Summary
Wij rapporteren methoden voor karakterisering van MLKL-gemedieerde plasmamembraan breuk in necroptosis met inbegrip van conventionele en confocal microscopie van live-cel imaging, scanning elektronen microscopie, en NMR gebaseerde lipide bindend.
Abstract
Necroptosis is een geprogrammeerde cel dood traject geactiveerd door activering van receptor interactie proteïne kinase 3 (RIPK3), die kinaseenzym en activeert de gemengde afkomst kinase-achtige domein pseudokinase, MLKL, scheuren of permeabilize van het plasma-membraan . Necroptosis is een inflammatoire traject gekoppeld aan meerdere aandoeningen waaronder autoimmuniteit, infectieziekten en cardiovasculaire ziekten, beroerte, neurodegeneratie en kanker. Hier beschrijven we protocollen die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van MLKL als de beul van plasmamembraan breuk in necroptosis. Wij visualiseren van het proces van necroptosis in cellen met behulp van live-cel beeldbewerking met fluorescentie van conventionele en confocal microscopie en in vaste cellen met behulp van elektronenmicroscopie, die samen de herverdeling van de MLKL van het cytosol aan het plasma geopenbaard membraan voor inductie van grote gaten in het plasma-membraan. We presenteren in vitro nucleaire magnetische resonantie (NMR) analyse met behulp van lipiden te identificeren van vermeende modulatoren van MLKL-gemedieerde necroptosis. Op basis van deze methode, wij kwantitatieve lipide-bindende voorkeuren en fosfatidyl-inositol fosfaten (pitten) aangewezen als kritische bindmiddelen van MLKL die nodig voor het plasmamembraan targeting en permeabilization in necroptosis zijn.
Introduction
Identificeren van genetische componenten van necroptosis heeft vergemakkelijkt het gebruik van dierlijke modellen voor het testen van de implicaties van necroptosis in fysiologie en ziekte1,2,3,4,5. Knock-out van RIPK3 of MLKL in muizen had minimale implicatie in ontwikkeling en volwassene homeostase suggereert dat necroptosis is niet essentieel voor leven3,6. Sommige soorten bevatten bovendien geen RIPK3 of MLKL genen, ter ondersteuning van de niet-essentiële rol van necroptosis in dieren7,8. Aan de andere kant, is knock-out diermodellen uitdagend met diverse ziektebeelden geïnduceerd in het laboratorium gebleken dat een belangrijke rol van necroptosis in de ontsteking, aangeboren immuniteit en virale infectie9,10, 11 , 12.
Necroptosis kan op verschillende manieren worden geactiveerd door signalering door middel van verschillende aangeboren immuniteit sensoren, al die resulteren in de activering van RIPK31,13,14. Actieve RIPK3 op zijn beurt kinaseenzym en activeert MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. De meest bestudeerde en wellicht de meest complexe manier, die leiden tot activering van RIPK3 gaat dood receptor afbinding, die bifurcates op basis van de stroomafwaartse samenstelling van de signalering complexen ofwel ertoe apoptosis of necroptosis1. Necroptosis ontstaat wanneer signalering via RIPK1 is favoriet en in de betrokkenheid van RIPK319,20 resulteert. Dit resultaat is gemakkelijk favoriet bij farmacologische remming of genetische schrapping van caspase 8, een vermeende endogene inhibitor van necroptosis die houdt van necroptosis in het bay. RIPK1 bindt aan en RIPK3 activeert. Een andere manier om te activeren necroptosis is door middel van Toll-like receptoren TLR3/TLR4 signalering, die zich bezighoudt en activeert RIPK3 via TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF)21. Nog is een andere manier om te sterven door necroptosis door activering van de DNA-sensor DAI, die direct bezighoudt en activeert RIPK322.
MLKL is een cytosolische eiwit bestaat uit een N-terminal helix bundel (NB)-domein en een C-terminal pseudokinase domein (psKD) door een regelgevende brace regio3met elkaar verbonden. In normale cellen, MLKL gevonden in het cytosol waar het wordt beschouwd als in een inactieve complex met RIPK314. Activering van necroptosis activeert fosforylering van de RIPK3 van MLKL in de lus van de activering van de psKD, en potentieel extra sites in de NB en brace3,15,23. Fosforylering induceert een conformationele verandering in MLKL waardoor de dissociatie van RIPK314. Slecht begrepen conformationele wijzigingen laat de brace uit de psKD24. De brace, die 2 helices bevat, bemiddelt oligomerisatie van MLKL in een vermeende trimeer via de C-terminal helix25. De helix van de N-terminal van de brace remt het domein NB, hetgeen essentieel om membraan permeabilization24,26 is. In isolatie is NB domein voldoende voor het opwekken van plasmamembraan permeabilization en necroptosis16,24,27. De activiteit van de pro-necroptotic voor NB was gereconstitueerd in muis embryonale fibroblasten tekort aan MLKL (mlkl- / - MEFs). NB is een lipide-bindend domein dat netcongestieproblemen de fosfolipide phosphatidylinositol 4,5 (III) difosfaat (PIP2 bezighoudt). Wij hebben voorgesteld een stapsgewijze mechanisme van activering van MLKL, waarin de brace oligomerisatie aanwerving van MLKL naar het plasmamembraan via zwakke interacties voor NB met de PIP2 polar hoofd groep24vergemakkelijkt. Op het membraan ondergaat de NB gereglementeerde blootstelling van een extra hoge-affiniteit bindende site voor PIP2, waarin wordt gemaskeerd door de brace in inactieve MLKL. Over het geheel genomen destabiliseren de meerdere interacties van NB met PIP2 het plasmamembraan leidt tot haar breuk, hoewel het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenissen hebben niet is opgehelderd.
