Summary
Vi rapporterer metoder for kategorisering av MLKL-mediert plasma membranen brudd i necroptosis inkludert konvensjonelle og AC confocal live-celle mikroskopi bildebehandling, skanning elektronmikroskop og NMR-baserte lipid binding.
Abstract
Necroptosis er en programmert celle død sti utløst av aktivering av reseptor samspill protein kinase 3 (RIPK3), som phosphorylates og aktiverer blandet herkomst kinase-lignende domenet pseudokinase, MLKL, brudd eller permeabilize plasma membranen . Necroptosis er en inflammatorisk veien tilknyttet flere patologi inkludert autoimmunitet, infeksjonssykdommer og hjerte, slag, neurodegeneration og kreft. Her beskriver vi protokoller som kan brukes til å beskrive MLKL som bøddelen i plasma membranen brudd i necroptosis. Vi visualisere prosessen med necroptosis i celler ved hjelp av live-celle bildebehandling med fluorescens konvensjonelle og AC confocal mikroskopi og fast celler med elektronmikroskop, som sammen avdekket videreformidling av MLKL fra stoffer til plasma membran før induksjon av store hull i plasma membranen. Vi presenterer i vitro kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) analyse ved hjelp av lipider for å identifisere mulige modulatorer av MLKL-mediert necroptosis. Basert på denne metoden, identifisert vi kvantitative lipid-bindende preferanser og phosphatidyl-inositol fosfater (PIPs) som kritisk permer med MLKL som kreves for plasma membranen målretting og permeabilization i necroptosis.
Introduction
Identifisere genetiske komponenter i necroptosis har muliggjort bruk av dyr modeller å teste Implikasjonen av necroptosis i fysiologi og sykdom1,2,3,4,5. Knockout av RIPK3 eller MLKL i mus hadde minimal konsekvensen i utvikling og voksen homeostase antyder at necroptosis ikke er avgjørende for liv3,6. Videre inneholder enkelte arter ikke enten RIPK3 eller MLKL gener, støtte ikke-essensielle rollen necroptosis i dyr7,8. På den annen side, har utfordrende knockout dyr modeller med ulike patologi indusert i laboratoriet avdekket en viktig rolle i necroptosis i betennelse, medfødt immunitet og viral infeksjon9,10, 11 , 12.
Necroptosis kan aktiveres på flere måter ved signalisering gjennom ulike medfødt immunitet sensorer, alle noe som resulterer i aktivering av RIPK31,13,14. Aktive RIPK3 igjen phosphorylates og aktiverer MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. De studerte, og kanskje den mest komplekse måten, fører til aktivering av RIPK3 innebærer død reseptor ligation, som bifurcates basert på nedstrøms sammensetningen av signalnettverk komplekser å indusere enten apoptose eller necroptosis1. Necroptosis oppstår når signalisering gjennom RIPK1 foretrukket og resultater i engasjement RIPK319,20. Dette resultatet foretrukket lett farmakologiske hemming eller genetisk sletting av caspase 8, en antatte endogene inhibitor av necroptosis som holder necroptosis i sjakk. RIPK1 binder til og aktiverer RIPK3. En annen måte å aktivere necroptosis er gjennom Toll-like reseptorer TLR3/TLR4 signalnettverk, som engasjerer og aktiverer RIPK3 gjennom TIR domene-inneholder kort-inducing interferon-β (TRIF)21. Likevel er en annen måte å dø av necroptosis ved aktivering av DNA sensoren DAI, som direkte engasjerer og aktiverer RIPK322.
MLKL er en cytosolic proteiner som består av et N-terminal helix bunt (NB) domene og C-terminalen pseudokinase domene (psKD) koblet av en regulerende klammeparentes regionen3. I normale celler, er MLKL funnet i stoffer der det antas å være i en inaktiv kompleks med RIPK314. Aktivering av necroptosis utløser RIPK3 fosforylering av MLKL i aktiviseringen løkke av psKD og potensielt flere områder i de NB og spenne3,15,23. Fosforylering induserer en conformational endring i MLKL som resulterer i tar avstand fra RIPK314. Dårlig forstått conformational endringer release spenne fra psKD24. Spenne, som inneholder 2 helikser, formidler oligomerization av MLKL i en antatte trimer gjennom C-terminalen helix25. N-terminal helix av spenne hemmer NB domenet, som er avgjørende for membran permeabilization24,26. I isolasjon er NB domene tilstrekkelig til å indusere plasma membran permeabilization og necroptosis16,24,27. Pro-necroptotic aktiviteten til NB ble rekonstituert i mus embryonale fibroblaster mangelfull i MLKL (mlkl- / - MEFs). NB er et lipid bindende domene som fortrinnsvis engasjerer phospholipid phosphatidylinositol 4,5 diphosphate (PIP2). Vi foreslått en gradvis mekanisme for aktivering av MLKL, der klammeparentes oligomerization forenkler rekruttering av MLKL plasma membranen via svake interaksjoner av NB med PIP2 polar Hovedgruppe24. På membranen gjennomgår NB regulert eksponering av en ekstra høy affinitet bindende nettsted for PIP2, som er maskert av spenne i inaktiv MLKL. Samlet destabilisere flere samhandling NB med PIP2 plasma membranen fører til sine brudd, selv om den molekylære mekanismen av disse hendelsene ikke har utredet.
