Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

Published: August 7, 2018 doi: 10.3791/58088
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital
* These authors contributed equally

Summary

. מדווחים שיטות אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע necroptosis כולל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי לחיות תאים הדמיה, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, ואיגוד מבוסס-NMR השומנים.

Abstract

Necroptosis הוא שביל מוות תאים מתוכנת המופעלות על-ידי הפעלה של קולטן אינטראקציה קינאז 3 (RIPK3), אשר phosphorylates ומפעיל את שושלת היוחסין מעורב קינאז כמו תחום pseudokinase, MLKL, קרע או permeabilize קרום פלזמה . Necroptosis הוא מסלול דלקתיות המשויך פתולוגיות מרובות, כולל מחלת חיסון עצמי, זיהומיות ומחלות לב וכלי דם, שבץ מוחי, הקשורים ניוון מוחיים של סרטן. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים יכול לשמש כדי לאפיין MLKL כמו המוציא של קרום פלזמה קרע necroptosis. עלינו לדמיין את התהליך של necroptosis תאים באמצעות הדמיה לחיות תאים עם מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי פלורסצנטיות, וכן תאים קבוע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר יחד חשף הפצה מחדש של MLKL מ ציטוזול כדי פלזמה ממברנה לפני אינדוקציה של חורים גדולים קרום הפלזמה. אנו מציגים במבחנה תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח באמצעות ליפידים לזיהוי מאפננים בשם של necroptosis בתיווך MLKL. מבוסס על שיטה זו, אנו מזוהות phosphatidyl-אינוזיטול מלחי (פיפס) ונותנת השומנים מחייב כמותיים קלסרים קריטי של MLKL הנדרשים עבור מיקוד קרום פלזמה ו permeabilization ב necroptosis.

Introduction

זיהוי רכיבים גנטיים של necroptosis הנחתה את השימוש במודלים לבחון את ההשלכה של necroptosis פיסיולוגיה ומחלות1,2,3,4,5. נוקאאוט של RIPK3 או MLKL בעכברים הייתה מינימלית במשתמע הומאוסטזיס מבוגר ופיתוח רומז ש-necroptosis זו אינה חיונית עבור החיים3,6. יתר על כן, מינים מסוימים אינם מכילים גנים או RIPK3 או MLKL, תומך את תפקיד שאינם חיוניים necroptosis של בעלי חיים7,8. מצד שני, מאתגר חייתיים נוקאאוט עם פתולוגיות שונות המושרה במעבדה חשף תפקיד חשוב של necroptosis דלקת, מולדת חסינות, זיהום נגיפי9,10, 11 , 12.

Necroptosis יכול להיות מופעל במספר דרכים על-ידי איתות באמצעות חיישנים שונים מולדת חסינות, כל אילו התוצאה הפעלת13,1,RIPK314. RIPK3 פעיל phosphorylates בתורו ומפעיל MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. למד ביותר, אולי הדרך המורכבים ביותר, שמוביל הפעלה של RIPK3 כרוך מוות קולטן מצדו, אשר bifurcates מבוסס על הרכב במורד הזרם של מתחמי איתות לזירוז או אפופטוזיס או necroptosis1. Necroptosis מתפתח כאשר איתות באמצעות RIPK1 הוא המועדף ותוצאות האירוסין של RIPK319,20. התוצאה היא חביבה עליהם בקלות על עיכוב תרופתי או מחיקה גנטי של קספאז 8, מעכב אנדוגני בשם של necroptosis שמחזיק necroptosis במפרץ. RIPK1 נקשר ומפעיל RIPK3. דרך נוספת להפעיל את necroptosis היא דרך רצפטורים כמו אגרה TLR3/TLR4 איתות, אשר עוסקת ומפעיל RIPK3 דרך טיר-תחום-המכיל בתדר מתאם אינטרפרון-β (TRIF)21. עוד דרך נוספת למות על ידי necroptosis היא על-ידי הפעלת את חיישן ה-DNA דאי, אשר עוסקת ישירות ומפעיל RIPK322.

MLKL הוא חלבון cytosolic מורכב תחום bundle (NB) החורש N-מסוף, תחום pseudokinase C-מסוף (psKD) מקושרים על ידי אזור רגולטוריות מסולסל3. בתאים נורמליים, MLKL נמצא את ציטוזול שבו הוא חשב להיות קומפלקס לא פעיל עם RIPK314. הפעלה של necroptosis מפעיל זרחון RIPK3 של MLKL בתמונה ההפעלה של psKD, וכן אתרים נוספים שעלולים NB ו הסד3,15,23. זרחון גורם בשינוי הסתגלותי MLKL שתוצאתו דיסוציאציה מ RIPK314. ממעטים להבין שינויים הסתגלותי לשחרר את הסוגר המסולסל מ- psKD24. הסוגר, אשר מכיל את 2 helices, ומתווך oligomerization של MLKL לתוך trimer בשם דרך סליל C-מסוף25. הסליל N-מסוף הסוגר מעכב את התחום NB, אשר חיוני ממברנה permeabilization24,26. בבידוד, תחום NB מספיקה לגרום permeabilization קרום פלזמה ו-24,necroptosis16,27. פעילות פרו-necroptotic של NB הוקמה מחדש העכבר מתחלקים fibroblasts בנכונותם MLKL (mlkl- / - MEFs). NB הוא תחום הכריכה השומנים העוסק מעדיפים את diphosphate phosphatidylinositol 4.5 פוספוליפיד (פיפ2). אנחנו הציע מנגנון stepwise של ההפעלה של MLKL, שבו מסולסל oligomerization מקלה על גיוס של MLKL את קרום פלזמה דרך אינטראקציות החלש של NB עם קבוצה ראש קוטב2 24פיפ. -הקרום, NB עובר מוסדר חשיפה של אתר קשירה גבוהה-זיקה נוספים פיפ2, אשר מוסווה על ידי הסוגר המסולסל ב MLKL לא פעיל. בסך הכל, האינטראקציות מרובים של NB עם פיפ2 יציבות קרום פלזמה המוביל שלה קרע, למרות המנגנון המולקולרי של אירועים אלה לא הובהר.