We illustreren hier specifieke methoden gebruikt voor het karakteriseren van de functie van MLKL als beul van necroptosis24. In het bijzonder richten we ons op de meest minimale domein van MLKL, de NB en brace (NBB), die wordt gereguleerd door remming van de brace en kan worden geactiveerd door middel van gedwongen dimerisatie ertoe plasmamembraan breuk en necroptosis. Wij beschrijven onze afleidbare expressie systeem gecombineerd met gedwongen drug-geïnduceerde FKBP-gemedieerde dimerisatie voor live-cel beeldvorming, en elektronenmicroscopie van cellen necroptosis ondergaan. Bovendien, illustreren we onze in vitro NMR-analyse van de interacties van de NBB met phosphatidylinositols (pitten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klonen en cel lijn generatie
- PCR versterken de NBB-regio, overeenkomt met aminozuurresidu's 1-140 (NBB140), van menselijke MLKL cDNA voor frame standaard restrictie-enzym-gebaseerde klonen met de oligomerisatie-x FK506 domein 2 als bindend-proteïne (2xFKBP of 2xFV) en Venus TL eiwit in de Doxycycline (Dox) - afleidbare retrovirale vector pRetroX-TRE3G te verkrijgen van de NBB140- 2xFV-Venus (tabel 1, figuren 1A-B).
- Vereeuwigen van primaire mlkl- /- of ripk3- / - mlkl- / - muis embryonale fibroblasten (MEFs) de respectieve muizen die beschikbaar zijn in het groene laboratorium verkregen door voorbijgaande transfectie met SV40-grote antigeen plasmide uitdrukken. Selecteer vereeuwigd cellen in ~ 1-2 weken, en onderhouden in DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine 100 U/mL penicilline en streptomycine, 1 mM natrium pyruvaat en niet-essentiële aminozuren op 37 ° C en 5% CO2 in standaard weefsel cultuur incubators.
- Transduce SV40-vereeuwigd mlkl- / - MEFs met de omgekeerde tetracycline gecontroleerd transactivator (rtTA)-bevattende retrovirus uitgedrukt van een plasmide die het gen weerstand blasticidin (onze gemodificeerde plasmide) bevatten en behandelen voor 1 week met 5 μg/mL blasticidin selecteren voor cellen stabiel rtTA28te uiten.
- Transduce de MEFs rtTA-uitdrukken met de Dox-afleidbare retrovirale vector met de chimeer MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) en selecteer met behulp van 4 μg/mL puromycin voor een week, 2 dagen na transductie.
2. live-cel microscopie beeldvorming van MLKL-gemedieerde Necroptosis
- Plaat mlkl- / - MEFs uiten NBB140-2xFV-Venus bij een dichtheid van 50.000 cellen per putje (1 mL/putje) in 24 platen goed, en na een nacht bebroeden(Figuur 2). Gebruik live-cel kleuring voor geautomatiseerde cel tellen (Zie Tabel van materialen).
- Behandelen van cellen voor 12u met Dox (0.5 μg/mL) voor het opwekken van de uitdrukking van de NBB140-2xFV-Venus.
- Induceren necroptosis met 25 nM FKBP dimerizer (Dim) naast 25 nM membraan-ondoordringbare groene fluorescerende kleurstof (Zie Tabel van materialen) in standaard DMEM (zie 1.2). Cellen ondergaan necroptosis accumuleren de kleurstof zoals hun plasma membraan integriteit is aangetast door NBB140-gemedieerde breuk. Tests uitvoeren in drievoud of in viervoud.
- Als u wilt controleren met behulp van beeldvormende systemen single - of dual-color (Zie Tabel van materialen) necroptosis, plaatst u de schepen in de respectieve imaging eenheid gehuisvest in een incubator zoogdieren weefselkweek.
- Open de software (Zie Tabel van materialen) en selecteer het tabblad schema aankomende scant onder de takenlijst.
Opmerking: dit protocol is voor beeldvorming met behulp van eenkleurige systemen, maar een soortgelijke software is beschikbaar voor dual-kleurensystemen. - Selecteer de "lade, vaartuig, Scan typen", en de "Scan patroon" in het tabblad "Fysieke lay-out" en "Snel fluorescentie" op het tabblad Eigenschappen.
- Voeg de "scannen tijd" door te klikken op de "Timeline" venster en het totale aantal van de tijdstippen en de frequentie van de overname (meestal 1 acquisitie elke 0.5 h tot 1 h voor 6 h tot 12 h of elke 5 min. voor het snel-kinetiek necroptosis) en beeldacquisitie starten door het selecteren van "App ly"(rode knop).
- Kwantificeren van necroptosis met behulp van de software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel van materialen) door te selecteren in het "taakvenster", "Object Counting nieuwe analyse met vaste segmentatie drempel boven het achtergrondniveau", die kan worden bepaald door te hangen de muiscursor over achtergrond regio's in verschillende afbeeldingen die worden gebruikt bij de analyse.
- Fluorescerende objecten onderzoeken door Previewing met behulp van de huidige afbeelding selecteren en verfijnen van de drempelniveaus, zo nodig.
- Integreren van groene fluorescentie graven door te openen het tabblad "Launch nieuwe Analysis", kies de "periode", selecteer de putten worden geanalyseerd, voer de "analyse Taaknaam" en druk op "OK".
- Toegang tot gegevens via het tabblad "Analyse Jobs" geanalyseerd door te dubbelklikken op de respectieve Taaknaam en exporteren vanuit het venster grafiek/Export voor aanvullende analyse in externe grafische software (Zie Tabel van materialen).
- Kwantificeren van gegevens als groene fluorescentie positief (+ ve) graven/mm2 of normaliseren de graven door de samenvloeiing en als groene fluorescentie + ve graven/samenvloeiing uiting te geven aan de gegevens.
- Eventueel bij de experimentele eindpunt, vlek cellen met 100 nM van de membraan-permeant groen-fluorescerende kleurstof (Zie Tabel van materialen). Normaliseren gegevens naar % necroptotic cellen als de verhouding van groen fluorescentie/groen fluorescentie bij eindpunt.