Her viser vi bestemte metoder benyttes for å karakterisere funksjon MLKL som bøddelen necroptosis24. Spesielt fokusere vi på det mest minimale domenet MLKL, NB og seler (NBB), som er regulert av klammeparentes hemming og kan aktiveres gjennom tvungen dimerization å indusere plasma membranen brudd og necroptosis. Vi beskriver induserbart uttrykk systemet kombinert med tvungen narkotikainduserte FKBP-mediert dimerization for live-celle bildebehandling og elektronmikroskop celler under necroptosis. I tillegg, viser vi vår i vitro NMR analyse av interaksjonene til NBB med phosphatidylinositols (PIPs).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kloning og celle linje generasjon
- PCR forsterke NBB regionen, tilsvarende aminosyre rester 1-140 (NBB140), fra menneskelig MLKL cDNA for i rammen standard begrensning enzym-basert kloning med oligomerization domene 2 x FK506 binding protein (2xFKBP eller 2xFV) og Venus lysstoffrør protein i Doxycycline (Dox) - induserbart retroviral vektor pRetroX-TRE3G å få NBB140- 2xFV-Venus (tabell 1, tall 1A-B).
- Forevige primære mlkl- /- eller ripk3- / - mlkl- / - mus embryonale fibroblaster (MEFs) Hentet fra de respektive mus tilgjengelig i grønne laboratoriet ved forbigående transfection med SV40 store antigen uttrykke plasmider. Velg udødeliggjort celler i ~ 1-2 uker, og opprettholde i DMEM med 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og streptomycin, 1 mM natrium pyruvate og unødvendige aminosyrer på 37 ° C og 5% CO2 i standard vev kultur inkubatorer.
- Transduce SV40-udødeliggjort mlkl- / - MEFs med omvendt tetracycline kontrollert transactivator (rtTA)-inneholder retrovirus uttrykt fra en plasmider inneholder blasticidin motstand genet (vår endret plasmider) og behandle for 1 uke med 5 μg/mL blasticidin velge for celler som uttrykker stabilt rtTA28.
- Transduce rtTA-uttrykke MEFs med Dox-induserbart retroviral vektoren som inneholder den chimeric MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) og bruker 4 μg/mL puromycin for en uke, to dager etter signaltransduksjon.
2. live-celle mikroskopi avbildning av MLKL-mediert Necroptosis
- Plate mlkl- / - MEFs uttrykke NBB140-2xFV-Venus på en tetthet på 50 000 celler per brønn (1 mL/vel) i 24 vel plater og ruge over natten (figur 2A). Bruke live-celle flekker for automatisert celle opptelling (se Tabell for materiale).
- Behandle celler for 12 h med Dox (0,5 μg/mL) til induserer uttrykk for NBB140-2xFV-Venus.
- Indusere necroptosis med 25 nM FKBP dimerizer (svak) i tillegg til 25 nM membran-ugjennomtrengelig grønne fluorescerende farge (se Tabell for materiale) i standard DMEM (se 1.2). Cellene gjennomgår necroptosis akkumuleres fargestoff som deres plasma membranen integritet er kompromittert av NBB140-mediert brudd. Utføre analyser i tre eksemplarer eller quadruplicate.
- For å overvåke necroptosis med én eller to-farge imaging-systemer (se Tabell for materiale), beskjeftigelse i respektive imaging enheten i et pattedyr vev kultur inkubator.
- Åpne programvaren (se Tabell for materiale) og velg kategorien Tidsplan kommende skanner under oppgaver-listen.