כאן אנו ממחישים שיטות ספציפיות שימוש כדי לאפיין את הפונקציה של MLKL כמו המוציא להורג של necroptosis24. בפרט, אנו מתמקדים התחום הכי מזערי של MLKL, NB ו הסד (NBB), אשר מווסת על ידי עיכוב הסד והוא יכול להיות מופעל דרך dimerization שנאכפת לזירוז necroptosis ולמסמנים של קרום פלזמה. נתאר מערכת ביטוי inducible שלנו בשילוב עם שנאכפת שיכרון בתיווך FKBP dimerization עבור הדמיה לחיות תאים, ואלקטרון מיקרוסקופי של תאים שעברו necroptosis. בנוסף, אנו ממחישים את הניתוח שלנו במבחנה NMR של האינטראקציות של NBB עם phosphatidylinositols (פיפס).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיבוט וסלולרי קו הדור

  1. PCR להגביר את אזור NBB, המקביל חומצת אמינו שאריות 1-140 (NBB140), מ- cDNA MLKL אנושי עבור מסגרת סטנדרטית מבוססת אנזים הגבלה שיבוט עם oligomerization תחום 2 x FK506 מחייב חלבון (2xFKBP או 2xFV), ונוס פלורסנט החלבון לתוך דוקסיציקלין (Dox) - וקטור retroviral inducible pRetroX-TRE3G להשיג NBB140- 2xFV-ונוס (טבלה 1, דמויות 1A-B).
  2. להנציח את ראשי mlkl- / - או ripk3- / - mlkl- / - העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) המתקבל העכברים המתאימים זמינים במעבדה ירוק מאת ארעי תרביות תאים עם אנטיגן SV40-גדול הבעת פלסמיד. בחר תאים מונצחים ~ 1-2 שבועות, ולתחזק ב DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) 2 מ מגלוטמין, 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין, 1 מ מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן חיוניות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ברקמת סטנדרטי חממות תרבות.
  3. מגלי מונצחים SV40 mlkl- / - MEFs עם transactivator טטרציקלין הפוכה מבוקר (rtTA)-המכיל הרטרווירוס הביע מ פלסמיד המכיל הגן ההתנגדות blasticidin (שלנו פלסמיד ששונה) ולטפל 1 בשבוע עם blasticidin 5 μg/mL כדי לבחור עבור תאים stably לבטא rtTA28.
  4. מגלי MEFs את הבעת-rtTA עם וקטור retroviral Dox-inducible המכיל את MLKL chimeric (pRetroX-NBB140-2xFV-ונוס-puro) ובחר באמצעות 4 μg/mL puromycin אחד בשבוע, 2 ימים לאחר התמרה חושית.

2. לחיות תאים במיקרוסקופ הדמיה של בתיווך MLKL Necroptosis

  1. צלחת mlkl- / - MEFs לבטא NBB140-2xFV-ונוס-צפיפות של תאים 50,000 לכל טוב (1 מ"ל/טוב) 24 צלחות, ואוהבים דגירה בין לילה (איור 2א). השתמש לחיות תאים צביעת עבור תא אוטומטית ספירה (ראה טבלה של חומרים).
  2. יטפל בתאים של 12 שעות עם Dox (0.5 μg/mL) כדי לעודד את הביטוי של NBB140-2xFV-ונוס.
  3. זירוז necroptosis עם 25 ננומטר FKBP dimerizer (לדים) בנוסף 25 ננומטר ממברנה-אטום ירוק פלורסנט לצבוע (ראה טבלה של חומרים) ב- DMEM רגיל (ראה 1.2). תאים שעברו necroptosis לצבור לצבוע כמו שלהם שלמות קרום פלזמה נפרצת על ידי NBB140-מתווכת קרע. ביצוע מבחני שהפקידים או ארבע פעמים.
  4. כדי לפקח על necroptosis באמצעות מערכות הדמיה צבע יחיד או כפול (ראה טבלה של חומרים), מקם את כלי ביחידת ההדמיה המתאימות בבניין של חממה בתרבית של תרביות רקמה.
  5. לפתוח את התוכנה (ראה טבלה של חומרים), בחר בכרטיסיה לוח הזמנים הקרוב סורק תחת הרשימה משימות.
    הערה: פרוטוקול זה הוא עבור הדמיה באמצעות מערכות צבע יחיד, אך תוכנה דומה זמין עבור מערכות צבע כפול.
  6. בחר "מגש, קיבול, סוגי סריקה", והתבנית "סריקה" הכרטיסיה "פריסה פיזית" ואת "זריחה מהר" בכרטיסיה מאפיינים.
  7. להוסיף "סרוק הזמן" על-ידי לחיצה על חלון "ציר זמן" ואת המספר הכולל של נקודות זמן ותדירות של רכישה (בדרך כלל 1 רכישת כל h 0.5 כדי 1h לציון 6 קמ ש 12, או כל 5 דקות עבור necroptosis מהיר-קינטיקה) ולהתחיל ייבוא תמונות על-ידי בחירה "App ly"(הכפתור האדום).
  8. לכמת necroptosis שימוש בתוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלה של חומרים) על-ידי בחירת מחלונית"משימות", "אובייקט ספירת ניתוח חדש עם סף פילוח קבוע מעל פני רקע", אשר יכול להיקבע על-ידי ריחוף סמן העכבר מעל הרקע אזורים במספר תמונות ניתוח.
  9. לבחון פלורסנט אובייקטים על-ידי בחירת תצוגה מקדימה באמצעות התמונה הנוכחית ולמקד את רמות הסף כנדרש.
  10. לשלב את ספירת פלורסצנטיות ירוק על-ידי פתיחת הכרטיסיה "להפעיל ניתוח חדש", לבחור את הזמן טווח, בחר את הבארות כדי להיות מנותח, הכנס "שם המשימה ניתוח", והקש "אישור".
  11. גישה ניתחו נתונים הכרטיסייה "ניתוח עבודות" על-ידי לחיצה כפולה על שם המשימה בהתאמה וייצוא מהחלון גרף/ייצוא לניתוח נוסף ב תוכנה graphing חיצוני (ראה טבלה של חומרים).
  12. Quantitate נתונים כמו זריחה ירוק חיובי (+ ve) מ"מ/סעיפים2 או לנרמל את ספירת על ידי הנהרות ולבטא את הנתונים כמו זריחה ירוק + ve ספירות/זרימה.
  13. לחלופין, על נקודת הקצה ניסיוני, כתם תאים עם 100 ננומטר של פלורסנט ירוק ממברנה-permeant צבע (ראה טבלה של חומרים). לנרמל את הנתונים לתאים necroptotic % כיחס בין זריחה זריחה/ירוק ירוק בנקודת קצה.