3. live-cel confocale microscopie beeldvorming van plasmamembraan wervings- en Permeabilization door MLKL
- Plaat mlkl- / - MEFs uiten NBB140-2xFV-Venus bij een dichtheid van 20.000 cellen per putje (0,5 mL per putje) in een glazen bodem 4-well microscopie kamer voorbehandeld met 50 µg Mo/mL fibronectine in PBS bij 37 ° C gedurende 30 minuten en incubeer gedurende ~ 12 h ( Figuur 2B).
- Behandelen van de cellen met Dox (0.5 μg/mL) voor ~ 12 h voor het opwekken van de uitdrukking van de NBB140-2xFV-Venus.
- Induceren van necroptosis door aan het broeden met verse medium (1 mL/putje) dat 25 Dim ertoe NBB140nM-2xFV-Venus activering en translocatie aan het plasma-membraan.
- Plaats de zaal op een draaiende schijf laser confocal microscoop gebouwd op een omgekeerde standaard uitgerust met omgevingsbeheersing en een 63 scannen 1.4 nb doelstelling en beginnen met behulp van software van keuze overname imaging (Zie Tabel van materialen).
- Initialiseren van de software, selecteer "Focus"-pictogram en YFP filter configuratie (excitatie golflengte 515 nm).
- Zoek het gezichtsveld en brandvlak en voeren het onderhoud scherpstelsysteem met behulp van het tabblad "Duidelijke Focus".
- Om te beginnen de verwerving, selecteer het tabblad van de "Capture" gevolgd door de toewijzing van filter configuratie, passende EMCCD camera blootstelling tijd en intensivering winst en time-lapse overname parameters waaronder interval en de lengte van de overname.
- Controleren van cellulaire herverdeling van de fluorescerende NBB140-2xFV-Venus eiwit tijdens necroptosis door de verwerving van beelden elke 10 s door een camera van de EMCCD met behulp van een laser voor 515 nm (film 1).
Opmerking: Photobleaching baart met fluorescente proteïne beeldvorming. Venus is een van de meer resistent fluorescente proteïnen photobleaching29. Als fluorescente proteïnen die meer vatbaar voor photobleaching zijn worden gebruikt, beeld elke 30 s of langer toestaan dat herstel van het signaal tussen imaging tijdstippen. - Om te controleren plasmamembraan vereniging van NBB140-2xFV-Venus tijdens necroptosis, image elke 10 s het monster bereid in 3.3 door totale interne reflectie fluorescentie microscopie van de (TIRF) met behulp van een microscoop voorzien van een geautomatiseerde TIRF schuif en een 100 x 1.4 nb doelstelling en een EMCCD camera (Movie 2). Stappen 3.5 – 3.7, maar het aanpassen van de hoek van de TIRF binnen de TIRF focus tabblad in volgens de monster- en onderkant glasdikte van de microscopie kamer.
Opmerking: plasmamembraan markeringen zoals LCK-C-RFP kunnen worden gebruikt als besturingselementen voor plasmamembraan lokalisatie in TIRF analyse. - Uitvoeren van beeldverwerking ter verbetering van de kwaliteit door Convolutie met de negatieve genormaliseerde tweede afgeleide van een Gauss functie (Marr algoritme).
4. elektronenmicroscopie
- Plaat mlkl- / - MEFs uiten NBB140-2xFV-Venus bij een dichtheid van 5 miljoen cellen in een plasma beklede 150 mm cel cultuur schotel en incubeer gedurende 12 h (Figuur 3).
- Behandelen van de cellen met Doxycycline (0.5 μg/mL) voor het opwekken van de expressie van NB1-140-2xFV-Venus voor 12u.
- Induceren NBB140-2xFV-Venus activering en translocatie naar het plasmamembraan met 25 nM van homodimerizer voor 5 min. Ditmaal is gevestigd van de kinetiek van de necroptosis waargenomen in live-cel beeldbewerking.
- Verwijder het medium en het herstellen van cellen met behulp van 10 mL 2,5% Glutaaraldehyde, 2% paraformaldehyde in 0,1 M natrium cacodylate buffer pH 7.4 (cacodylate buffer) vooraf opgewarmd bij 37 ° C.
- De monster verzameld door schrapen en draaien van de monsters gedurende 10 minuten bij 500 x g. Verwijder het supernatant.
- Postfix het monster gedurende 1,5 uur in verminderde 2% osmium tetroxide met 1,5% kaliumferrocyanide in 0,1 M natrium cacodylate buffer. Osmium-tetroxide is een kleuring agent gebruikte in TEM om contrast. We gebruikten TEM als voorlopige analyse voorafgaand aan SEM van cel necroptosis ondergaan.
- Spoel het monster 5 keer in ultrazuiver water voor elke 5 min op 500 x g, gevolgd door spoelen in de buffer (zie 4.6), water en ethanol op een automatische processor. Verwijder het supernatant.
- Voor de SEM, vlek de eerder vaste monsters met 1% uranyl acetaat en lood aspartaat zware metalen vlek31.
- Uitdrogen van de monsters door een gesorteerde reeks van alcohol en propyleen oxide-oplossingen.
- Het monster in harde hars32 te verkrijgen van een blok hars insluiten.
- Snijd dik secties van 0,5 μm om te bepalen van het juiste gebied van analyse.
- Coat de monsters met een ultra-dunne film van elektrisch-geleidend metaal (Iridium).
- Beeld en analyseren van de monsters (Figuur 3). Voor kwantificering, een afbeelding van de laag-vergroting van het oppervlak van de blok hars met blootgestelde cellen wordt gescand op 5 keV met een elektronenmicroscoop.