Merk: denne protokollen er bildevisning én farge systemer, men et lignende programvare er tilgjengelig for dual-fargesystemer. - Velg "Magasinet fartøyet, skanning typer", og "Scan mønster" i kategorien "Fysisk oppsett" og "Rask fluorescens" i kategorien Egenskaper.
- Legge til "Scan tid" ved å klikke på vinduet "Tidslinjen" og den totale mengden tid og hyppigheten av oppkjøp (vanligvis 1 acquisition hver 0,5 h til 1 h for 6 h til 12 h eller hver 5 min for rask-kinetics necroptosis) og starte bildeopptak ved å velge "App ly"(rød knapp).
- Kvantifisere necroptosis bruke bildet analyseprogramvare (se Tabell for materiale) ved å velge "Oppgåveruta", "Objekt Counting nye analyse med fast segmentering terskel over bakgrunnsnivået", som kan bestemmes ved hovering den musepekeren over bakgrunnen regioner i flere bilder som er brukt i analysen.
- Undersøk fluorescerende objekter ved å velge Forhåndsvisning med gjeldende bilde og avgrense terskelen nivåer etter behov.
- Integrere grønne fluorescens teller ved å åpne kategorien "Innlede ny analyse", velg "tid", Velg brønnene analyseres, angi "Analyse jobbnavnet" og trykk "OK".
- Tilgang analyserte data fra kategorien "Analyse jobber" ved å dobbeltklikke på det respektive jobbnavnet og eksport fra vinduet graf/eksport for ytterligere analyse i ekstern grafisk programvare (se Tabell for materiale).
- Quantitate data som grønne fluorescens positiv (+ ve) teller/mm2 eller normalisere teller ved samløpet og uttrykke dataene som grønne fluorescens + ve teller/samløpet.
- Eventuelt på eksperimentell sluttpunktet, beis celler med 100 nM i membran-permeant grønne fluorescerende farge (se Tabell for materiale). Normalisere data til % necroptotic celler som forholdet mellom grønne fluorescens/grønn fluorescens på endepunktet.
3. live-celle AC Confocal mikroskopi Imaging Plasma membranen rekruttering og Permeabilization av MLKL
- Plate mlkl- / - MEFs uttrykke NBB140-2xFV-Venus på en tetthet av 20.000 celler per brønn (0,5 mL/vel) i et glass bunn 4-vel mikroskopi kammer forbehandlet med 50 µg/mL fibronectin i PBS på 37 ° C i 30 min og ruge ~ 12 h ( Figur 2B).
- Behandle cellene med Dox (0,5 μg/mL) ~ 12 h til induserer uttrykk for NBB140-2xFV-Venus.
- Indusere necroptosis av rugende med fersk medium (1 mL/vel) som inneholder 25 nM Dim å indusere NBB140-2xFV-Venus aktivisering og translokasjon til plasma membranen.
- Plasser kammer på en roterende plate laserskanning AC confocal mikroskop bygget på en invertert stå miljøkontroll og en 63 1,4 NA mål og begynne imaging oppkjøpet ved hjelp av programvaren til valg (se Tabell for materiale).
- Initialisere programvaren, velg "Fokus" ikonet og YFP filter konfigurasjon (eksitasjon bølgelengde 515 nm).
- Finne synsfelt og fokalplanet, og engasjere fokus vedlikehold systemet ved hjelp av kategorien "Klart fokus".
- For å begynne oppkjøpet, Velg kategorien "Fange" etterfulgt av tilordning av filteret konfigurasjon, riktig EMCCD kamera eksponering tid og intensivering gevinst og time-lapse oppkjøpet parametere inkludert intervall og lengden på oppkjøpet.
- Overvåke mobilnettet omfordeling av den fluorescerende NBB140-2xFV-Venus protein under necroptosis ved å kjøpe bilder hver 10 s av et EMCCD kamera med en 515 nm laser (film 1).
Merk: Photobleaching er et problem med fluorescerende protein bildebehandling. Venus er en av de mer motstandsdyktig fluorescerende proteinene photobleaching29. Hvis fluorescerende proteiner som er mer utsatt for photobleaching, bilde hvert 30 s eller lengre at utvinning av signalet mellom tenkelig tidspunkt. - Overvåke plasma membranen sammenslutning av NBB140-2xFV-Venus under necroptosis, bilde hver 10 s utvalget utarbeidet i 3.3 av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi bruker et mikroskop utstyrt med en automatisk TIRF slider og 100 x 1.4 NA mål og et EMCCD kamera (Movie 2). Fremgangsmåten 3.5-3.7, men justere TIRF vinkel i kategorien TIRF fokus etter prøven og bunn glass tykkelse av mikroskopi chamber.