3. לחיות תאים מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה של קרום פלזמה גיוס, Permeabilization על ידי MLKL

  1. צלחת mlkl- / - MEFs לבטא NBB140-2xFV-ונוס על צפיפות של תאים 20,000 לכל טוב (0.5 mL/טוב) בכוס למטה 4-ובכן מיקרוסקופ קאמרית pretreated עם 50 fibronectin µg/mL. ב- PBS ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, תקופת דגירה של ~ 12 h ( איור 2B).
  2. לטיפול תאי עם Dox (0.5 μg/mL) עבור ~ 12 h לזירוז הביטוי של NBB140-2xFV-ונוס.
  3. זירוז necroptosis על ידי המקננת בינונית טרייה (1 מ"ל/טוב) המכיל 25 ננומטר דים כדי לגרום NBB140-2xFV-ונוס ההפעלה של טרנסלוקציה כדי קרום פלזמה.
  4. למקם את התא מיקרוסקופ קונפוקלי בנוי על העמדה ההפוכה מצוידים הסביבתי, 63 סורק לייזר דיסק ספינינג המטרה נה 1.4 ולהתחיל imaging. רכישה באמצעות תוכנה של בחירה (ראה טבלה של חומרים).
  5. אתחל את התוכנה, בחר "פוקוס" סמל של תצורת המסנן YFP (עירור גל 515 ננומטר).
  6. אתר את שדה הראיה ואת במישור המוקד, וקיום של מערכת אחזקה פוקוס באמצעות הכרטיסיה "פוקוס מובהק".
  7. כדי להתחיל רכישה, בחר בכרטיסייה "ללכוד" ואחריו הקצאה של תצורת המסנן, המתאים EMCCD מצלמה חשיפה התעצמות וזמן רווח ופרמטרים רכישת זמן לשגות כולל מרווח זמן ואורך של רכישה.
  8. לפקח על הסלולר הפצה של NBB הניאון140-2xFV-חלבון ונוס במהלך necroptosis על ידי רכישת תמונות כל 10 s על ידי מצלמה EMCCD באמצעות לייזר nm 515 (1 סרטים).
    הערה: Photobleaching היא דאגה עם חלבון פלואורסצנטי הדמיה. ונוס הוא אחד החלבונים פלורסנט עמידים יותר photobleaching29. אם נעשה שימוש פלורסנט חלבונים אשר רגישים יותר photobleaching, תמונה כל 30 s או יותר כדי לאפשר התאוששות של האות בין נקודות זמן הדמיה.
  9. כדי לפקח על קרום פלזמה התאחדות NBB140-2xFV-ונוס במהלך necroptosis, תמונה כל 10 s המדגם המבושלות 3.3 על-ידי קרינה פלואורסצנטית גמורה מיקרוסקופ (TIRF) באמצעות מיקרוסקופ מצויד של המחוון TIRF אוטומטיות ו- a 100 X 1.4 נה אובייקטיבית, מצלמה EMCCD (2 סרטים). בצע שלבים 3.5 – 3.7, אבל לכוון את זווית TIRF בתוך הכרטיסייה להתמקד TIRF על פי עובי זכוכית מדגם והחלק התחתון של התא מיקרוסקופ.
    הערה: קרום פלזמה סמנים כגון LCK-C-RFP עשוי לשמש כפקדי בלוקאליזציה קרום פלזמה בניתוח TIRF.
  10. לבצע עיבוד כדי לשפר את איכות על ידי קונבולוציה עם הנגזרת השנייה מנורמל שלילי של פונקציה לפי עקומת גאוס (מאר אלגוריתם) תמונה.

4. מיקרוסקופ אלקטרונים

  1. צלחת mlkl- / - MEFs לבטא NBB140-2xFV-ונוס על צפיפות של 5 מיליון תאים מצופים פלזמה 150 מ מ תא תרבות מאכל, תקופת דגירה של 12 שעות (איור 3).
  2. מתייחסים התאים באמצעות דוקסיציקלין (0.5 μg/mL) כדי לעודד את הביטוי של NB1-140-2xFV-ונוס במשך 12 שעות.
  3. זירוז NBB140-2xFV-ונוס ההפעלה של טרנסלוקציה כדי קרום פלזמה עם 25 nM של homodimerizer במשך 5 דקות. הפעם הוא הקים את קינטיקה של necroptosis הנהוגות הדמיה לחיות תאים.
  4. להסיר את המדיה ולתקן תאים באמצעות 10 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד, 2% paraformaldehyde ב 0.1 M נתרן cacodylate מאגר pH 7.4 (מאגר cacodylate) מראש חימם ב 37 º C.
  5. איסוף הדגימה על ידי גירוד ולסובב את הדגימות 10 דקות ב 500 x g. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. Postfix המדגם עבור 1.5 ש ח בחודש מופחתת 2% אוסמיום ארבע-חמצני עם 1.5% אשלגן ferrocyanide במאגר cacodylate נתרן 0.1 M. אוסמיום ארבע-חמצני הוא סוכן מכתימים בשימוש נרחב TEM לספק ניגוד. השתמשנו TEM כמו ניתוח ראשוני לפני SEM של התא שעברו necroptosis.
  7. לשטוף את הדגימה 5 פעמים במים הנדסה גנטית למשך 5 דקות ב 500 x g, ואחריו שטיפות במאגר (ראה 4.6), מים, אתנול על מעבד אוטומטית. למחוק את תגובת שיקוע.
  8. עבור תצורת ה-SEM, מכתים את הדגימות בעבר קבוע עם 1% uranyl אצטט ולהוביל אספרטט מטאל הכתם31.
  9. מייבשים את הדגימות דרך סדרה מדורגת של אלכוהול פרופילן אוקסיד פתרונות.
  10. להטביע את הדגימה קשה שרף32 להשיג בלוק שרף.
  11. לחתוך קטעים בעובי של 0.5 μm כדי לקבוע את האזור הנכון של ניתוח.
  12. מעיל הדגימות עם סרט דקים של מתכת ניצוח (אירידיום).
  13. תמונה ולנתח את הדגימות (איור 3). על כימות, תמונת נמוך-הגדלה של פני השטח בלוק של שרף עם תאים החשופים נסרק בחמש קוו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני.
  14. דמיינו תאים מעבר בודדים תמונות שנלכדו SEM או הדמיה בתוכנה היכולה לשמש להצטרף מספר שדות-of-view לתוך תמונה רציפה אחת30. בערך 100 תאים עשוי לשמש כדי להעריך את השבר של תאים שעברו necroptosis באופן זה על ידי יצירת מצרף ברזולוציה גבוהה בתוכנה של בחירה (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: ניקוד מורפולוגיה נמק מאת SEM השוואת תכונות תאים נורמליים עם ההתקדמות של פנוטיפים מראש עם נמק או נמק. תכונות אלה כוללות שינויים קרום פלזמה לרבות העלמות microvilli, שיטוח, יתבקע בתאים החל מ 10 nm 1 µm גודל, או אובדן של אברון מבנה מעבר לפחות 30-40% של השטח תא cytosolic.