- Visualiseren van cellen over individuele beelden door SEM of imaging-software kan worden gebruikt om meerdere velden-of-view meedoen in één aaneengesloten afbeelding30. Ongeveer 100 cellen kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de Fractie van cellen ondergaan necroptosis op deze manier door het genereren van een hoge resolutie montage in de software van keuze (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Scoren van necrotisch morfologie door SEM vergelijking tussen de normale cel functies met de progressie van vooraf necrotisch of necrotische fenotypen. Deze functies omvatten plasmamembraan wijzigingen met inbegrip van de microvilli verdwijning, afvlakken, breuken in cellen variërend van 10 nm tot 1 µm in grootte, of verlies van organel structuur over ten minste 30 – 40% van de oppervlakte van cytosolische cel.
5. lipide Binding van MLKL met nucleaire magnetische resonantie (NMR), infraroodspectroscopie
- 15N-geëtiketteerden NBB1-156 door standaard eiwit expressie en zuivering als eerder beschreven24voor te bereiden.
- Los 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol ammoniumzout (18:0-PI) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) ammoniumzout (18:1 PI) in 500 µL van ijskoude CHCl3 elke voor eindconcentraties van 1 mg/mL.
- Bewerk ultrasone trillingen ten 1 mg/mL 18:0 en 18:1 PI in een waterbad ultrasoonapparaat voor 1 minuut bij kamertemperatuur of tot 5 min in een mengsel van ijs-water.
-
Aliquot 1 mg/mL 18:0 en 18:1 PI in schone glazen flesjes voor individuele NMR titratie serie (Figuur 4). Overdracht lipiden in organische oplosmiddelen, met behulp van glas luchtdichte spuiten.
- Aliquot 132 µL van 1 mg/mL 18:1 PI (molmassa = 880.137 g/mol) in CHCl,3 voor een definitieve resuspensie volume van 1.200 µL 125 µM concentratie.
Opmerking: Voor 5 mm NMR buizen, bereiden seriële verdunning volumes van > 1000 µL en definitieve NMR proeven volumes van > 500 µL. Voor 3 mm NMR buizen, bereiden seriële verdunning volumes van > 300 µL en definitieve NMR proeven volumes van > 150 µL.
- Aliquot 132 µL van 1 mg/mL 18:1 PI (molmassa = 880.137 g/mol) in CHCl,3 voor een definitieve resuspensie volume van 1.200 µL 125 µM concentratie.
- Aliquot 1 mg/mL varkens brain L-α-phosphatidylinositol-4,5-difosfaat ammoniumzout in 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (hersenen PI (4,5) P2) in schone glazen flesjes.
- Flesjes onder een gasvormige stroom van argon (Ar) of stikstof (N-2) met matige doorstroming naar organische oplosmiddelen verdampen zonder spetters tegen de muren van de flacon glas te plaatsen. Vijf tot dertig min is meestal voldoende voor volumes van 10 – 200 µL organisch oplosmiddel.
- Regelen glas vial(s) onderaan Büchner of een vacuüm kolf met behulp van grote pincet, verzegelen met een rubberstop en hechten kunststof slang aangesloten op een vacuüm lijn. Kolf onder milde vacuüm 's nachts te verwijderen van de resterende organics evacueren.
- Overlay lipide film aliquots met inert gas, verzegelen met een luchtdicht deksel en bewaren bij-20 ° C voor gebruik binnen één maand of -80 ° C voor langere opslag.
- Bereiden van NMR monster buffers zonder wasmiddel (-Det) met 20 mM nbxHyPO4 pH 6.8, 10% D2O en met wasmiddel (+ Det) met 20 mM nbxHyPO4 , pH 6.8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
- Toevoegen + Det buffer glazen ampul met lipide film Bewerk ultrasone trillingen ten in waterbad voor maximaal 30 min, afwisselend ultrasoonapparaat gedurende 10 minuten te bereiken van de gewenste concentratie gevolgd door visuele inspectie.
Opmerking: Ultrasoonapparaat kan warm monster. Laat afkoelen tot kamertemperatuur voor 15 min vóór definitieve eiwit monster reconstitutie. - Seriële verdunning van lipide-wasmiddel micellen in + Det buffer met behulp van ultrasoonapparaat van 1:1 mengsels voor de gewenste concentratie-reeks uitvoeren Basisgewicht: 125 µM vetgehalte, zal drie herhalingen opleveren 62,5 µM, 31.3 µM en 15.6 µM lipide in 0,34 mM DDM.
- Bereiden van controle en verwijst naar de NMR monsters van eiwit en additieven in - Det en + Det buffers, respectievelijk. Toevoegen eiwit en additieven aan elke verdunning van lipide in + Det buffer.
Opmerking: Voor 15N NBB156, eiwit wordt toegevoegd aan een eindconcentratie van 40 µM en aangevuld met 2 mM Halfzwaar dithiothreitol te houden Cys residuen verminderd. - Het juiste volume van monsters overbrengen in 5 mm of 3 mm NMR buizen (zienoot in stap 5.4).
- Handmatig laden van steekproeven in de NMR instrument of regelen in een automatisering-platform zoals de lader van de SampleCase.
- Verwerven van samengestelde NMR spectra met behulp van standaard pulse programma's voor 1H proton spectra als kwaliteitscontrole gevolgd door 2D 1H -15N correlatie spectra hetzij als transversale ontspanning geoptimaliseerd spectroscopie (TROSY) of heteronucleaire meerdere quantum samenhang (SOFAST-HMQC)33.
Opmerking: Gebruik van 3 mm NMR buizen vereist 64 scans voor 1 H -15N TROSY (~ 3 h) of 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scan nummers voor 5 mm NMR buizen zijn gehalveerd. - Verwerkte 2D NMR spectra kunnen worden toegevoegd aan een CARA repository34 voor analyse- of andere software van keuze voor de gebruiker.
