Summary
여기, 우리는 인간의 신선 하 고 냉동 장 biopsies에 세포질 및 핵 단백질의 subcellular 분리에 대 한 간단한 세포 분별 법을 수행 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
이 프로토콜의 목적은 인간의 창 자 조직 특정 단백질 또는 다른 조직 (즉, 건강 한 상태에서 단백질 복합물의 지역화 분석에 대 한 핵 및 세포질 구획에 내 시경으로 얻은 충분치 대 질병)입니다. 이 메서드는 모두 신선 하 고 냉동 장 조직 샘플;의 분류 그것은 모든 실험실에 대 한 편리 하 고 시간이 소요입니다.
Introduction
단백질 세포 내의 거의 모든 생물 학적 기능에 참여 하 고 그들의 구조, 수량 또는 위치에 달라진 병원 성 시나리오를 발생할 수 있습니다. 조직 샘플 분류 메서드는 질병의 복잡성을 줄이기 위해 유용한 접근 관련 단백질 분석. 일부 연구 단백질 지역화 정보를 사용 하거나 특정 세포질 격실에서 단백질을 풍부 하 게 그대로 단백질의 재현 분별에 대 한 프로토콜은 특정 생물 학적 질문에 대답 하는 데 유용 합니다. 단백질의 subcellular 지 방화를 결정 하 고 그들의 compartmental 재배포 또는 기저에 상호 작용을 모니터링 질병 상태 질병을 식별 하는 데 도움이 됩니다 관련 기능 차이1,2. 따라서,이 방법은 reproducibly 장 조직 생 검, 두 신선 하 고 냉동, 세포질 및 핵 subcellular 구획으로 충분치를 목표로 합니다.
장 생 샘플 정기적으로 내 시경 절차3 (그림 1) 동안 얻은 고 단백질 정량화 또는 immunoprecipitation 연구에 효과적으로 사용할 수 있습니다. 이후 조직 샘플에서 장의 상피 질병 병 인4에 직접 관련 될 수 있습니다 단백질 포함 됩니다, 장 생 검 견본 장 질병 특정의 성공적인 식별에 대 한 매우 귀중 한 소스는 단백질입니다. 임상 정보와 함께 저장된 냉동, 환자의 조직 샘플 단백질 분석을 위한 유용한 리소스 이며 간단 하 고 재현성 샘플 준비의 제한 금액을 사용 하 여 셀 compartmental 정보를 제공 하는 중요 한 문제는 동결 조직5.
세포질 분수의 분리에 대 한 몇 가지 상용 키트 하지만 이들은 더 비싼 그리고 일반적으로 보다 더 많은 시간이 소요 여기에 제시 된 프로토콜. 여러 단계 그라데이션 원심 기반 프로토콜 및 지속적인 기온 변화도 또한 이전에 사용 된 다른 조직6,7에 다양 한 세포질 구획의 분류에 대 한 합니다. 그러나, 지속적인 기온 변화도의 일관성을 유지 하 종종 어려운 작업입니다. 세포 막의 순차적 용 해에 따라 비슷한 프로토콜 이전 설명 하지만 그들은 일반적으로 두 개 이상의 버퍼가 필요 이며 시간에 손을 더 이상8 .
조직 샘플을 위하여 때 명심 그 조직 샘플 존재-셀 및 셀-매트릭스 상호 작용 되는 둘 다 하지 경작된 한 세포에 중요 한 단백질 추출을 진행. 세포와 세포 외 기질 단백질 품질을 영향을 주지 않고 적절 한 고장 장 조직 단백질 격리9중요 한 요소 것입니다. 이 프로토콜에서-셀 및 셀-매트릭스 연락처가 먼저, 셀을 공개 하 고 개별 셀에 도달 하는 버퍼를 허용. 단백질 구획 분류 전에 혼합을 방지 하려면 연락처의 붕괴는 셀 이나 핵 막의 무결성을 변경 하지 않고 이루어져야 합니다.