5. השומנים קשירה של MLKL על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה

  1. להכין 15NBB התווית על-ידי N1-156 על ידי חלבון רגיל ביטוי וטיהור כמו שתואר לעיל24.
  2. להמיס µg 500 של אמוניום 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol מלח (18:0 PI) ומלח 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) אמוניום (18:1 PI) ב- 500 µL של קרח CHCl3 כל הסופי ריכוזי 1 מ"ג/מ"ל.
  3. Sonicate 1 מ"ג/מ"ל 18:0 ו- 18:1 PI באמבט מים sonication עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר או עד 5 דקות בתוך תערובת קרח-מים.
  4. Aliquot 1 מ"ג/מ"ל 18:0 ו- PI 18:1 לתוך מבחנות זכוכית נקי לסדרה בודדים NMR טיטור (איור 4). העברת שומנים, ממיסים אורגניים בעזרת מזרקים לאוויר זכוכית.
    1. Aliquot µL 132 של 1 מ"ג/מ"ל 18:1 PI (המסה טוחנת = g 880.137/mol) CHCl3 עבור אמצעי אחסון resuspension הסופי של µL 1,200-125 µM ריכוז.
      הערה: עבור צינורות 5 מ מ NMR, להכין דילול טורי נפחי > 1,000 µL ל NMR הסופי לטעום כרכים של > 500 µL. עבור צינורות 3 מ מ NMR, להכין דילול טורי נפחי > 300 µL ו- NMR הסופי לטעום כרכים של > 150 µL.
  5. Aliquot 1 מ"ג/מ"ל חזירי המוח L-α-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate אמוניום מלח 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (המוח PI (4.5) P2) לתוך מבחנות זכוכית נקי.
  6. מניחים צלוחיות תחת זרם גז של ארגון (Ar) או חנקן (N2) עם זרימה בינונית מתמוססות הממס האורגני ללא להתיז הקירות בקבוקון זכוכית. חמש עד שלושים דקות מספיקה בדרך כלל עבור אמצעי אחסון של 10 – 200 µL הממס האורגני.
  7. לארגן זכוכית vial(s) בחלק התחתון של ביכנר או flask ואקום באמצעות פינצטה גדולה, חותם עם פקק גומי, ולצרף את צינורות פלסטיק חיבור לקו ואקום. לפנות את הבקבוק תחת ואקום עדין בן לילה כדי להסיר שאריות אורגניקס.
  8. כיסוי השומנים aliquots סרט עם גז אינרטי, לסגור עם מכסה אטום ואחסן ב-20 ° C לשימוש בתוך חודש אחד או -80 ° C עבור אחסון ארוך טווח.
  9. להכין NMR מאגרי דגימה ללא דטרגנט (-Det) המכיל 20 מ מ נה-xH-yפו-4 pH 6.8, 10% D2O, ללא דטרגנט (+ דט) המכיל 20 מ מ נה-xH-yפו-4 pH 6.8, 10% D2O, 0.34 ממ n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. הוסף + מאגר דט כדי בקבוקון זכוכית עם סרט השומנים לריכוז הרצוי, sonicate באמבט מים למשך עד 30 דקות, מתחלפים sonication 10 דקות ולאחריו בדיקה ויזואלית.
    הערה: ייתכן Sonication חמים לדוגמה. לאפשר להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני שיחזור מדגם החלבון הסופי.
  11. לבצע דילול טורי של השומנים-דטרגנט הקזאין ב + מאגר דט באמצעות sonication של 1:1 תערובות עבור הסידרה הריכוז הרצויה. החל מ- 125 µM שומנים בדם ריכוז, שלוש חזרות תניב מיקרומטר 62.5 מיקרומטר 31.3, השומנים מיקרומטר 15.6 ב- 0.34 ממ DDM.
  12. להכין שליטה וההתייחסות NMR דגימות של חלבון ותוספים ב- Det ו + מאגרי דט, בהתאמה. להוסיף חלבון ו תוספות כל דילול של השומנים ב + מאגר דט.
    הערה: עבור 15N NBB156, חלבון נוסף ריכוז סופי של 40 µM, בתוספת 2 מ מ deuterated dithiothreitol להשאיר שאריות Cys מופחתת.
  13. להעביר את אמצעי האחסון המתאים של דגימות 5 מ מ או 3 מ מ מרעד (ראה הערה בשלב 5.4).
  14. דוגמיות NMR בייצור מכשירים או לארגן פלטפורמה אוטומציה כגון מטעין SampleCase באופן ידני.
  15. לרכוש ללא הפרדות צבע ספקטרום NMR באמצעות תוכניות הדופק הרגיל עבור 1H הפרוטון ספקטרום כמו בקרת איכות ואחריו 2D 1H -15N מתאם ספקטרה או הרפיה רוחבי ממוטב ספקטרוסקופיה (TROSY) או heteronuclear קוונטית מרובים קוהרנטיות (SOFAST-HMQC)33.
    הערה: השימוש של צינורות 3 מ מ NMR מחייבת סריקות 64 H 1 -15N TROSY (~ 3 h) או 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 דקות). סרוק מספרים הם חצוי עבור צינורות 5 מ מ NMR.
  16. ניתן להוסיף ספקטרום NMR 2D מעובד מאגר קארה34 עבור ניתוח או תוכנה אחרת של בחירה עבור המשתמש.
  17. לנתח את התוכנה על ידי הוספת ביאורים מגנטיים NMR 2D עבור שלוש פסגות מפוזר היטב והחליט לכל מדינה חלבון. להקליט את amplitudes שיא לכל אחת הפסגות 6 עבור כל תנאי מאגר המכיל NBB156 (איור 5א).
    1. השתמש קארה כדי להכין רשימת אצווה-אינטגרציה (בתפריט הראשי לחץ על הכותרת "ספקטרום | הגדרת רשימת אצווה"...) של הספקטרום שנאספו ולנתח באמצעות קובץ המשימה שיא יחיד (בתפריט הראשי לחץ על הכותרת "פסגות | יבא Peaklist". והוא בחר קובץ על-ידי המשתמש .peaks עם פסגות הכולל 6, 3 לכל מדינה חלבון, המוגדר בתוך).
    2. כוונן את ההגדרות ("אינטגרטור | Tune שיא דגם"...) של X רוחב 0.06 ppm ו- Y-רוחב 0.30 ppm (בתפריט הראשי לחץ על הכותרת "אינטגרטור | Tune שיא דגם"...) לפני הקלטת הפלט הסופי במתפריט שתי בחירות (1. לחץ על כותרת בתפריט הראשי "אינטגרטור | שילוב רשימת אצווה") (2. לחץ על כותרת בתפריט הראשי "פסגות | ייצוא טבלה שילוב") (איור 5B).
      הערה: מגנטיים אמיד המרכזי (backbone) עבור שאריות M21, V53, ואת L105 הוקצו עבור מצב סגור-הסד156 NBB. מצב פתוח-הסד שובץ עמוד השדרה מגנטיים אמיד של משקעים G130 ו- A141 ואפסילון פרוטון צד-שרשרת התהודה של W133 באמצעות NMR 3D ניסויים24.
  18. לנרמל דוגמיות להשוואה ישירה מגנטים שונים או מדגם תנאים על ידי חישוב ממוצע של amplitudes פתוח-הסד שלושה של הדגימות הפניה וחישוב פקטור נרמול הנוגעות לשתי ההפניות. לחשב את amplitudes מדורגים עבור NBB156 מגנטיים באמצעות פקטור הנירמול הגדרה amplitudes שלילי כאפס (טבלה 2).
    דוגמאות: 1) השוואת דגימות מגנטים שונים: מגנט, NBB156+ DDM, מגנט B, NBB156+ DDM. 2) השוואה דטרגנט: 0.34 מ"מ DDM ו 1.7 מ"מ DDM.
  19. לחשב עבור כל תהודה השבר המשנה את גודלו של סגור - או פתוח-הסד על-ידי חלוקת עם המגוון של משרעת המינימום למקסימום של הספקטרום שנאספו המכיל הפניות המתאים של NBB חינם156 , NBB לחלוטין פתוח-הסד156 ב דטרגנט.
  20. להתוות את amplitudes NMR מנורמל כפונקציה של ריכוז השומנים ולהשוות את חלק NBB פתוח-הסד156 בתנאים שונים (איור. ג 5).
    הערה: לחלופין, ניתוח של השבר של הסד סגור קונפורמציה נגד שומנים בדם ריכוז ניתן לבצע כדי להשוות בין השומנים מחייב NBB156. אנחנו מעדיפים הניתוח לשעבר כי זה מהיר יותר, טוב יותר דיווחים על השבר-מעורבת לגמרי על ידי שומנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