Merk: Plasma membranen markører som LCK-C-RFP kan brukes som kontroller for plasma membranen lokalisering i TIRF analyse. - Utføre bildebehandling for å forbedre kvaliteten av convolution med den negative normaliserte andre deriverte av en Gaussian funksjonen (Marr algoritme).
4. elektronmikroskop
- Plate mlkl- / - MEFs uttrykke NBB140-2xFV-Venus på en tetthet 5 millioner celler i en plasma-belagt 150 mm celle kultur parabol og ruge 12 h (Figur 3).
- Behandle cellene med Doxycycline (0,5 μg/mL) til induserer uttrykk for NB1-140-2xFV-Venus 12 h.
- Indusere NBB140-2xFV-Venus aktivisering og translokasjon til plasma membranen med 25 nM i homodimerizer i 5 minutter. Denne gangen ble opprettet fra the kinetics av necroptosis i live-celle bildebehandling.
- Fjerne media og løse celler med 10 mL 2,5% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde i 0.1 M natrium cacodylate buffer pH 7.4 (cacodylate buffer) pre varmet på 37 ° C.
- Samle prøven ved skraping og spinne prøvene i 10 min 500 x g. Kast nedbryting.
- Postfix utvalget for 1,5 t i redusert 2% osmium tetroxide med 1,5% kalium ferrocyanide inne 0.1 M natrium cacodylate buffer. Osmium tetroxide er en farging agent mye brukt i TEM for å gi kontrast. Vi brukte TEM som foreløpig analyse før SEM cellen under necroptosis.
- Skyll prøven 5 ganger i ultrapure vann i 5 min på 500 x g, etterfulgt av skyller i bufferen (se 4.6), vann og etanol på en automatisk prosessor. Kast nedbryting.
- For SEM, beis tidligere fast prøvene med 1% uranyl acetate og bly aspartate heavy-metal flekken31.
- Tørke prøvene gjennom en gradert serie av alkohol og propylen oksid.
- Bygge inn prøven i hard harpiks32 å få en harpiks blokk.
- Skjære tykke snitt på 0,5 μm til å bestemme riktig området analyse.
- Coat prøvene med en ultra-spinkle film av elektrisk ledende metall (Iridium).
- Bilde og analysere prøvene (Figur 3). For kvantifisering, en lav-forstørrelse bilde av harpiks blokk overflaten med synlige celler er skannet på 5 keV bruker et elektronmikroskop.
- Visualisere celler over personlige bilder tatt av SEM eller tenkelig programvare kan brukes til å bli flere felt-of-view i ett sammenhengende bilde30. Omtrent 100 celler kan brukes til å evaluere brøkdel av cellene gjennomgår necroptosis på denne måten ved å generere en høyoppløselig montasje i programvaren til valg (se Tabell for materiale).
Merk: Scoring nekrotisk morfologi av SEM sammenligner normal celle-funksjoner med utviklingen av pre nekrotisk eller nekrose fenotyper. Disse funksjonene inkluderer plasma membranen endringer inkludert microvilli forsvinning, sammenslåing, brudd i celler fra 10 nm å 1 µm i størrelse, eller tap av organelle struktur over minst 30 – 40% av området cytosolic cellen.
5. lipid Binding av MLKL av kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi
- Forberede 15N-merket NBB1-156 av standard protein uttrykk og rensing som beskrevet tidligere24.
- Oppløse 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol ammonium salt (18:0 PI) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) ammonium salt (18:1 PI) i 500 µL av iskalde CHCl3 hver for siste konsentrasjoner av 1 mg/mL.
- Sonicate 1 mg/mL 18:0 og 18:1 PI sonication vannbad for 1 min ved romtemperatur eller opptil 5 minutter i en isen vann blanding.
-
Aliquot 1 mg/mL 18:0 og 18:1 PI i ren hetteglass for individuelle NMR titrering serien (Figur 4). Overføre lipider i organiske løsemidler bruker glass lufttett sprøyter.
- Aliquot 132 µL 1 mg/mL 18:1 PI (Molmasse = 880.137 g/mol) i CHCl3 for et siste rørets volum på 1200 µL på 125 µM konsentrasjon.
Merk: For 5 mm NMR rør, klargjør fortsettelsene fortynning mengder > 1000 µL og endelige NMR sample mengder > 500 µL. For 3 mm NMR rør, forberede føljetong fortynning mengder > 300 µL og endelige NMR sample mengder > 150 µL.