-
Software analyseren door annoteren 2D NMR resonanties voor drie goed verspreid en opgelost pieken voor elk eiwit staat. De piekamplitudes opnemen voor elk van de zes toppen voor elke voorwaarde van de buffer met NBB156 (Figuur 5A).
- CARA gebruiken ter voorbereiding van een batch-integratie-lijst (Klik op Main Menu rubriek "Spectrum | Setup lijst Batch"...) van alle spectra verzameld en analyseren met behulp van een toewijzingsbestand één piek (Klik op Main Menu rubriek "pieken | Importeren van Peaklist".. .en kies een gebruiker gedefinieerde .peaks bestand met 6 totaal pieken, 3 voor elk eiwit staat, gedefinieerd binnen).
- Afstemmen van de instellingen ("Integrator | Tune piek Model"...) X-breedte 0.06 ppm en Y-breedte 0,30 ppm (Klik op Main Menu rubriek "Integrator | Tune piek Model"...) voordat het opnemen van de uiteindelijke uitvoer in twee menuselecties (1. Klik op Main Menu kop "Integrator | Integreren van lijst Batch") (2. Klik op Main Menu kop "pieken | Integratie-tabel exporteren") (Figuur 5B).
Opmerking: De ruggengraat amide resonanties voor residuen M21, V53 en L105 hebben gekregen voor de NBB156 gesloten-brace staat. De open-brace staat werd toegewezen aan ruggengraat amide resonanties van residuen G130 en A141 en de epsilon proton zijketen resonantie van W133 met behulp van 3D NMR experimenten24.
- Normaliseren monsters voor directe vergelijking van de verschillende magneten of monster voorwaarden door de drie open-brace amplitudes van de referentiemonsters gemiddeld en een factor van de normalisatie betreffende de twee verwijzingen te berekenen. Bereken de schaal amplitudes voor NBB156 resonanties met behulp van de factor van de normalisatie en de negatieve amplitudes van de instelling op nul (tabel 2).
Voorbeelden: 1) vergelijken monsters van verschillende magneten: magneet A, NBB156DDM en magneet B, NBB156+ DDM. 2) wasmiddel vergelijking: 0,34 DDM en 1,7 mM DDM. - Berekenen voor elke resonantie de geschaalde breuk van gesloten - of open-brace door te delen met een aantal minimale tot de maximale amplitude van alle spectra verzameld met relevante referenties van gratis NBB156 en volledig open-brace NBB156 in wasmiddel.
- De genormaliseerde NMR amplitudes plot als een functie van vetgehalte en vergelijken van de Fractie van de open-brace NBB156 in verschillende omstandigheden (figuur. 5 C).
Opmerking: Als alternatief, analyse van de Fractie van gesloten-brace conformatie tegen vetgehalte kan worden uitgevoerd om te vergelijken lipide binding aan NBB156. Wij verkiezen de voormalige analyse, want het is sneller en beter verslagen over de breuk volledig-door lipiden betrokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualiseren van gereglementeerde necroptosis uitvoering in levende cellen is mogelijk door middel van afleidbare expressie voor een minimale afgeknotte MLKL construct, NBB140-2xFV-Venus. Deze constructie de capaciteit voor het opwekken van plasmamembraan permeabilization onderhoudt en wordt geactiveerd door middel van de Dim-geïnduceerde oligomerisatie van de cassette FKBP (2xFV). We observeren en kwantificeren van necroptosis door live-cel microscopie imaging, monitoring kinetisch (elke 5 minuten) de opname van een cel ondoordringbare groene fluorescentie DNA binden kleurstof (Figuur 6A). Dit afleidbare systeem is zeer robuust, en volledige necroptosis van mlkl- / - MEFs kunnen worden waargenomen binnen ~ 1 h op Dim-gemedieerde oligomerisatie van Dox-gepreïncubeerd cellen die uitdrukking geven aan NBB140-2xFV-Venus (Figuur 1A ). Als snel-kinetiek necroptosis verwijzen we naar deze voorwaarden. Expressie van Venus alleen ± Dim of NBB140-2xFV-Venus in de afwezigheid van Dim deed niet induceren necroptosis (Figuur 6A). Wij voeren gewoonlijk ten minste 3 repliceren imaging experimenten in drievoud of viervoud in 24 - 96- en 384-Wells-platen.
De fast-kinetiek-necroptosis geïnduceerd door gedwongen dimerisatie van NBB140-2xFV-Venus (Figuur 6A) ondersteunt de rol van MLKL als de vermeende beul van plasmamembraan breuk. Visualiseren van de herverdeling van de NBB140-2xFV-Venus aan het plasma-membraan tijdens necroptosis, live-cel confocale microscopie gebruikt voor het bewaken van Venus fluorescentie. Tijdens de necroptosis van de snel-kinetiek, binnen 2-3 min van incubatie met Dim, Venus coating van de rand van de cel wordt waargenomen, gevolgd door een geleidelijke cel afronding (film 1). NBB140-2xFV-Venus accumulatie op het plasma-membraan wordt gevisualiseerd door TIRF confocale microscopie, dat zich op het volume van de cel op het cytosol-plasma membraan-Glazen raakvlak richt. Plasmamembraan-geassocieerde Venus puncta zijn zichtbaar binnen 1-2 min van incubatie met Dim (Movie 2). Dus, afgedwongen oligomerisatie van NBB140-2xFV-Venus induceert de snelle herverdeling aan plasma membraan.