להמחיש necroptosis מוסדרים ביצוע בתאים חיים היה אפשר דרך ביטוי inducible של מבנה MLKL קטום מינימלית, NBB140-2xFV-ונוס. את המבנה הזה, שומר על היכולת לגרום permeabilization קרום פלזמה, מופעל באמצעות דים-induced oligomerization בקלטת FKBP (2xFV). עלינו להתבונן, לכמת necroptosis על ידי מיקרוסקופ לחיות תאים הדמיה, ניטור kinetically (כל 5 דקות) ספיגת של צבע הכריכה DNA פלורסצנטיות ירוק אטום (איור 6א) תא. מערכת inducible זו הוא מאוד חזקים, מלאה necroptosis של MEFs mlkl- / - יכול להיות שנצפו בתוך ~ 1 h על בתיווך דים oligomerization של תאים Dox preincubated לבטא NBB140-2xFV-ונוס (איור 1א' ). אנו מתייחסים תנאים אלה כאל מהיר-קינטיקה necroptosis. ביטוי של ונוס לבד ± דים או NBB140-2xFV-ונוס בהיעדר דים לא זירוז necroptosis (איור 6א). אנחנו בדרך כלל לבצע לפחות 3 ניסויים הדמיה שכפל שהפקידים או ארבע פעמים 24-, 96-או צלחות 384-. טוב.

Necroptosis מהר-קינטיקה שנגזרות שנאכפת dimerization של NBB140-2xFV-ונוס (איור 6א) תומך בתפקיד של MLKL, המוציא להורג בשם של קרום פלזמה קרע. כדי להמחיש הפצה מחדש של NBB140-2xFV-ונוס על קרום פלזמה במהלך necroptosis, לחיות תאים מיקרוסקופיה קונפוקלית משמש כדי לפקח על ידי קרינה פלואורסצנטית ונוס. במהלך מהיר-קינטיקה necroptosis, בתוך 2-3 דקות של דגירה לדים ונוס ציפוי של הפריפריה תא נצפית, ואחריו תא הדרגתית עיגול (1 סרטים). NBB140-2xFV-ונוס הצטברות-קרום פלזמה הוא מדמיין מאת TIRF קונפוקלית, אשר מתמקדת נפח התאים-הממשק ממברנה-זכוכית ציטוזול-פלזמה. Puncta ונוס קרום פלזמה-הקשורים גלויים בתוך 1-2 דקות של דגירה עם דים (2 סרטים). לפיכך, לאכוף את oligomerization של NBB140-2xFV-ונוס המניע שלה הפצה מהירה כדי קרום פלזמה.

סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) הוא כלי רב עוצמה כדי לחשוף את שינויים מורפולוגיים בתאים שעברו necroptosis. תחת necroptosis מהיר המושרה על ידי oligomerization של NBB140-2xFV-ונוס, תאים שינוי מורפולוגיה מצורות נורמלי מוארך (time דקות 0) כדי מעוגל, תפח (5 דקות) ל קרוע חלקית (10 דקות), בהרחבה פורקו שבו יש ציטוזול נעלם (20 דקות) (איור 6B). SEM משלים התצפיות הקודמות של מיקרוסקופיית לחיות תאים מתאם לוקליזציה MLKL את קרום פלזמה עם ממברנה קרע. באופן כללי הטכניקות במיקרוסקופ שהוצגו במסמך זה מציעים אמצעים משלימים כדי לפקח, להעריך, לכמת necroptosis ברמה התאית, לסבך NBB140-2xFV-ונוס בביצוע של קרום פלזמה קרע.