- Aliquot 132 µL 1 mg/mL 18:1 PI (Molmasse = 880.137 g/mol) i CHCl3 for et siste rørets volum på 1200 µL på 125 µM konsentrasjon.
- Aliquot 1 mg/mL svin hjernen L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate ammonium salt i 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (hjernen PI (4,5) P2) i ren hetteglass.
- Plasser ampuller under en gass strøm av argon (Ar) eller nitrogen (N2) med moderat flyt til å fordampe organisk løsemiddel uten spruting mot medisinglass glassvegger. Til tretti minutter er vanligvis tilstrekkelig for volumer 10 – 200 µL organisk løsemiddel.
- Ordne glass vial(s) nederst i en Büchner eller vakuum kolbe ved hjelp av store pinsett, tetning med en gummipropp og knytte plast slangen koblet til en vakuum linje. Evakuer kolbe under mild vakuum over natten å fjerne gjenværende organiske.
- Overlegg lipid filmen dele med inert gass segl med en lufttette lokk og lagre på 20 ° C for bruk innen en måned eller-80 ° C for lengre tids oppbevaring.
- Forberede NMR eksempel buffere uten vaskemiddel (-Det) som inneholder 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, 10% D2O og med vaskemiddel (+ Det) som inneholder 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, 10% D2O, 0.34 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
- Legge + Det buffer hetteglass med lipid film å oppnå ønsket konsentrasjon og sonicate i vannbad i opptil 30 min, vekslende sonication i 10 min etterfulgt av visuell inspeksjon.
Merk: Sonication kan varme prøven. La avkjøles til romtemperatur i 15 min før siste protein eksempel rekonstituering. - Utføre føljetong fortynning av lipid-rengjøringsmiddel micelles i + Det buffer ved hjelp sonication 1:1 blandinger for ønsket konsentrasjon serien. Starter på 125 µM lipid konsentrasjon, vil tre gjentakelser gi 62.5 µM 31.3 µM og 15.6 µM lipid i 0.34 mM DDM.
- Forberede kontroll og referanse NMR prøver av protein og tilsetningsstoffer i - Det og + Det buffere, henholdsvis. Legg til protein og tilsetningsstoffer til hver fortynning av lipid i + Det buffer.
Merk: For 15N NBB156, protein er lagt til en siste konsentrasjon av 40 µM og supplert med 2 mM deuterated dithiothreitol å holde Cys rester redusert. - Overføre den riktige mengden prøver til 5 mm eller 3 mm NMR rør (se merknad i trinn 5.4).
- Manuelt laste prøver NMR instrument eller ordne i en automatisering plattform som SampleCase loader.
- Erverve sammensatt NMR spekter med standard puls programmer for 1H proton spectra som kvalitetskontroll etterfulgt av 2D 1H -15N korrelasjon spectra som tverrgående avslapning optimalisert spektroskopi (TROSY) eller heteronuclear flere quantum sammenheng (SOFAST-HMQC)33.
Merk: Bruk av 3 mm NMR rør krever 64 skanner for 1 H -15N TROSY (~ 3 h) eller 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Skanne tall halvert for 5 mm NMR rør. - Behandlet 2D NMR spekter kan legges til en CARA oppbevaringssted34 for analyse eller annen programvare av valget til brukeren.
-
Analysere programvare ved kommentere 2D NMR resonanser for tre godt spredt og løst topper for hver protein stat. Registrere peak amplituder for hver av seks toppene for hvert buffer vilkår som inneholder NBB156 (figur 5et).
- Bruk CARA til å forberede en batch-integreringen liste (Klikk hovedmenyen overskriften "Spectrum | Oppsett satsvise listen"...) til alle spectra samlet og analysere ved hjelp av en enkelt peak oppdragsfilen (Klikk hovedmenyen overskriften "topper | Importere Peaklist».. .og velg en brukerdefinert .peaks fil med 6 totalt topper, 3 for hver protein stat definert innenfor).
- Finjustere innstillingene ("Integrator | Melodi Peak modell"...) X-bredde 0,06 ppm og Y bredde 0,30 ppm (Klikk hovedmenyen overskriften "Integrator | Melodi Peak modell"...) før innspillingen det endelige resultatet i to menyvalg (1. Klikk på hovedmenyen overskriften "Integrator | Integrere satsvise listen") (2. Klikk på hovedmenyen overskriften "topper | Dataeksporttabellen integrering") (figur 5B).
