiare da lisi osmotica come il detergente delicato altererà la membrana cellulare. - Incubare in ghiaccio per 5 minuti.
- Vortex brevemente e centrifuga a 400 x g a 4 ° c per 2 min.
- Dopo Vortex, rimuovere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo pulito 1,5 mL; Questa sarà la frazione citoplasmatica. Non gettare il pellet.
5. isolamento nucleare
- Risospendere il pellet dal passaggio precedente con 200 µ l di tampone di lavaggio di nuclei.
- Centrifugare la provetta per 2 min a 400 x g e a 4 ° C.
- Scartare il surnatante e ripetere il lavaggio due volte.
Nota: I lavaggi rimuoverà citoplasmico contaminazione nella frazione nucleare. - Dopo il terzo lavaggio, risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di 2.
- Agitare il campione a 4 ˚ c per 30 min. in alternativa, incubare il campione sul ghiaccio e agitare ogni 5 min.
- Dopo l'agitazione, centrifugare il campione per 10 min alla massima velocità (> 12.000 x g) e 4 ° C.
- Dopo Vortex, trasferire il surnatante in un nuovo 1.5 pulito. tubo da mL. Si tratta della frazione nucleare.
6. proteina quantificazione
Nota: Quantificare le proteine con un kit di test bicinconinico proteina acida (BCA). La concentrazione delle proteine nelle frazioni sarà compreso tra 0,5 e 5 µ g / µ l, essendo più basso nella frazione nucleare (Vedi tabella 2 per le concentrazioni di proteina risultante dalle biopsie 2mg).
- Preparare una curva standard con i seguenti importi (µ g) di albumina di siero bovino (BSA)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- Preparare i reagenti necessari per utilizzare 100 µ l di mix finale BCA per campione.
- Pipettare 2 µ l di ciascuna frazione della proteina in un piatto ben 96, aggiungere il mix BCA e seguire le istruzioni del produttore per la lettura.
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Representative Results
La figura 1 Mostra un ematossilina eosina di una sezione di biopsia intestinale con villi intatti e strutture della cripta.
Risultati rappresentativi del frazionamento nucleare e citoplasmatica usando questo protocollo sono mostrati nelle figure 2 e 3. Nell'esperimento mostrato in Figura 2, un fresco (Fh) e un congelato (Fz) biopsia sono stati frazionati contemporaneamente seguendo il protocollo presentato qui e un western blot è stato effettuato usando 20 μg di ciascun campione. Le concentrazioni di proteina in ogni frazione e la biopsia sono riportate nella tabella 2, e le concentrazioni di proteine non sono molto diverse tra il fresco e il tessuto congelato. Il rendimento delle proteine estratte dalle biopsie di 2 mg è di circa 3-4 µ g / µ l la frazione citoplasmatica e circa 1,5 µ g / µ l nella frazione nucleare. Per verificare la purezza delle frazioni, HSP90 e tubulina sono stati usati come una citoplasmatica controlli e HDAC1 e H3 come un nucleare controlli13. Si può osservare che HSP90 e tubulina sono primari situato nel citoplasma e HDAC1 e H3 si trovano nel nucleo con miscelazione molto minimale tra le due frazioni. Per valutare se il protocollo riguarda la morte delle cellule, abbiamo cancellato anche per la presenza di caspase 3. Dalla Figura 2, entrambi i campioni presentano una colorazione molto minimale per la caspasi 3 conferma che la procedura non pregiudica la via di morte delle cellule anche dopo le biopsie di congelamento flash. È stato anche analizzato se le modifiche della proteina sono mantenute dopo la procedura, quindi proteine possono essere utilizzate per saggi funzionali a valle. PhosphoSTAT1 è stato utilizzato per la colorazione come la biopsia congelata utilizzata in questo frazionamento è venuto da un individuo con una malattia infiammatoria intestinale; Questo non è vero della biopsia fresca. Come previsto, phosphoSTAT1 si trova nel citoplasma della biopsia congelata, confermando che le modifiche della proteina sono mantenute dopo il frazionamento.
La riproducibilità del metodo utilizzando biopsie congelate è illustrata nella Figura 3. Un western blot è stato effettuato dopo il frazionamento dei tre indipendenti congelato le biopsie e le frazioni sono pulite con proteina minima vano miscelazione (Figura 3A): HSP90 situato nella frazione citoplasmatica e HDAC1 nella frazione nucleare. Inoltre, la proteina di XPO1 che è presente in entrambe le frazioni nucleari e citoplasmatici14 inoltre è stata cancellata. Si può osservare che i livelli di XPO1 quantificato di ImageJ sono stabili in ogni frazione (Figura 3B), confermando la riproducibilità dei risultati utilizzando diverse biopsie.
Figura 1 : Luce microfotografia di una sezione epiteliale intestinale, colorata con ematossilina eosina, da una biopsia acquisita dalla procedura endoscopica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rappresentante Western blot di un frazionamento subcellulare eseguita in una fresca (Fh) e una biopsia congelata (Fz). Hsp90 e tubulina sono stati utilizzati come controlli citoplasmici e HDAC1 e H3 come controlli nucleari. La presenza di CASP3 e phosphoSTAT3 inoltre sono stati valutati.
Figura 3 : Risultati di frazionamento di tre indipendenti congelato le biopsie. (A) rappresentante Western blot di un frazionamento subcellulare eseguita in tre biopsie congelate (1, 2 e 3). Hsp90 è stato utilizzato come controllo citoplasmico e HDAC1 come controllo nucleare. La localizzazione di XPO1 inoltre è stata valutata. (B) quantificazione relativa di XPO1 in ciascuna della frazione fatta utilizzando il software ImageJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer | Componenti | Note |
| Ipotonica buffer 1 | pH di 10 mM HEPES 7,9 | 1,5 ml di tampone/campione |
| 10 mM KCl | ||
| nmM 0,1 EDTA | ||
| Tampone di ipertonica 2 | pH di 20 mM HEPES 7,9 | 150 µ l di tampone/campione |
| 400 mM NaCl | ||
| 0,1 mM EDTA | ||
| * Nota: Buffer possono essere conservati a 4º c per un mese. | ||
| * * Nota: Buffer devono essere completati con gli inibitori di proteasi e fosfatasi e DTT prima dell'uso | ||
Tabella 1: Composizione di Buffer.
| Fresco | Congelati | |
| Citoplasma | 2,975 | 4,612 |
| Nucleo | 1.516 | 1,385 |
Tabella 2: Concentrazione nella proteina di ciascuna delle frazioni in una biopsia di freschi e congelati 2mg utilizzato in Figura 2; concentrazione è presentato in μg/μL.
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Discussion
Il protocollo descritto qui è usato per il frazionamento nucleare e citoplasmatico di biopsie intestinali. Le proteine purificate non sono denaturate e può essere utilizzate non solo nell'analisi di western blot come mostrato in Figura 2 e 3 , ma anche nelle analisi che richiedono nativo-piegato proteine quali immunoprecipitazione, analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA) o elettroforesi nativa del gel di poliacrilammide (PAGE).
Il metodo descritto si basa sulla meccanica omogeneizzazione del tessuto insieme a lisi osmotica per scoppiare la membrana cellulare senza influenzare la membrana nucleare. Il risultato è un pulito frazionamento delle proteine citoplasmatiche e nucleari da utilizzare per analisi successive. È importante per la degradazione delle proteine durante il processo di controllo con l'aggiunta di inibitori della fosfatasi e della proteina. Inoltre, se proteine estratte sono da utilizzarsi per saggi funzionali a valle, è anche importante evitare di denaturazione e proteolisi dei campioni. I processi devono essere eseguiti a 4 ° C e PMSF dovrebbe aggiungersi anche ai buffer.
La procedura descritta in questo protocollo è semplice e conveniente, e il tempo di elaborazione del campione è minimo. Problemi come lunghi tempi di elaborazione e l'uso di kit di frazionamento costose non sono vincoli in questo protocollo.
Fresche e surgelate biopsie possono essere utilizzate in questo protocollo, con biopsie congelate dando risultati di frazionamento abbastanza pulita e riproducibile come visto in Figura 2 e 3. Se c'è contaminazione del vano, il tempo di lisi delle cellule può essere ridotto per evitare la fuoriuscita del nucleare nel citoplasma e fasi di lavaggio possono essere aggiunto per evitare la contaminazione citoplasmico nel compartimento nucleare.
La possibilità di utilizzare tessuti congelati per l'analisi indipendente per le frazioni di proteine nucleari e citoplasmatici possa aumentare le nostre conoscenze sulle malattie infiammatorie intestinali, in cui sono archiviate le biopsie congelate. Inoltre, questa tecnica potrebbe essere adattata ad altri tipi di tessuti umani acquistati dalle biopsie. Il volume di buffer utilizzati dovrà essere modificato a seconda delle dimensioni della biopsia.
Il protocollo descritto qui è progettato per generare frazioni di tessuto riproducibile; Tuttavia, alcuni intrinseca variabilità all'interno del campione, tra cui le dimensioni e lo stato del tessuto può portare a deviazioni nella quantità di proteine e distribuzione gestita in ogni frazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Autori riconoscono l'assistenza di Ander Lopez e Miren Telletxea per la registrazione e l'editing dei video. ACR è finanziato da una borsa di studio Ikerbasque e un progetto di ricerca dal Asociación de Celiacos di Madrid (ACM). JRB è finanziato dal progetto ISCIII-PI16/00258 e co-finanziato dal FESR/FSE Unione europea "Un modo per fare dell'Europa". È è finanziata da una sovvenzione di progetto di ricerca 2015111068 del basco dipartimento della salute. IRG e AJM sono supportate da sussidi per la fellowship predoctoral da UPV/EHU e il basco Department of Education, rispettivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
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