כדי לקבוע אם MLKL באפשרותך לפנות ישירות קרום פלזמה אנו מבצעים במבחנה השומנים איגוד ניסויים בפיקוח ספקטרוסקופיה NMR באמצעות רקומביננטי NBB156. דילולים טורי של השומנים-דטרגנט הקזאין, באמצעות ריכוז קבוע של דטרגנט (הרכב למצגת השומנים) ובתמצית משתנה השומנים, נבדקו עבור איגוד 15NBB התווית על-ידי N156 מאת ספקטרוסקופיה NMR 2D, אשר צגים הנוצרות על-ידי האיגוד לשינויים החלבון. NBB156 עובר שינויים מבניים על השומנים מחייב לעקור באזור חגורת מעכבות (חומצות אמינו 132-156) מאת סגורה, לוליינית (סגור מסולסל) כדי פתוח ומבולבלת ממהותם קונפורמציה (פתח מסולסל) (איור 7 A). ספקטרוסקופיה NMR מימדי מספק לכל שאריות מידע על תערובות של שני conformers (איורים 7 ב- 7 C). אנחנו קודם לכן להקצות את amides המרכזי (backbone) של שני conformers24. אנחנו יכולים בקלות לפקח האחוזים של conformers סגור ופתוח במדגם נתון כפי שמתואר דמויות 5A-C. משתמש זה וזמינותו מחייבת, אנחנו לטייל NBB156 איגוד פיפס ותחטא DDM, אשר לא פעיל כדי NBB156 מחייב (איור 5B). זה assay, פיפ2 הוא ליגנד156 NBB הטוב ביותר, אשר גורם פתיחה מלאה של הסוגר המסולסל מעכבות ב 125 µM (איור 5C). לעומת זאת, רוויים (18:0) PI ל- PI (18:1) רוויים הם עניים NBB156 ליגנדים גרימת חלקית המסולסל הפותח מתחת לאותם התנאים (איור 5C). וזמינותו מחייבת שלנו מבוססת-NMR השומנים מספק ראיות תומכות עבור האינטראקציה של MLKL NBB156 פוספוליפידים ומציעה קישור ישיר בין MLKL לבין קרום פלזמה.

Figure 1
איור 1: יציבה שורת התאים מחסה ששונה ט-על 3 G inducible מערכת. שורות תאים יציב (א) היו שנוצר על ידי retroviral התמרה חושית של/mlkl- / - MEFs עם pTREX-rtTA-הפיצוץ ואחריו את pRetroX-TRE3G-NBB140-2xFV-ונוס-פורו. התמרה חושית לכל בעקבות הבחירה אנטיביוטי במשך עד שבוע לפני ניתוחים שלאחר מכן. (B) ייצוג סכמטי של מערכת inducible של ביטוי MLKL. זו מערכת מבוססת על 2 צעדים רגולטוריים סמים-inducible: ביטוי גנים MLKL i) ואת ייצור החלבון (+ Dox) ii) להפעלה באמצעות oligomerization (+ לדים). כאשר ייצור החלבון מושרה מראש, + Dox, מהיר-קינטיקה necroptosis יכולה להיות מופעלת, + עמום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הדמיה לחיות תאים של necroptosis מהיר-קינטיקה חושף מהירה הממברנה relocalization של MLKL. (א) מהיר-קינטיקה necroptosis המושרה כמו איור 1B ניתן לנטר בכל מערכת הדמיה. Necroptosis הוא הבקיע על ידי קליטת הפלורסנט ירוק תא אטום. (B) ייצוג סכמטי של הדמיה לחיות תאים של מהיר-קינטיקה necroptosis עם epifluorescence וסיכום של ניתוח מיקרוסקופיה של השתקפות פנימית קרינה פלואורסצנטית (TIRF). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : ייצוג סכמטי של סריקת הכנת הדוגמא מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) וניתוח. תאים necroptosis מהיר-קינטיקה המושרה כמתואר באיור 1 קבועים על הצלחת בנקודות זמן שונות לאחר תוספת של דים. התאים מוכנים ואז SEM ניתוח על ידי גירוד, איגוד, צביעת מתכות כבדות, שרף הטבעה ציפוי אירידיום כמתואר בסעיף 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: לטעום הכנה ואיסוף נתונים עבור titrations NMR של 15N NBB156 , השומנים-דטרגנט הקזאין. Assay וניתוח זו מבוצעת בדרך כלל 3-4 ימים: במהלך יום 1, השומנים aliquots הם ויתרו, מיובשים בן לילה. במהלך יום 2, הסרטים השומנים ולמיומנות assay מאגר ± דטרגנטים, sonicated, ו באופן סדרתי מדולל (כפולה) על ידי ערבוב נפחים שווים של הפתרון השומנים ולמיומנות עם בופר נטולת שומנים בדם. כל דילול sonicated כדי להבטיח ערבוב הומוגנית והפצה של ליפידים ב הקזאין דטרגנט לפני דילולים עוקבות. דגימות חלבון מעורב של דילולים מיצלה השומנים-דטרגנט טורי, שטעון מרעד המתאים, ממוקמת ב- SampleCase העובדים (או הנטענת ידנית), איסוף נתונים NMR אוטומטי מופעל. בימים שלאחר מכן, איסוף נתונים NMR הושלמה, שלאחריה יבוא ניתוח NMR 2D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : העדפות השומנים מחייב NBB156 נמדד באמצעות 2D NMR- (א) נקודות המגע המוצגים 1H -15ספקטרה N TROSY עבור 15N-NBB156 (אדום) נוכחות או היעדרות (כחול) של 125 µM PI (4.5) P2 ב- 0.34 ממ DDM דמיינו בקארה. (B) פרוסות חד-ממדי מגנטיים המשמש משרעת מדידות של נורמליזציה. הקשת raw (ירוק) הוא מתחת לגבול עבור משרעת ושילוב על-ידי התוכנית קארה. (ג) Normalized amplitudes NBB156 בנוכחות phosphoinositide-DDM הקזאין להתוות נגד שומנים בדם ריכוז. פיפ2 גורם פתיחה מלאה של הסוגר המסולסל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : Necroptosis מהיר-קינטיקה המושרה על ידי oligomerization של NBB140-2xFV- ונוס/mlkl- / - MEFs. (א) כימות Necroptosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תפוקה גבוהה הדמיה של ספיגת של התא-אטום, DNA-איגוד ירוק הפלורסנט. Necroptosis חזקים אינדוקציה נצפית רק על דים-induced oligomerization של NBB140-2xFV-ונוס, אבל לא בהיעדר דים. גם מתבצעים ניסויים שליטה ונוס בלבד. כל התנאים נעשים שהפקידים מותוות כממוצע ו- SD מנציג אחד לשכפל. (B) מהיר-קינטיקה necroptosis המושרה בנוכחות דים דמיינו מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הזמן קורס מגלה מורפולוגי משתנה המשמש כבסיס necroptosis כולל תא עיגול ונפיחות (5 דקות), קרע של קרום פלזמה (10 דקות), להשלים את extravasation של ציטוזול (20 דקות). כל מדגם היו מספר דומה של תאים ב- time דקות 0. משמאל לימין, אזור מוגדלת ב מכיל 26, 32, 23, ו 36 תאים עם גרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : איגוד NBB156 כדי phosphoinositides בפיקוח NMR ספקטרוסקופיה. (א) 1H -15N TROSY ספקטרום של 15N-NBB156. המשמרות כימי של מגנטיים נורמליזציה של הספקטרום הסד סגור או כימות של המדינה פתח מודגשים עם ריבועים או עיגולים, בהתאמה. נכון, תיאור סכמטי של חתימות NMR זוהה העדר או נוכחות של השומנים-דטרגנט הקזאין. NBB156 אינו מאגד הקזאין דטרגנט DDM בהיעדרו של phosphoinositides. (B) נקודות המגע המוצגים 1H -15ספקטרה N TROSY של 15N-NBB156 בנוכחות הקזאין בהתאמה השומנים-דטרגנט. (ג) יחיד 1H -15ספקטרה N TROSY של 15N-NBB156 בנוכחות הקזאין השומנים-דטרגנט המתאימים בלוח ב' על ידי גילוי הצורות פתוחים וסגורים חד משמעית ב תערובות של שתי הצורות שאנחנו יכולים לכמת את האחוזים conformers שני במדגם נתון. פיפ2 הוא ליגנד השומנים המועדפת NBB156 מתן קישור ישיר בין MLKL לבין קרום פלזמה פוספוליפידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מאגר ה-PCR (10 x) 5.0 ΜL
תבנית ה-DNA (100 ng/µL) 1.0 ΜL
cDNAs עבור MLKL, 2 x FKBP, ונוס)
dNTPs (25 מ מ NTP כל) 0.5 ΜL
PCR תחל קדימה (נ) (100 ng/µL) 1.3 ΜL
PCR תחל קדימה (FR (100 ng/µL) 1.3 ΜL
NBB140 F ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT
NBB140 R TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC
נ 2xFKBP ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT
2xFKBP R TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC
ונוס F ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG
ונוס R TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC
DNA פולימראז (U 2.5/µL) 1.0 ΜL
מים מזוקקים יונים (ddH2O) 39.9 ΜL
התגובה סה כ נפח 50.0 ΜL
פרמטרים אופניים PCR
מחזור 1 94-98 ° C; 45 s
25-30 מחזורים 94-98 ° C; 45 s
58 ° C; 45 s
72 מעלות צלזיוס; 1-2 דקות
מחזור 1 72 מעלות צלזיוס; 10 דקות