Merk: Ryggraden amid resonanser for rester M21, V53 og L105 er tildelt for NBB156 lukket-brace staten. Åpne-brace staten ble tildelt ryggraden amid resonanser av rester G130 og A141 og epsilon proton side-kjeden resonans av W133 med 3D NMR eksperimenter24.
- Normalisere prøver for direkte sammenligning fra forskjellige magneter eller prøve forhold av snitt tre åpne-brace amplituder referanse prøvene og beregne en normalisering faktor knyttet de to referansene. Beregne de skalerte amplituder for NBB156 resonanser bruke normalisering faktor og innstillingen negative amplituder til null (tabell 2).
Eksempler: 1) sammenligne prøver fra ulike magneter: Magnet A, NBB156+ DDM og Magnet B, NBB156+ DDM. 2) vaskemiddel sammenligning: 0.34 mM DDM og 1,7 mM DDM. - Beregne for hvert resonans skalert brøkdel av lukket - eller åpne-brace ved å dele med et utvalg av minimum maksimal amplituden til alle spectra samlet som inneholder riktige referanser gratis NBB156 og fullt åpne-brace NBB156 i vaskemiddel.
- Tegne de normaliserte NMR amplituder som en funksjon av lipid konsentrasjon og sammenligne brøkdel av åpen-brace NBB156 i ulike forhold (figur. 5 C).
Merk: Alternativt analyse av brøkdelen av lukket-brace konformasjon mot lipid konsentrasjon kan utføres for å sammenligne lipid binding til NBB156. Vi foretrekker tidligere analyse fordi det er raskere og bedre rapporter om brøken fullt-engasjert av lipider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualisere regulert necroptosis kjøring i lever celler er oppnådd gjennom induserbart uttrykk for en minimal avkortet MLKL konstruksjon, NBB140-2xFV-Venus. Denne konstruksjonen har evnen til å indusere plasma membran permeabilization og aktiveres gjennom Dim-indusert oligomerization av FKBP kassetten (2xFV). Vi observere og kvantifisere necroptosis av live-celle mikroskopi tenkelig, overvåking kinetically (hver 5 min) opptaket av en celle ugjennomtrengelig grønne fluorescens DNA bindende fargestoff (figur 6en). Dette induserbart systemet er svært robust, og fullstendig necroptosis av mlkl- / - MEFs kan observeres i ~ 1 h på Dim-mediert oligomerization Dox-preincubated celler som uttrykker NBB140-2xFV-Venus (figur 1A ). Vi referere til disse forholdene som fast-kinetics necroptosis. Uttrykk for Venus alene ± Dim eller NBB140-2xFV-Venus i fravær av Dim ikke få necroptosis (figur 6en). Vi utfører vanligvis minst 3 Repliker tenkelig eksperimenter i tre eksemplarer eller quadruplicate i 24 - 96- og 384-og plater.
Fast-kinetics necroptosis indusert av tvungen dimerization på NBB140-2xFV-Venus (figur 6en) støtter MLKL rolle som antatte bøddelen i plasma membranen brudd. Visualisere videreformidling av NBB140-2xFV-Venus til plasma membranen under necroptosis, live-celle AC confocal mikroskopi brukes til å overvåke Venus fluorescens. Under rask-kinetics necroptosis, innen 2-3 min med inkubering med Dim, etterfulgt Venus av cellen periferien er observert, av gradvis celle avrunding (film 1). NBB140-2xFV-Venus akkumulering i plasma membranen er visualisert ved TIRF AC confocal mikroskopi, som fokuserer på cellen volumet på stoffer-plasma membran-glass grensesnittet. Plasma membran-assosiert Venus puncta er synlig innen 1-2 min med inkubering med Dim (Movie 2). Dermed håndheves oligomerization på NBB140-2xFV-Venus induserer sin raske omfordeling til plasma membran.
Skanning elektronmikroskop (SEM) er et kraftig verktøy for å avsløre de morfologiske endringene i cellene gjennomgår necroptosis. Under rask necroptosis av oligomerization på NBB140-2xFV-Venus, celler endre morfologi normal langstrakt figurer (tid 0 min) til avrundet og svulmet (5 min) til delvis sprukket (10 min) og omfattende demontert der stoffer har forsvant (20 min) (figur 6B). SEM utfyller tidligere observasjonene fra live-celle mikroskopi samkjøre MLKL lokaliseringen å plasma membranen med membran brudd. Samlet mikroskopi teknikker som presenteres her er utfyllende måte å overvåke, evaluere og kvantifisere necroptosis på cellenivå og implisere NBB140-2xFV-Venus i utførelsen av plasma membranen brudd.