Scanning elektronen microscopie (SEM) is een krachtig instrument om te onthullen van de morfologische veranderingen in cellen ondergaan necroptosis. Onder snelle necroptosis geïnduceerd door oligomerisatie van NBB140-2xFV-Venus, cellen wijzigen morfologie van normale langwerpige vormen (tijd 0 min) afgerond en gepofte (5 min) aan gedeeltelijk gescheurde (10 min) en uitgebreid ontmanteld waar het cytosol heeft verdwenen (20 min) (Figuur 6B). SEM is een aanvulling op de eerdere opmerkingen van live-cel microscopie MLKL localization voor het plasmamembraan correleren met membraan breuk. Over het geheel genomen de microscopie technieken hier vermelde bieden aanvullende middelen te controleren, beoordelen en kwantificeren van de necroptosis op cellulair niveau en impliciete NBB140-2xFV-Venus in de uitvoering van het plasmamembraan breuk.
Wij voeren om te bepalen als MLKL kunt direct contact opnemen met het plasma-membraan in vitro lipide bindende experimenten gecontroleerd door NMR spectroscopie met behulp van recombinant NBB156. Seriële verdunningen van het lipide-wasmiddel micellen, met behulp van een constante concentratie van wasmiddel (voertuig voor lipide presentatie) en variabele lipide concentraties, zijn getest voor binding aan 15N-geëtiketteerden NBB156 door 2D NMR spectroscopie, die monitoren bindende-geïnduceerde veranderingen in de eiwitten. NBB156 ondergaat grote structurele veranderingen op te binden aan het verdringen van de remmende brace regio (aminozuren 132-156) van het gesloten en spiraalvormige lipide (gesloten Brace) aan het open en intrinsiek ongeordende conformatie (Open Brace) (Figuur 7 A). Tweedimensionale NMR spectroscopie biedt per residu informatie over mengsels van beide conformeren (Cijfers 7B-7 C). Wij eerder de ruggengraat amiden van beide conformeren24zijn toegewezen. We kunnen de percentages van de gesloten en open conformeren in een monster gemakkelijk volgen zoals beschreven in de cijfers van 5A-C. Met behulp van deze bindende bepaling, onderzoeken we NBB156 bindend te pitten in DDM wasmiddel, die inert NBB156 bindende (Figuur 5B). In deze test is PIP2 de beste NBB156 ligand, die volledige openstelling van de remmende brace op 125 µM (Figuur 5C) induceert. Daarentegen zijn verzadigde (18:0) PI en onverzadigde (18:1) PI arme NBB156 liganden inducerende de gedeeltelijke accolade openen onder dezelfde voorwaarden (Figuur 5C). Onze NMR gebaseerde lipide bindende bepaling ondersteunend bewijsmateriaal voor de interactie van MLKL NBB156 voorziet van fosfolipiden en stelt voor een directe link tussen MLKL en het plasma membraan.
Figuur 1: Stabiele cellijn herbergen een gemodificeerde Tet-op 3 G afleidbare systeem. (A) stabiele cellijnen werden gegenereerd door retrovirale transductie van/mlkl- / - MEFs met de pTREX-rtTA-explosie gevolgd door de pRetroX-TRE3G-NBB140-2xFV-Venus-puro. Elke signaaltransductie werd gevolgd door antibiotica selectie voor maximaal 1 week alvorens ze naar de latere analyses. (B) Schematische weergave van afleidbare MLKL expressie systeem. Dit systeem is gebaseerd op 2 drug-afleidbare regelgevende stappen: i) MLKL genexpressie en eiwitproductie (+ Dox) en ii) activering door oligomerisatie (+ Dim). Wanneer de productie van eiwitten wordt geïnduceerd in advance, + Dox, snel-kinetiek necroptosis kan worden geactiveerd, + Dim. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Live-cel beeldvorming van snel-kinetiek necroptosis onthult snelle membraan Herlokalisatie van MLKL. (A) Fast-kinetiek necroptosis geïnduceerde zoals in figuur 1B kunnen worden gecontroleerd in een imaging systeem. Necroptosis is georkestreerd door opname van de cel-ondoordringbare groen fluorescente kleurstof. (B) Schematische weergave van live-cel beeldvorming van snel-kinetiek necroptosis met epifluorescence en de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Schematische weergave van het scannen van de bereiding van de monsters van elektronenmicroscopie (SEM) en analyse. Cellen uit fast-kinetiek necroptosis geïnduceerde zoals beschreven in Figuur 1 zijn vastgesteld op de plaat op verschillende tijdstippen na toevoeging van Dim. De cellen worden vervolgens bereid voor SEM analyse door schrapen en bundeling, heavy metal kleuring, hars inbedding en iridium coating zoals beschreven in sectie 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Sample voorbereiding en gegevensverzameling voor NMR titraties van 15N NBB156 en lipide-wasmiddel micellen. Deze bepaling en analyse wordt meestal uitgevoerd in 3-4 dagen: tijdens dag 1, lipide aliquots zijn afgeleverd en gedroogd 's nachts. Tijdens dag 2, de lipide-films zijn gerehydrateerd in assay buffer ± detergentia, sonicated, en serieel verdunde (twee-voudige) door het mengen van gelijke hoeveelheden van de gerehydrateerd lipide-oplossing met lipide-vrije bufferoplossing. Elke verdunning is sonicated om ervoor te zorgen homogeen mengen en distributie van lipiden in wasmiddel micellen voorafgaand aan de volgende verdunningen. EiwitSteekproeven worden gemengd in de seriële lipide-wasmiddel micel verdunningen, geladen in de passende NMR-buizen, geplaatst in een SampleCase loader (of geladen handmatig) en automatische verzameling van de gegevens van de NMR is gestart. Tijdens de daaropvolgende dagen, is NMR gegevensverzameling voltooid en gevolgd door 2D NMR analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Lipide-bindende voorkeuren van NBB156 gemeten met behulp van 2D NMR. (A) 1H -15N TROSY spectra voor 15N-NBB156 in de aanwezigheid (rood) of afwezigheid (blauw) voor 125 µM PI (4,5) P2 in 0,34 mM DDM gevisualiseerd in CARA bovenop. (B) eendimensionale segmenten van resonanties gebruikt voor amplitude metingen en normalisatie. De ruwe spectrum (groen) wordt bedekt met de grens voor amplitude en integratie door het CARA-programma. (C) Normalized amplitudes van de NBB,156 , in aanwezigheid van phosphoinositide-DDM micellen uitgezet tegen vetgehalte. PIP2 induceert volledige openstelling van de brace. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Fast-kinetiek necroptosis geïnduceerd door oligomerisatie van NBB140-2xFV-Venus in/mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis kwantificering door high-throughput fluorescentie imaging van opname van cel-ondoordringbaar, DNA-bindende groen fluorescente kleurstof. Robuuste necroptosis inductie is alleen waargenomen op Dim-geïnduceerde oligomerisatie van NBB140-2xFV-Venus, maar niet bij gebrek aan Dim. Dit is een alleen-Venus controle experimenten worden ook uitgevoerd. Alle voorwaarden worden gedaan in drievoud en uitgezet als gemiddelde en SD van één vertegenwoordiger repliceren. (B) Fast-kinetiek necroptosis geïnduceerde in aanwezigheid van Dim gevisualiseerd met scanning elektronen microscopie. De tijd cursus onthult morfologische veranderingen onderliggende necroptosis met inbegrip van afronding van de cel en zwelling (5 min), scheuren van plasma membraan (10 min), en extravasation van het cytosol (20 min) te voltooien. Elk monster had soortgelijk aantal cellen op tijd 0 min. Van links naar rechts bevat het ingezoomde gebied 26, 32, 23 en 36 cellen met kernen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Binden van NBB156 te phosphoinositides gecontroleerd door NMR spectroscopie. (A) 1H -15N TROSY spectrum van 15N-NBB156. De chemische shifts van resonanties gebruikt voor normalisatie van de gesloten brace spectrum of kwantificering van de open staat worden gemarkeerd met vierkanten of cirkels, respectievelijk. Juiste, schematische voorstelling van NMR handtekeningen gedetecteerd in de afwezigheid of de aanwezigheid van lipide-wasmiddel micellen. NBB156 bindt niet DDM wasmiddel micellen bij gebrek aan phosphoinositides. (B) 1H -15N TROSY spectra van 15N-NBB,156 , in aanwezigheid van de respectieve lipide-wasmiddel micellen bovenop. (C) één 1H -15N TROSY spectra van 15N-NBB,156 , in aanwezigheid van de respectieve lipide-wasmiddel micellen vanuit deelvenster B. Door het opsporen van de open en gesloten conformaties ondubbelzinnig in mengsels van de twee conformaties kunnen we de percentages van de twee conformeren in een monster te kwantificeren. PIP2 is de voorkeur lipide-ligand NBB156 bieden een directe link tussen MLKL en het plasma membraan de fosfolipiden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| PCR buffer (10 x) | 5.0 ΜL |
| DNA sjabloon (100 ng/µL) | 1,0 ΜL |
| cDNAs voor MLKL, 2 x FKBP, Venus) | |
| dNTPs (25 mM elke NTP) | 0,5 ΜL |
| PCR de inleidingen toekomen (F) (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| PCR de inleidingen toekomen (FR (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Venus F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Venus R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA-Polymerase (2.5 U/µL) | 1,0 ΜL |
| Gedestilleerd gedeïoniseerd water (ddH2van O) | 39.9 ΜL |
| Volume van de totale reactie | 50.0 ΜL |
| PCR fietsen parameters | |
| 1 cyclus | 94-98 ° C; 45 s |
| 25 – 30 cycli | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C; 45 s | |
| 72 ° C; 1-2 min | |
| 1 cyclus | 72 ° C; 10 min |
Tabel 1: PCR reactie voor NB 140 -2xFV-Venus voor het beperkingsenzym gebaseerde klonen in pRetroX-TRE3G.
Tabel 2: ruwe gegevens voor NMR spectra gepresenteerd in figuur 5 illustreert de genormaliseerde transformatie van gegevens verzameld van een tweede NMR magneet aan de berekende gemiddelde open brace staat. Klik hier voor een grotere versie van deze tabel.
Film 1: Fast-kinetiek necroptosis geïnduceerd door oligomerisatie van NBB 140 -2xFV-Venus in mlkl- / - MEFs. Confocale microscopie tonen de snelle translocatie van NBB140Live-2xFV-Venus uit het cytosol naar het plasmamembraan na gedwongen oligomerisatie van het FKBP domein. De cellen werden behandeld zoals beschreven in figuur 1. Geel: NBB140-2xFV-Venus. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Movie 2: TIRF microscopie van snel-kinetiek necroptosis. TIRF microscopie snel (~ 2 min) Herlokalisatie en aggregatie van MLKL tonen op het plasma-membraan op toevoeging van Dim mlkl- / - MEFs uiten NBB140-2xFV-Venus. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij bieden protocollen voor technieken die wij samengevoegd tot de betrokken MLKL als de vermeende beul van plasmamembraan breuk24. Naast het ontcijferen van de regelgevende netwerk dat MLKL-gemedieerde necroptosis regelt, kunnen deze technieken onafhankelijk worden gebruikt te karakteriseren van andere passende biologische systemen. Praktisch gesproken, zijn deze technieken middellange - tot laag-throughput diagnosetools.