טבלה 1: תגובת ה-PCR של NB 140 -2xFV-ונוס עבור מבוססי אנזים הגבלה שיבוט ב pRetroX-TRE3G.

Table 2
בטבלה 2: נתונים גולמיים עבור ספקטרום NMR המוצג באיור 5 הממחישות את הטרנספורמציה המנורמל של נתונים שנאסף מגנט NMR השני המדינה מחושב הממוצע הסד פתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Movie 1
סרט 1: מהיר-קינטיקה necroptosis המושרה על ידי oligomerization של NBB 140 -2xFV-ונוס mlkl- / - MEFs. Live מציג רוברטסונית מהירה של NBB140מיקרוסקופיה קונפוקלית-2xFV-ונוס מ ציטוזול כדי קרום פלזמה אחרי העלמה oligomerization של התחום FKBP. התאים טופלו כמתואר באיור 1. NBB צהוב:140-2xFV-ונוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Movie 2
סרט 2: TIRF מיקרוסקופיה של מהיר-קינטיקה necroptosis. מיקרוסקופ TIRF מראה מהיר (~ 2 דקות) relocalization, צבירה של MLKL על קרום פלזמה על תוספת של דים כדי/mlkl- / - MEFs לבטא NBB140-2xFV-ונוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מספקים פרוטוקולים טכניקות שילבנו ל ערבו MLKL כמו המוציא בשם של קרום פלזמה קרע24. בנוסף לפענח את רשת גנטית המווסת בתיווך MLKL necroptosis, שיטות אלה ניתן באופן עצמאי לאפיון מערכות ביולוגיות מתאימים אחרים. מבחינה מעשית, טכניקות אלה הן כלי גילוי בינונית-נמוכה תפוקה.

באופן שגרתי השתמשנו הדמיה לחיות תאים של NBB140-2xFV-ונוס-לתווך necroptosis, וכי המושרה על ידי בונה MLKL אחרים, לנתח mechanistically ברגולציה של MLKL ב necroptosis דרך מוטגנזה מכוונת ועל -ידי שימוש כימי מולקולה קטנה הגששים. בפרט, אנו וארגונים אחרים הדגימו האנושי הזה, בונה העכבר MLKL המכילים את האזור מינימלי של NBB יכולים לתווך necroptosis-אנוש וקווים תא העכבר. אחד דיווח הקונה המסדירים בתיווך MLKL necroptosis מינים יחודיות של האינטראקציה RIPK3 ו MLKL, אשר מונע אשיג בין המינים שנצפו על גירוי במעלה הזרם על ידי שילוב של TNF, smac מימטיקה ו קספאז עיכוב 2535,,36. בהתאם לכך, אדם, העכבר RIPK3, חלבונים MLKL לא cross-react תחת האלה35,25,התנאים36. כדי לעקוף את המגבלות בין המינים, אנחנו מציגים מוטציות להפעיל MLKL אנושי או להשתמש oligomerization קלטות כמוצג כאן עבור NBB140-2xFV-ונוס24. NBB האנושי140 הוא תבנית שומרת על האזור מעכבות, לכן נשאר פעיל בהקשר של NBB140-2xFV-ונוס. Dimerization של 2xFV נחשב להפעלה NBB140 על ידי שחרור הסוגר המסולסל. לעומת זאת, NBB האנושי182 גורם necroptosis אפילו בהיעדר oligomerization, בגלל המבנה הזה, הוא מסוגל באופן ספונטני oligomerize24. יתר על כן, הצבע מוטציות (R30A, R30E, E136A ו E136R) מפעיל את האזור NB בהקשר של MLKL אנושי באורך מלא להתגבר על הצורך הפעלה על ידי זרחון RIPK324. יתר על כן, אנו מחדש dimerizable RIPK3 האנושית (Cerulean-2xFV-RIPK3) ושל Dox-inducible באורך מלא האנושי MLKL-ונוס, אשר תואמים, זירוז robustly necroptosis ב/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . אחרים חשפה לאחרונה מוטציות נוספות או תחום האדם-העכבר מוחלפים המבנים MLKL זה עלול להתגבר על המחסומים ירידה לפרטים מינים25.