For å finne ut hvis MLKL kan direkte kontakt plasma membranen utfører vi i vitro lipid bindende eksperimenter overvåket av NMR spektroskopi bruker rekombinant NBB156. Seriell fortynninger av lipid-rengjøringsmiddel micelles, med en konstant konsentrasjon av vaskemiddel (vehicle lipid presentasjon) og variabel lipid konsentrasjoner, er testet for å binde 15N-merket NBB156 av 2D NMR spektroskopi, som skjermer binding-induserte endringer i protein. NBB156 gjennomgår store strukturelle endringer ved binding til fortrenge hemmende klammeparentes regionen (aminosyrer 132-156) fra lukket og spiralformede lipid (lukket klammeparentes) å åpen og egentlig uordnede konformasjon (åpne klammeparentes) (figur 7 A). Todimensjonal NMR spektroskopi gir per rester informasjon om blandinger av både conformers (Tall 7B-7 C). Vi tidligere har tildelt ryggraden amides begge conformers24. Vi kan enkelt overvåke prosenter av lukket og åpen conformers i et gitt utvalg som beskrevet i tallene 5A-C. Vi utforske bruker denne bindende analysen, NBB156 binding til PIPs i DDM vaskemiddel, som er inerte til NBB156 binding (figur 5B). I denne analysen er PIP2 beste NBB156 ligand, som induserer full åpning av hemmende spenne på 125 µM (figur 5C). Metning (18:0) PI og umettet (18:1) PI er dårlig NBB156 ligander inducing delvis klammeparentes åpning under samme vilkår (figur 5C). Våre NMR-baserte lipid bindende analysen gir støtte bevis for samspillet av MLKL NBB156 fosfolipider, og antyder en direkte kobling mellom MLKL og plasma membranen.
Figur 1: Stabil celle linje skjuler en modifisert Tet på 3 G induserbart system. (A) stabil cellelinjer ble generert av retroviral Albin på/mlkl- / - MEFs med pTREX-rtTA-blast etterfulgt av den pRetroX-TRE3G-NBB140-2xFV-Venus-puro. Hver signaltransduksjon ble etterfulgt av antibiotikumet utvalg for opptil 1 uke før den går til påfølgende analyser. (B) skjematisk fremstilling av induserbart MLKL uttrykk systemet. Dette systemet er basert på 2 narkotika-induserbart regulatoriske skritt: i) MLKL genuttrykk og protein produksjon (+ Dox) ii) aktivering av oligomerization (+ Dim). Når protein produksjon er indusert i forhånd, + Dox, rask-kinetics necroptosis kan utløses, + Dim. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Live-celle avbilding av fast-kinetics necroptosis avslører rask membran relocalization av MLKL. (A) Fast-kinetics necroptosis indusert i figur 1B overvåkes i en tenkelig system. Necroptosis er scoret av opptak av celle-ugjennomtrengelig grønne fluorescerende fargestoff. (B) skjematisk fremstilling av live-celle avbilding av fast-kinetics necroptosis med epifluorescence og total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Skjematisk fremstilling av skanning elektronmikroskop (SEM) eksempel forberedelse og analyse. Celler fra rask-kinetics necroptosis indusert som beskrevet i figur 1 er faste på tallerkenen på ulike tidspunkt etter Dim. Cellene er så forberedt for SEM analyse ved skraping pooling, heavy metal flekker, harpiks innebygging og iridium belegg som beskrevet i Seksjon 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Prøve forberedelse og datainnsamling for NMR titrations av 15N NBB156 og lipid-vaskemiddel micelles. Denne analysen og analyse utføres vanligvis i 3-4 dager: I dag 1, lipid dele er utlevert og tørre over natten. Under dag 2, er lipid filmene utvannet i analysen buffer ± vaskemidler, sonicated, og serielt utvannet (to ganger) ved å blande like mengder utvannet lipid løsningen med lipid-fri buffer løsning. Hver fortynning er sonicated for å sikre at homogen blanding og distribusjon av lipider i vaskemiddel micelles før påfølgende fortynninger. Protein prøver er blandet i seriell lipid-rengjøringsmiddel micelle fortynninger, lastet inn i passende NMR rør, plassert i en SampleCase loader (eller lastet manuelt), og automatisk NMR datainnsamling er startet. Under påfølgende dager, er NMR datainnsamling fullført og etterfulgt av 2D NMR analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Lipid-bindende