10장 점 막 다양 한 프로 테아의 농축으로 추출 하는 동안 단백질 저하를 제어 하는 것이 중요입니다. 잠재적인 단백질 저하를 최소화 하기 위해 여러 프로 테아 제 억제 물 단백질 추출 버퍼에 포함 되어야 합니다. 또한, 추출 기능 분석에 사용 될 경우,이 단백질 활동11의 손실이 발생할 것 이다 단백질 또는 베이스의 변성을 피하기 위해 필수적입니다. 이 위해 프로토콜 4 ° C에서 수행 하 고 신선한 phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 그냥 더 베이스를 억제 하기 위해 사용 하기 전에 0.1 m m의 최종 농도에 버퍼에 추가 됩니다.
세포 분별 법의 첫 번째 단계 조직 장애 이며 세포 세포의 용 해. 앞에서 설명 했 듯이, 셀과 휴식 그들 최소 손상으로 열을 세분화 하는 목표가입니다. 장 조직 샘플을 균질 해야 합니다, 그리고 셀 lysed 세포 막의 최대 파손을 달성 하기 위해. 이 프로토콜을 사용 하 여 자동화 한 유 봉 믹서 고속 vortexing 작업에 의하여 초 이내 무 균 장 조직 휴식. 균질, 후 조직 세포는 세포 막 버스트 것 이다 하지만 것입니다 핵 그대로 유지, 비 변성 시키기 세제 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)와 핵을 분리 하는 짧은 소용돌이의 추가 의해 따라 소형 버퍼에서 incubated 세포질 분수. 세포질의 제거 후 세포 핵 막 떨고와 마 버퍼에 버스트입니다.
여기에 제시 된 방법은 내 시경 절차와 범위 2 및 10 mg에 무게 동안 얻은 신선 하 고 냉동 장 biopsies의 subcellular 분별에 대 한 적절 한 방법입니다. 프로토콜은 간단 하 고 재현성 고 기본적인 실험실 장비 및 한 시간에 시 약을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구는 Cruces 대학 병원 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 모든 과목 또는 그들의 부모 로부터 동의 가져온 후 분석 수행 했다.
1. 생 컬렉션
참고: 환자의 원심 십이지 장 생 검 표본 얻을 수 있습니다 일상적인 진단 내 시경 생 검 관리 동안 무게에 2, 10 밀리 그램 사이 범위. Biopsied 조직 상피, 면역과 내 피 세포를 포함 하 여 다른 세포 유형으로 구성 된 복잡 한 조직이 이다. 임상 소화기 전문 내과 내 시경을 수행 다음 임상 지침을 설립.
- 내 시경 후 생 검 살 균 필터 종이에 놓습니다.
- 집게를 사용 하 여을 1.5 mL 튜브에 biopsies 전송, PBS, 담가 cryotube로.
- 실험실에 도착할 때까지 얼음에 튜브를 유지.
- 즉시 신선한 biopsies의 처리를 시작 합니다.
- 냉동된 생 검, 플래시 동결 튜브를 포함 하는 생 검 및 사용까지 액체 질소에 저장.
참고: 그것은 차가운 보충된 버퍼 1 추가 될 때까지 냉동 샘플을 유지 하는 것이 중요입니다.
2. 버퍼 준비
참고: 시작 하기 전에, 보충 버퍼 다음과 같습니다.
- 1mm DTT (최종 농도)를 추가 하 고 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 (최종 농도 x 1) 1 및 고 침투성 버퍼를 버퍼 2 (표 1).
- 샘플 당 버퍼 2의 버퍼 1과 150 µ L의 1.5 mL를 준비 합니다. DTT는 샘플의 산화를 방지 합니다.
- 이미 보충된 버퍼 1 0.1%의 최종 농도를 1% 세제 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)를 추가 하 여 핵 워시 버퍼를 준비 합니다. 샘플 당 핵 워시 버퍼의 1 mL를 준비 합니다.
3. 생 검 균질
-
신선한 생 검
- 전동된 믹서에 일회용 유 봉을 배치 합니다. 유 봉 튜브의 아래쪽에 도달 하면 확인 하십시오.
- 생 검는 cryotube에서 고 피 펫 팁 1.5 mL 튜브에.
- 1.5 mL 튜브에 보충된 버퍼 1의 200 µ L를 추가 합니다.
- 조직을 완전히 중단 될 때까지 유 봉과 생 검을 균질 하 고 얼음에 그것을 유지.
- 일단 모든 biopsies 무 균 4 단계 진행.
참고: 일회용 pestles biopsies 사이 변경 되어야 합니다.
-
냉동된 생 검
주의: 처리 액체 질소 신중 하 게; 액체 질소는 피부와 눈의 접촉 냉동 중상이 발생할 수 있습니다. 액체 질소로 작업 하는 경우에 항상 손과 눈을 보호 합니다.- Cryotubes 질소 탱크에서 검색을 저장 하는 상자에서 몇 가지 액체 질소를 가져가 라.
- 질소 탱크에는 생을 찾아서는 cryotube 액체 질소와 함께 상자에 배치. 모든 생 검에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 1.5 mL 튜브에는 cryotube에서 생 검을 전송.
참고: Biopsies 냉동된 관에 연결할 것입니다. 튜브에서 분리 됩니다 그래서 살 균 피 펫 팁 생을 밀어. - 보충된 버퍼 1의 200 µ L를 추가 합니다.
- 조직을 완전히 중단 될 때까지 유 봉과 박격포를 사용 하 여, 모든 절차를 걸쳐 4 ° C에 온도 유지 하는 조직 균질
참고: 버퍼를 추가 하기 전에 녹여 biopsies 못하게 합니다.
4. 세포질 절연
- 10 분 동안 얼음에 무 균된 생 검 품 어.
- 각 샘플 0.05%의 최종 농도를 1% 세제 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)의 10 µ L를 추가 합니다.
참고: 셀 팽창 하 고 온화한 세제 세포 막 중단 됩니다으로 삼투성 세포에 의해 버스트 것 이다. - 5 분 동안 얼음에 품 어.
- 짧게 소용돌이 그리고 2 분 4 ˚C에서 400 x g에서 원심 분리기.
- Vortexing, 후에 상쾌한을 제거 하 고 새로운 깨끗 한 1.5 mL 튜브; 전송 이 세포질 분수 될 것입니다. 펠 릿을 버리지 마십시오.
5. 핵 절연
- 핵 워시 버퍼의 200 µ L와 이전 단계에서 펠 릿 resuspend
- G와 4 ° C x 400에서 2 분 동안 관을 원심
- 삭제는 상쾌한 고 두 번 더 세척 절차를 반복 합니다.
참고:은 세척 핵 분수에 세포질 오염을 제거 됩니다. - 3 세척 후 버퍼 2의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend.
- 흔들어 샘플 적극적으로 30 분에 대 한 4 ˚C에서 또는, 얼음과 소용돌이 매 5 분에 샘플을 품 어.
- 떨고, 후 원심 최고 속도로 10 분에 대 한 샘플 (> 12000 g x)와 4 ° C
- Vortexing, 후에 상쾌한 새로운 깨끗 한 1.5로 전송 합니다. mL 튜브입니다. 이 핵 분수 될 것입니다.
6. 단백질 정량화
참고: bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 키트 단백질 계량. 분수에 있는 단백질의 농도 0.5와 5 µ g / µ L, 핵 보다에서 더 낮은 것 사이 범위 것입니다 (2 밀리 그램 생 검에서 결과 단백질 농도 표 2 참조).
- 다음 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 금액 (µ g)12표준 곡선을 준비: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- 샘플 당 최종 BCA 믹스의 100 µ L를 사용 하는 데 필요한 시 약을 준비 합니다.
- 2 µ L 96 잘 접시에 각 단백질 분수의 플라스틱, BCA 믹스를 추가 하 고 독서에 대 한 제조업체의 지침을 따르십시오.
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Representative Results
그림 1 에서는 그대로 villi와 토 굴 구조는 장 생 섹션의 얼룩이 지는 hematoxylin 오신.