אנחנו בדרך כלל למטב את התנאים assay necroptosis על ידי ביצוע מספר ניסויים למציאת טווח ב 96-ובכן צלחות. אנחנו מכן לעקוב אחרי עם ניסויים ממוטב טוב 24 צלחות, אשר מספקים מספיק תאים עבור ריבוב עם התא מופעל פלורסנט משלימים את המיון (FACS) וניתוחים המערבי סופג לבצע לאחר מכן הדגימות באותו מיד לאחר הדמיה הנקודה בפעם האחרונה. כיום, הדמיה לחיות תאים מבוסס על זיהוי של קרינה פלואורסצנטית ירוק ואדום, מצמצום אפשרויות תיוג עבור יישומים רבים. חלופה נפוצה צבעי פלורסנט ירוק הוא תא-אטום מחייב הדי הפלורסנט propidium יודיד (PI). מכשירי ההדמיה צבע כפול מציעים את האפשרות של שימוש צבעים אלה עם חלבונים פלורסנט משלימים ירוק או אדום כדי לשפר את השירות ותוכן המידע necroptosis הדמיה.

היכולת של MLKL translocate את קרום פלזמה לאחר ההפעלה שלה, הופכת מיקרוסקופ בשידור חי את הטכניקה של הבחירה ללמוד את הביולוגיה של חלבון זה ומשנה לעקוב בזמן אמת את מורפולוגיים necroptosis הבסיסית. מיקרוסקופ TIRF פותר באופן חד משמעי MLKL אגרגטים חלבון על קרום פלזמה, במיוחד בעת ביצוע בנוכחות סמנים בתרגום משותף כדי קרום פלזמה. השתמשנו LCK-C-RFP כסמן של קרום פלזמה לוקליזציה שיתוף24. היכולת תג חלבונים עניין עם fluorophores שונים, גם מאפשר ללמוד במקביל לפעילות של מספר החלבונים המעורבים באותו התהליך. הדור הבא של סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה חלקית מתגבר על הבעיה מגבלת עקיפה קונפוקלית סטנדרטי, יש פוטנציאל לחשיפת תכונות נוספות של necroptosis בתיווך MLKL.

גולת הכותרת של necroptosis הוא קרום פלזמה permeabilization. גם אם בעקיפין, מספר טכניקות יכול לכמת, או לציין יתבקע ממברנה, רק אם יכולה לדמיין שיבושים באינטגריטי קרום פלזמה המושרה על ידי MLKL. בעוד TEM יש את החזקה הגבוהה ביותר של רזולוציה, SEM בעלת יכולת למפות אזורים גדולים של הדגימה. תכונה זו, בשילוב עם הפיתוח של תוכנה חדש ורב עוצמה מסוגלים לנהל אמצעי אחסון גדולה יותר של נתונים, יש שיפור השירות של SEM באפיון מורפולוגיה תאים. בנוסף, SEM הוא גם מסוגל לסרוק סעיפים לדוגמה רצופים ומאפשר שחזור תלת-ממד כאשר משולב למערכות אחרות, כגון קרן יון ממוקד. חלק מן החסרונות של ניתוח EM לכלול את העלות של מכשור, תחזוקה, הצורך של צוות מאוד מיוחדים, זמן ניכר השקעה דוגמת עיבוד וניתוח.

נקודה חשופה מבחני שימשו במקור כדי ליצור חיבורים ישירים בין MLKL לבין קרום פלזמה פוספוליפידים16,27. וזמינותו מחייבת שלנו מבוססת-NMR השומנים מרמז באופן מוחלט MLKL באיגוד פוספוליפיד ספציפיים, סימון פיפס2 כמו ליגנד MLKL של בחירה. התוצאות שלנו להוכיח חד משמעית של acyl השומן רוויה שרשרת על קשירה156 NBB phosphatidylinositol. ובכל זאת, איך מחייב MLKL פיפ2ופוטנציאל אחרים פוספוליפידים, תוצאות קרום פלזמה קרע נותר לא ידוע. באמצעות פרוטוקול זה כל פוספוליפיד אחר עשוי להיבדק על קשירה MLKL. Assay שלנו משמשת ככלי נהדר לבדיקת המתעוררים דגמי לתווך MLKL necroptosis, ניתן להשתמש עם מוטציות של MLKL ושל ליגנדים שונים כדי לאתר במדויק את תרומות ספציפיות השומנים מחייב. בנוסף, זה יכול לשמש עבור מערכות אחרות ממברנה הקשורים לחקור את הפרופילים שלהם מחייב השומנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. לא-

Acknowledgments

. לא-

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3G Clontech 631188
Tet-On transactivator plasmid Llambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- Dillon et al., 2014
Blasticidin S Hydrochloride Thermo Fisher Scientific BP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
Doxycycline Clontech 631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187 Takara 635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific S7020
Syto16 Thermo Fisher Scientific S7578
NMR
15 N Ammonium Chloride Cambridge Isotope Laboratories NLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTT Cambridge Isotope Laboratories DLM-2622-1
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace D310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) Avanti Polar Lipids 850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) Avanti Polar Lipids 850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOM Essen BioScience, Inc. Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam  Thermo Fisher Scientific Electron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) Essen BioScience, Inc. http://www.essenbioscience.com Imaging analysis
FEI MAPS Thermo Fisher Scientific https://www.fei.com/software/maps/ EM analysis
TopSpin v3.2 Bruker BioSpin http://www.bruker.com NMR data collection
CARA v1.9.1.7 http://cara.nmr.ch/  NMR data analysis
Slidebook 3i (Intelligent Imaging Innovations) https://www.intelligent-imaging.com/slidebook Confocal microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 138 Necroptosis מעורב שושלת היוחסין כמו תחום kinased (MLKL) permeabilization קרום פלזמה לחיות תאים במיקרוסקופ מיקרוסקופ אלקטרונים ספקטרוסקופיה NMR phosphoinositides
אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McNamara, D. E., Quarato, G., Guy,… More

McNamara, D. E., Quarato, G., Guy, C. S., Green, D. R., Moldoveanu, T. Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis. J. Vis. Exp. (138), e58088, doi:10.3791/58088 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter