Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en enkel cellulära fraktionering för subcellulär separation av cytoplasmisk och nukleära proteiner i mänskliga färska och frysta intestinal biopsier.
Abstract
Syftet med detta protokoll är att fractionate mänskliga Tarmvävnaden erhålls genom endoskopi i kärn- och cytoplasmiska fack för lokalisering analys av specifika proteiner eller proteinkomplex i olika vävnad staterna (dvs, friska vs. sjukdom). Denna metod är användbar för fraktioneringen av både färska och frysta Tarmvävnaden prover; Det är lättillgängligt för alla laboratorier och inte tidskrävande.
Introduction
Proteiner delta i nästan alla biologiska funktioner i en cell och varje variation i sin struktur, kvantitet eller plats kan leda till ett patogena scenario. Vävnaden prov fraktionering metoder är en användbar strategi för att minska komplexiteten vid sjukdom med protein analyser. Vissa studier använda protein lokaliseringsinformation eller berika ett protein från en specifik mobilfack, så ett protokoll för reproducerbara fraktionering av intakta proteiner är användbart att besvara vissa biologiska frågor. Att bestämma subcellulär lokalisering av proteiner och övervaka deras compartmental omfördelning eller interaktioner på basal och sjukdomstillstånd hjälper dig identifiera sjukdom med funktionella skillnader1,2. Denna metod syftar således, till reproducibly fractionate intestinal vävnadsbiopsier, både färska och frysta, i cytoplasmiska och nukleära subcellulär fack.
Intestinal biopsiprover erhålls rutinmässigt under endoskopi förfaranden3 (figur 1) och kan användas effektivt för protein kvantifiering eller immunoprecipitation studier. Eftersom vävnadsprover från tarmens epitelceller kommer innehålla proteiner som kan vara direkt inblandade i patogenesen sjukdom4, är intestinal biopsiprover en mycket värdefull källa för framgångsrik identifiering av intestinal sjukdomsspecifika proteiner. Lagrade frysta, patientens vävnadsprover tillsammans med de kliniska uppgifterna är användbara resurser för proteinanalys, och en enkel och reproducerbara provberedning är en nyckelfråga att ge cellen Kategoriserad information med hjälp av begränsande mängder fryst vävnaden5.
Det finns flera kommersiellt tillgängliga kit för separation av cellulära fraktioner, men dessa är dyrare och allmänt mer tidskrävande än protokollet presenteras här. Protokoll baserat på flera steg gradient centrifugering och kontinuerlig lutningar har också tidigare använts för fraktioneringen av olika cellulära fack i olika vävnader6,7. Att upprätthålla konsekvens av kontinuerlig lutningar är dock ofta en svår uppgift. Liknande protokoll baserat på de sekventiella lys av membran har beskrivits tidigare men de generellt behöver mer än två buffertar och händerna på tid är längre8 .
När installera vävnadsprover, ha i åtanke att vävnadsinrättningarna prover nuvarande cell-cell och cell-matrix interaktioner som är både inte förekommer i odlade celler och viktigt när vidare till protein utvinning. Ordentlig fördelningen mellan celler och extracellular matris utan att påverka protein kvaliteten kommer att vara en kritisk faktor i Tarmvävnaden protein isolering9. I detta protokoll bryts cell-cell och cell-matrix kontakter först, släppa celler och låta bufferten att nå de enskilda cellerna. Undvik protein-fack blandning före fraktionering, måste fördelningen av kontakterna ske utan att förändra integriteten hos celler eller de kärn-membran.
På grund av berikning av olika proteaser i tarmslemhinnan10är det viktigt att kontrollera protein nedbrytningen under utvinning. För att minimera den potentiella proteinnedbrytning, måste flera proteashämmare inkluderas i protein utvinning buffertar. Dessutom om extrakt kommer att användas för funktionella analyser, är det viktigt att undvika denaturering av proteiner eller proteolys eftersom detta kommer att orsaka en förlust av protein aktivitet11. För detta ändamål, protokollet utförs vid 4 ° C och färska phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) läggs till buffertar med en slutlig koncentration på 0,1 mM precis före användning att ytterligare hämmar proteolys.
Det första steget i cell fraktionering är vävnad störningar och cellys. Som tidigare nämnts, är syftet att dela upp celler och bryta dem öppna med minimal skada. Intestinal vävnadsprover måste homogeniseras och cellerna lyserat för att uppnå maximal brott på cellmembranet. I detta protokoll använder vi en motoriserad mortelstöt mixer för att bryta den Tarmvävnaden som är homogeniserad inom sekunder genom hög hastighet vortexa åtgärder. Efter homogenisering inkuberas vävnadsceller i en hypoton buffert som kommer att brista cellmembranet men kommer att hålla atomkärnor intakt, följt av tillägg av ett icke-denatureringen rengöringsmedel (nonylfenol phenoxypolyethoxylethanol) och en kort vortex till separata kärnor från den cytoplasmiska fraktionen. Efter avlägsnande av cytoplasman, är kärnor cellmembranet brast i en hyperton buffert med skakade.
Presenteras här är en lämplig metod för den subcellulär fraktioneringen av färska och frysta intestinal biopsier som har erhållits under endoskopisk förfaranden och intervallet mellan 2 och 10 mg i vikt. Protokollet är lätt och reproducerbara och kunde utföras med grundläggande laboratorieutrustning och reagenser i under en timme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie har godkänts av etikprövningsnämnd Cruces University Hospital och analyser utfördes efter informerat samtycke erhållits från alla ämnen eller deras föräldrar.
1. biopsi samling
Obs: Biopsi prover från distala tolvfingertarmen patienter erhålls under rutinmässiga diagnos endoskopi hantera biopsier intervallet mellan 2 och 10 mg i vikt. Biopsier vävnad är en komplex vävnad som består av olika celltyper inklusive epitelial, immun och endotelceller. Kliniska gastroenterologer utföra endoskopi efter etablerad kliniska riktlinjer.
- Placera biopsi på en steril filterpapper strax efter endoskopi.
- Använd tången för att överföra biopsier i 1,5 mL rör, blöta dem med PBS och placera det i en cryotube.
- Förvara rören på is tills de anländer till laboratoriet.
- Börja bearbeta av färska biopsier omedelbart.
- För frusna biopsier, flash frysa biopsi som innehåller rör och förvaras i flytande kväve fram till användning.
Obs: Det är viktigt att hålla provet fryst tills kallt kompletterade bufferten 1 läggs.
2. buffert förberedelse
Obs: Innan du börjar, komplettera buffertar som följer.
- Lägg till 1 mM DTT (koncentration) och proteashämmare och fosfatas hämmare cocktail (1 x slutlig koncentration) till hypoton bufferten 1 och hyperton buffert 2 (tabell 1).
- Förbereda 1,5 mL buffert 1 och 150 µL buffert 2 per prov. DTT förhindrar oxidation av proverna.
- Förbereda atomkärnor tvättbuffert genom att lägga till 1% tvättmedel (nonylfenol phenoxypolyethoxylethanol) till en slutlig koncentration på 0,1% till redan kompletterat bufferten 1. Laga 1 mL av atomkärnor tvättbuffert per prov.
3. biopsi homogenisering
-
Färsk biopsier
- Placera den disponibla mortelstöten i motoriserad mixern. Se till att mortelstöten når botten av röret.
- Ta biopsi ut från cryotube och placera den i ett 1,5 mL rör med en pipettspetsen.
- Tillsätt 200 µL av kompletterade buffert 1 till 1,5 mL röret.
- Homogenisera biopsi med mortelstöten tills vävnaden är helt störd och hålla det på is.
- När alla biopsier är homogeniserad fortsätta med steg 4.
Obs: Disponibla mortlar måste ändras mellan biopsier.
-
Fryst biopsier
FÖRSIKTIGHET: Hantera flytande kväve varsamt; kontakt med flytande kväve med hud- eller ögonkontakt kan orsaka allvarliga frysning skador. Skydda händer och ögon alltid när du arbetar med flytande kväve.- Ta några flytande kväve i en ruta för att lagra den frysrör Hämtad från kväve tanken.
- Hitta biopsi i kväve tanken och placera cryotube i rutan med den flytande kvävgasen. Upprepa detta för alla biopsier.
- Överföra biopsi från cryotube till en 1,5 mL tub.
Obs: Biopsier kopplas till frysta röret. Tryck biopsi med en steril pipettspetsen så det kommer loss från röret. - Tillsätt 200 µL av kompletterade buffert 1.
- Homogenisera vävnaderna med hjälp av mortel och mortel, tills vävnaden är helt störd, hålla rätt temperatur på 4 ° C under hela alla förfarandet.
Obs: Låt inte biopsier Tina innan du lägger till bufferten.
4. cytoplasman isolering
- Inkubera homogeniserad biopsi på is i 10 min.
- Tillsätt 10 µL av 1% tvättmedel (nonylfenol phenoxypolyethoxylethanol) till varje prov till en slutlig koncentration på 0,05%.
Obs: Celler kommer att svälla och sprack av osmotisk Lys som det milt rengöringsmedlet kommer att störa cellmembranet. - Inkubera på is i 5 minuter.
- Vortex kort och centrifugera vid 400 x g vid 4 ° c under 2 minuter.
- Efter vortexa, avlägsna supernatanten och överföra den till en ny ren 1,5 mL tub; Detta kommer att vara den cytoplasmiska fraktionen. Kasta inte pelleten.
5. nuclear isolering
- Återsuspendera pelleten från föregående steg med 200 µL av atomkärnor tvättbuffert.
- Centrifugera röret för 2 min vid 400 x g och 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och upprepa förfarandet tvätt två gånger.
Obs: Tvättarna kommer bort cytoplasmiska kontaminering i kärn-fraktionen. - Efter den tredje tvätten, återsuspendera pelleten i 100 µL buffert 2.
- Skaka provet kraftigt vid 4 ˚C för 30 min. Alternativt, inkubera provet på is och vortex var 5 minut.
- Efter omskakning, Centrifugera provet för 10 min vid toppfart (> 12 000 x g) och 4 ° C.
- Efter vortexa, över supernatanten till en ny ren 1,5. mL tub. Detta kommer att vara den nukleära fraktionen.
6. protein kvantifiering
Obs: Kvantifiera proteinerna med en bicinchoninic syra (BCA) protein assay kit. Koncentrationen av proteiner i fraktioner kommer att variera mellan 0,5 och 5 µg/µL, lägre i nukleära fraktionen (se tabell 2 för protein koncentrationer resulterande från 2 mg biopsier).
- Förbereda en standardkurva med följande bovint serumalbumin (BSA) belopp (µg)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- Förbereda de reagens som behövs för att använda 100 µL av slutliga BCA mix per prov.
- Pipettera 2 µL av varje proteinfraktion i en 96 väl tallrik, Lägg till BCA mixen och följa tillverkarens instruktioner för behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en hematoxylin eosin färgning av intestinal biopsi tvärsnitt med intakt villi och crypt strukturer.
Representativa resultat av kärn- och cytoplasmiska fraktionering som använder detta protokoll visas i figurerna 2 och 3. I experimentet visas i figur 2, en fräsch (Fh) och en fryst (Fz) biopsi var samtidigt fractionated efter protokollet presenteras här och en western blot utfördes med hjälp av 20 μg av varje prov. Protein koncentrationer i varje fraktion och biopsi visas i tabell 2, och protein koncentrationerna skiljer sig inte mycket mellan färska och frysta vävnad. Utbytet av protein som utvinns ur de 2 mg biopsier är runt 3-4 µg/µL i den cytoplasmiska fraktionen och cirka 1,5 µg/µL i kärn-fraktionen. För att kontrollera renheten av fraktioner, HSP90 och tubulin användes som en cytoplasmiska kontroller och HDAC1 och H3 som en nukleär kontroller13. Det kan påpekas att HSP90 och tubulin är primära belägna i cytoplasman och HDAC1 och H3 ligger i kärnan med mycket minimal blandning mellan de två fraktionerna. För att bedöma om protokollet påverkar celldöd, utplånas vi också förekomsten av kaspas 3. Från figur 2presenterar båda exemplaren en mycket minimal färgning för kaspas 3 bekräftar att förfarandet inte påverkar den cell death vägen även efter flash frysa biopsier. Det var också analyserat om protein ändringar underhålls efter ingreppet, så proteiner kan användas för nedströms funktionella analyser. PhosphoSTAT1 användes för färgning som frysta biopsi används i denna fraktionering kom från en person med en tarm inflammatorisk sjukdom; Detta gäller inte färsk biopsi. Som väntat ligger phosphoSTAT1 i cytoplasman i frysta biopsi, bekräftar att ändringarna som protein bibehålls efter fraktionering.
Reproducerbarheten av metoden använder djupfrysta biopsier visas i figur 3. En western blot utfördes efter fraktionering av tre oberoende fryst biopsier och fraktioner är rena med minimal fack protein blandning (figur 3A): HSP90 ligger i cytoplasmiska fraktionen och HDCA1 i kärn-fraktionen. Dessutom var det XPO1 protein som finns i både kärnkraft och cytoplasmiska fraktioner14 också utplånas. Det kan noteras att nivåerna av XPO1 kvantifieras i ImageJ är stabila i respektive fraktion (figur 3B), bekräftar reproducerbarheten för resultaten med hjälp av olika biopsier.