We hebben regelmatig live-cel beeldvorming van de NBB140gebruikt-2xFV-Venus-necroptosis, en dat veroorzaakt door andere MLKL constructies, mechanistically ontleden de regulering van de MLKL in necroptosis door mutagenese en met behulp van klein molecuul chemische bemiddelen sondes. In het bijzonder, wij en andere groepen hebben aangetoond dat menselijke en muis constructies van MLKL die de minimale NBB-regio bevatten kunnen bemiddelen necroptosis in mens en muis cellijnen. Gemeld een voorbehoud inzake MLKL-gemedieerde necroptosis soorten specificiteit van interactie, RIPK3 en MLKL, waardoor Kruisallergie tussen soorten waargenomen op upstream stimulatie door combinatie van TNF, smac mimetics en caspase remming 253635,,. Dienovereenkomstig, menselijke en muis van RIPK3 en MLKL eiwitten niet onder deze voorwaarden25,35,,36cross-react. Om het omzeilen van de beperkingen tussen soorten, introduceren we mutaties die menselijke MLKL activeren of oligomerisatie cassettes gebruiken, zoals hier wordt weergegeven voor NBB140-2xFV-Venus24. Menselijke NBB140 is een constructie waarin de remmende regio worden bijgehouden en daarom blijft inactief in de context van de NBB140-2xFV-Venus. Dimerisatie van 2xFV wordt beschouwd als de NBB140 activeren door het vrijgeven van de brace. In tegenstelling, induceert menselijke NBB182 necroptosis zelfs in de afwezigheid van oligomerisatie, omdat deze constructie vermag spontaan oligomerize24. Bovendien wijs mutanten (R30A, R30E, E136A en E136R) de behoefte aan activering het activeren van de NB-regio in het kader van het volledige menselijke MLKL overwonnen door RIPK3 fosforylering24. Bovendien, we gereconstitueerd dimerizable menselijke RIPK3 (Cerulean-2xFV-RIPK3) en Dox-afleidbare full-length menselijke MLKL-Venus, die verenigbaar zijn en krachtig induceren necroptosis in/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . Anderen bleek onlangs extra mutaties of domein van de mens-muis verwisseld MLKL constructies die obstakels25van de specificiteit van de soorten overwinnen kunnen.
Wij optimaliseren meestal de necroptosis assay voorwaarden door het uitvoeren van verschillende verkennende experimenten in 96-wells-platen. Wij vervolgens de follow-up met geoptimaliseerde experimenten in 24-Wells-platen, die bieden voldoende cellen voor multiplexing met de aanvullende fluorescerende geactiveerde cel sorting (FACS) en westelijke bevlekkende analyses uitgevoerd later op de zelfde monsters onmiddellijk na de laatste keer imaging wijs. Op dit moment is leven-cel imaging gebaseerd op de detectie van groene en rode fluorescentie, beperken de labeling mogelijkheden voor vele toepassingen. Een gemeenschappelijk alternatief voor de groen fluorescente kleurstoffen is de cel-ondoordringbare DNA-bindende fluorescente kleurstof propidium jodide (PI). Dubbele kleur imaging instrumenten bieden de mogelijkheid van het gebruik van deze kleurstoffen met complementaire groen of rood fluorescerende eiwitten te verbeteren van de inhoud van het hulpprogramma en informatie voor necroptosis imaging.
Het vermogen van MLKL om de translocate aan het plasma-membraan na de activering, maakt live microscopie de techniek van keuze te bestuderen van de biologie van deze eiwitten en om te volgen in real time de morfologische veranderingen onderliggende necroptosis. TIRF microscopie verhelpt ondubbelzinnig MLKL eiwit-aggregaten op het plasma-membraan, met name wanneer uitgevoerd in de aanwezigheid van markeringen die mede naar het plasma-membraan lokaliseren. We gebruikten LCK-C-RFP als een marker voor plasmamembraan co lokalisatie24. De mogelijkheid om tag proteïnen van belang met verschillende fluorophores, maakt het ook mogelijk om te studeren gelijktijdig de activiteit van verschillende eiwitten die betrokken zijn in hetzelfde proces. De volgende generatie van super resolutie microscopie gedeeltelijk overwint de diffractie limiet probleem in standaard confocale microscopie en heeft het potentieel om de extra functies van MLKL-gemedieerde necroptosis onthullen.
Een van de kenmerken van necroptosis is permeabilization van het plasma membraan. Zelfs als verschillende technieken kunnen niet indirect kwantificeren of membraan breuken aangeven, kan alleen EM discontinuïteiten in het plasma membraan integriteit geïnduceerd door MLKL visualiseren. Terwijl TEM de hoogste macht van resolutie, heeft SEM de mogelijkheid om grotere specimen gebieden in kaart. Deze eigenschap, gecombineerd met de ontwikkeling van nieuwe en krachtige software kunnen beheren groter volume van gegevens, heeft het nut van SEM in cel morfologie karakterisering verbeterd. SEM is bovendien ook kundig voor scannen van opeenvolgende monster secties, zodat 3D reconstructie wanneer gekoppeld aan andere systemen, zoals Ion Beam gericht. Enkele van de nadelen van EM analyse omvatten de kosten van de instrumentatie en het onderhoud, de noodzaak van zeer gespecialiseerde personeel, alsmede aanzienlijke tijdsinvestering in monster verwerking en analyse.
Stip blot testen werden oorspronkelijk gebruikt om rechtstreekse verbindingen tussen MLKL en plasmamembraan fosfolipiden16,27te maken. Onze NMR gebaseerde lipide bindende bepaling impliceert definitief MLKL in specifieke fosfolipide bindende, PIP2 markeren als de MLKL ligand van keuze. Onze resultaten tonen een schadelijke werking van acyl keten verzadiging op NBB156 binding aan phosphatidylinositol. Toch, hoe MLKL binding aan PIP2en mogelijk andere fosfolipiden, resulteert in een plasmamembraan breuk blijft onbekend. Met behulp van dit protocol kan andere fosfolipide worden getest voor binding aan MLKL. Onze assay fungeert als een geweldig hulpmiddel voor het testen van nieuwe modellen van MLKL-bemiddelen necroptosis, als het kan worden gebruikt met mutanten van MLKL en verschillende liganden voor het lokaliseren van de specifieke bijdragen aan lipide bindende. Bovendien, kan het worden gebruikt voor andere membraan geassocieerde systemen hun bindende lipidenprofielen ondervragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