이 프로토콜을 사용 하 여 핵과 세포질 분별 법의 대표적인 결과 그림 2 와 3에 나와 있습니다. 신선한 (Fh), 냉동된 (Fz), 그림 2에 표시 된 실험에서 생 검 했다 동시에 분류 한 다음 여기에 제시 된 프로토콜 그리고 서쪽 오 점 각 샘플의 20 μ g를 사용 하 여 수행 되었다. 각 분수와 생 검에 단백질 농도 표 2에 표시 되 고 단백질 농도 매우 신선한 냉동된 조직 사이 다른. 2 mg biopsies에서 추출한 단백질의 수익률은 주위 3-4 µ g / µ L 세포질 분수에 핵 분수에서 µ 약 1.5 µ g/L. 분수의 순도 확인 하려면 HSP90 그리고 tubulin 세포질 컨트롤로 사용 되었다 HDAC1 및 핵 컨트롤13H3. 그것은 그 HSP90 그리고 tubulin 기본 세포질에 위치 하 고 있으며 HDAC1 및 H3 두 분수 사이 아주 최소한의 혼합과 핵에 있는 볼 수 있습니다. 위해 프로토콜에 영향을 미치는 세포 죽음, 우리는 또한 caspase 3의 존재에 대 한 얼룩이. 그림 2에서 두 샘플 제시 caspase 3 확인 절차 플래시는 biopsies 동결 후에 세포 죽음 통로 미치지 않습니다에 대 한 아주 최소한의 얼룩. 그것은 또한 단백질 다운스트림 기능 분석 실험을 위해 사용 될 수 있도록 단백질 수정 절차 후 유지 되는 경우를 분석 했다. PhosphoSTAT1 냉동된 생 검이이 분류에 사용 되는 창 자 염증 상태와 개인에서 온으로 얼룩을 위해 사용 되었다 이것은 신선한 생의 사실이 아니다. 예상 했던 대로, phosphoSTAT1는 단백질 수정 분류 후 유지 됩니다 확인 냉동된 생의 세포질에 위치 해 있습니다.
냉동된 biopsies을 사용 하 여 방법의 재현성은 그림 3에 표시 됩니다. 서쪽 오 점 냉동 생 검, 3 개의 독립의 분류 후 수행 하 고 분수는 최소한의 구획 단백질 혼합 (그림 3A)와 깨끗 한: HSP90 핵 분수에 세포질 분수와 HDCA1에 위치 하 고 있습니다. 또한, 두 핵과 세포질 분수14 에 XPO1 단백질은 또한 얼룩이. 그것은 XPO1 ImageJ로 계량의 레벨은 다른 생체 검사를 사용 하 여 결과의 재현성을 확인 (그림 3B), 각 분수에 안정적인 관찰할 수 있습니다.
그림 1 : 물에서 생 검 내 시경 절차에 의해 인수 되며 오신 장 상피 섹션의 가벼운 현미경 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 신선한 (Fh), 냉동된 (Fz) 생 검에 실시 하는 subcellular 분별의 대표 서쪽 오 점. HSP90와 tubulin 핵 컨트롤로 세포질 컨트롤 및 HDAC1 및 h 3로 사용 되었다. CASP3 및 phosphoSTAT3의 존재 또한 평가 됐다.
그림 3 : 3 개의 독립적인 biopsies 냉동의 분류 결과. (A) subcellular 분별의 대표 서쪽 오 점 수행 3 냉동된 생 검 (1, 2, 3). HSP90 핵 제어로 세포질 제어 및 HDAC1로 사용 되었다. XPO1의 지역화 평가 했다. (B)는 분수 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 수행의 각 XPO1의 상대 정량화 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 버퍼 | 구성 요소 | 노트 |
| 소형 버퍼 1 | 10 mM HEPES pH 7.9 | 1.5 ml 버퍼/샘플 |
| 10mm KCl | ||
| 0.1 nmM EDTA | ||
| 마 버퍼 2 | 20 mM HEPES pH 7.9 | 150 µ l 버퍼/샘플 |
| 400 mM NaCl | ||
| 0.1 mM EDTA | ||
| * 참고: 버퍼 저장할 수 있습니다 4ºC에 한 달 동안. | ||
| * * 참고: 버퍼는 사용 하기 전에 가수분해 및 인산 가수분해 효소 저 해제 및 DTT으로 보충 해야 | ||
표 1: 버퍼 구성입니다.
| 신선한 | 냉동 | |
| 세포질 | 2.975 | 4.612 |
| 핵 | 1.516 | 1.385 |
표 2: 그림 2;에 사용 되는 신선 하 고 냉동 2 mg 생 검에서 분수의 각각의 단백질 농도 농도 μ g/μ에 제공 됩니다.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 장 검의 핵과 세포질 분별 법에 사용 됩니다. 순화 된 단백질 변성 하지 하 고 그림 2 와 3 만 immunoprecipitation, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA) 같은 네이티브 접힌 단백질을 필요로 하는 분석 실험에 또한 같이 서쪽 오 점 분석에 사용 될 수 있다 또는 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 (페이지)
설명된 방법 삼 투 세포 세포 막 핵 막에 영향을 주지 않고 버스트 함께 조직의 기계적 균질에 의존 합니다. 다운스트림 분석에 사용할 세포질 및 핵 단백질의 깨끗 한 분별입니다. 그것은 단백질과 인산 가수분해 효소 억제제의 추가 의해 과정에서 단백질의 저하를 제어 해야 합니다. 또한, 추출 된 단백질 다운스트림 기능 분석에 사용 될 경우, 변성 및 샘플의 베이스를 피하기 위해 중요 하다 또한. 4 ° C에서 프로세스를 수행 해야 하 고 PMSF는 또한 버퍼에 추가 해야 합니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 절차는 간단 하 고 저렴 한, 그리고 샘플 처리 시간이 최소화 됩니다. 긴 처리 시간 및 비용이 많이 드는 분류 키트를 사용 하 여 같은 문제가이 프로토콜에 제약 되지 않습니다.
신선 하 고 냉동 biopsies 모두 사용할 수 있습니다이 프로토콜에 냉동된 biopsies 그림 2 와 3에서 보듯이 매우 깨끗 하 고 재현할 수 분류 결과 함께. 구획 오염 있는 경우에, 세포 세포의 용 해 시간을 세포질에 핵의 릴리스를 피하기 위해 감소 될 수 있다 고 핵 구획에 세포질 오염을 피하기 위하여 세척 단계를 추가할 수 있습니다.
냉동된 조직 핵과 세포질 단백질 분수에 대 한 독립적인 분석을 위한 사용의 가능성은 냉동된 biopsies 저장 된 장 염증 성 질병에 대 한 우리의 지식을 높일 수 있습니다. 또한,이 기술은 인간의 조직 생 검에 의해 취득의 다른 종류에 적용할 수 있습니다. 사용 하는 버퍼의 양은 생 검의 크기에 따라 수정 해야 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 재현할 수 조직 분수;를 생성 하도록 설계 되었습니다. 그러나, 샘플 내에서 몇 가지 본질적인 가변성, 크기 및 조직의 상태를 포함 하 여 단백질 양과 각 분수에서 관리 되는 배포에 편차가 발생할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 비디오 녹화 및 편집을 위한 Ander 로페즈와 Miren Telletxea의 도움을 인정 합니다. ACR는 Ikerbasque 친교와 Asociación 드 Celiacos 마드리드 (ACM)에서 연구 프로젝트에 의해 자금이 다. JRB은 프로젝트 ISCIII/PI16에 의해 00258와 공동 투자에 의해 유럽 연합 ERDF/ESF "유럽을 벌기 위해 방법" 이다. 연구 프로젝트 그랜트 2015111068 바스크 보건의에 의해 자금이 다. IRG 및 AJM 각각 UPV/EHU와 바스크어 교육부에서 predoctoral 친교 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
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