Figur 1 : Ljus Mikrograf av intestinal epitelial tvärsnitt, färgas med hematoxylin eosin, från en biopsi som förvärvats genom endoskopisk förfarande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representant Western blot av en subcellulär fraktionering utföras i en fräsch (Fh) och en fryst (Fz) biopsi. HSP90 och tubulin användes som cytoplasmiska kontroller och HDAC1 och H3 som nukleära kontroller. Förekomsten av CASP3 och phosphoSTAT3 bedömdes också.
Figur 3 : Fraktionering resultaten av tre oberoende fryst biopsier. (A) representant Western blot av en subcellulär fraktionering utföras i tre frysta biopsier (1, 2 och 3). HSP90 användes som cytoplasmiska kontroll och HDAC1 som en nukleär kontroll. Lokalisering av XPO1 utvärderades också. (B) relativ kvantifiering av XPO1 i varje i det bråk som gjort med ImageJ programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert | Komponenter | Anteckningar |
| Hypoton buffert 1 | 10 mM HEPES pH 7,9 | 1,5 ml buffert/sample |
| 10 mM KCl | ||
| 0,1 nmM EDTA | ||
| Hyperton buffert 2 | 20 mM HEPES pH 7,9 | 150 µl buffert/sample |
| 400 mM NaCl | ||
| 0,1 mM EDTA | ||
| * Obs: Buffertar kan förvaras vid 4ºC för en månad. | ||
| ** Obs: Buffertar måste kompletteras med proteinas och fosfatas hämmare och DTT före användning | ||
Tabell 1: Buffert sammansättning.
| Färsk | Fryst | |
| Cytoplasman | 2.975 | 4.612 |
| Nucleus | 1.516 | 1,385 |
Tabell 2: Proteinkoncentration av varje av fraktionerna i en färsk och fryst 2 mg biopsi används i figur 2. koncentration presenteras i μg/μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollet som beskrivs här används för den nukleära och cytoplasmiska fraktioneringen av intestinal biopsier. De renade proteinerna är inte denatureras och kan användas inte bara i western blot analys som visas i figur 2 och 3 men också i analyser som kräver native-viks proteiner såsom immunoprecipitation, elektroforetiska mobilitet Skift assay (EMSA) eller infödda polyakrylamid gelelektrofores (sidan).
Den beskrivna metoden är beroende av mekaniska homogenisering av vävnad tillsammans med osmotisk Lys att brista cellmembranet utan att påverka det nukleära membranet. Resultatet är en ren fraktionering av båda cytoplasmiska och nukleära proteiner som ska användas för efterföljande analyser. Det är viktigt att styra nedbrytningen av proteiner under processen genom tillsats av protein och fosfatas-hämmare. Dessutom om extraherade proteiner skall användas för nedströms funktionella analyser, är det också viktigt att undvika denaturering och proteolys av proverna. Processerna bör utföras vid 4 ° C och PMSF bör också läggas till buffertar.
Det förfarande som beskrivs i detta protokoll är enkel och prisvärd och behandlingstiden i provet är minimal. Problem såsom långa handläggningstider och användningen av kostsamma fraktionering kit är inte begränsningarna i detta protokoll.
Färska och frysta biopsier kan både användas i detta protokoll, med frysta biopsier ger ganska ren och reproducerbara fraktionering resultat som kan ses i figur 2 och 3. Om det finns fack nedsmittning, cell lysis tiden kan minskas för att undvika frisläppandet av kärnkraft till cytoplasman och tvätta stegen kan läggas för att undvika cytoplasmiska kontaminering i den nukleära facket.
Möjligheten att använda frysta vävnader för oberoende analys för kärn- och cytoplasma protein fraktioner kan öka vår kunskap om inflammatoriska tarmsjukdomar som frysta biopsier är lagrade. Dessutom skulle denna teknik kunna anpassas till andra typer av mänskliga vävnader förvärvats av biopsier. Volymen av buffertar används måste ändras beroende på storleken på biopsin.
Protokollet beskrivs här är utformade för att generera reproducerbara vävnad fraktioner; dock vissa inneboende variabilitet inom provet, inklusive storlek och status av vävnad kan leda till avvikelser i protein mängden och distribution hanteras i respektive fraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner stöd av Ander Lopez och Miren Telletxea för video inspelning och redigering. ACR är finansierat av en Ikerbasque gemenskap och ett forskningsprojekt från Asociación de Celiacos Madrid (ACM). JRB är finansierade av projektet ISCIII-PI16/00258 och medfinansieras av Europeiska unionen ERUF/ESF ”ett sätt att göra Europa”. ÄR finansieras av projektet forskningsbidrag 2015111068 av baskiska Department of Health. IRG och AJM stöds av pre fellowship bidrag från den UPV/EHU och baskiska utbildningsdepartementet, respektive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