preferansene til NBB156 målt ved hjelp av 2D NMR. (A) lagt 1H -15N TROSY spectra for 15N-NBB156 i tilstedeværelse (rød) eller fravær (blå) på 125 µM PI (4,5) P2 i 0.34 mM DDM visualisert i CARA. (B) endimensjonal skiver resonanser amplituden målinger og normalisering. Rå spekteret (grønn) er kledde med grensen for amplitude og integrering av programmet CARA. (C) Normalized amplituder av NBB156 i nærvær av phosphoinositide-DDM micelles plottet mot lipid konsentrasjon. PIP2 induserer full åpning av spenne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Fast-kinetics necroptosis forårsaket av oligomerization på NBB140-2xFV-Venus i/mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis kvantifisering av høy gjennomstrømming fluorescens tenkelig for opptak av celle-ugjennomtrengelige, DNA-bindende grønne fluorescerende fargestoff. Robust necroptosis induksjon er bare observert på Dim-indusert oligomerization på NBB140-2xFV-Venus, men ikke i fravær av Dim. Venus-bare kontroll eksperimenter utføres også. Alle forhold i tre eksemplarer og tegnes som gjennomsnitt og SD fra en representant gjenskape. (B) Fast-kinetics necroptosis indusert i nærvær av Dim visualisert skanning elektronmikroskop. Tidspunktet kurset avslører morfologiske endres underliggende necroptosis inkludert celle avrunding og hevelse (5 min), ruptur av plasma membran (10 min) og fullstendig bloduttredelse av stoffer (20 min). Hvert utvalg hadde lignende antall celler på tid 0 minutter. Fra venstre til høyre inneholder zoomet i området 26, 32, 23 og 36 celler med kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Binde NBB156 til phosphoinositides overvåkes av NMR spektroskopi. (A) 1H -15N TROSY spekteret av 15N-NBB156. Den kjemiske Skift av resonanser brukes for normalisering av lukkede klammeparentes spekteret eller kvantifisering av åpne staten utheves med firkanter eller sirkler, henholdsvis. Rett, skjematisk NMR signaturer oppdaget i fravær eller tilstedeværelse av lipid-rengjøringsmiddel micelles. NBB156 binder seg ikke DDM vaskemiddel micelles i fravær av phosphoinositides. (B) lagt 1H -15N TROSY spektra av 15N-NBB156 i nærvær av de respektive lipid-rengjøringsmiddel micelles. (C) enkelt 1H -15N TROSY spektra av 15N-NBB156 i nærvær av de respektive lipid-rengjøringsmiddel micelles fra panelet B. Ved å registrere de åpne og lukkede konformasjonen entydig i blandinger av to konformasjonen kan vi kvantifisere prosenter av de to conformers i et gitt utvalg. PIP2 er foretrukket lipid ligand av NBB156 gir en direkte kobling mellom MLKL og plasma membranen fosfolipider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| PCR buffer (10 x) | 5.0 ΜL |
| DNA mal (100 ng/µL) | 1.0 ΜL |
| cDNAs for MLKL, 2 x FKBP, Venus) | |
| dNTPs (25 mM hver NTP) | 0,5 ΜL |
| PCR primere fremover (F) (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| PCR primere fremover (FR (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Venus F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Venus R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA Polymerase (2,5 U/µL) | 1.0 ΜL |
| Destillert deionisert vann (ddH2O) | 39.9 ΜL |
| Totalt reaksjon volum | 50.0 ΜL |
| PCR sykling parametere | |
| 1 syklus | 94-98 ° C; 45 s |
| 25-30 sykluser | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C. 45 s | |
| 72 ° C. 1-2 min | |
| 1 syklus | 72 ° C. 10 min |
Tabell 1: PCR reaksjon av NB 140 -2xFV-Venus for begrensning enzym-basert kloning i pRetroX-TRE3G.
Tabell 2: rådata til NMR spekter presentert i figur 5 illustrerer normalisert transformasjonen av data samlet fra en andre NMR magnet til beregnede gjennomsnittlige åpningsparentes staten. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Film 1: Fast-kinetics necroptosis forårsaket av oligomerization av NBB 140 -2xFV-Venus i mlkl- / - MEFs. Live AC confocal mikroskopi viser rask translokasjon av NBB140-2xFV-Venus fra stoffer til plasma membranen etter tvungen oligomerization FKBP domenet. Cellene ble behandlet som beskrevet i figur 1. Gul: NBB140-2xFV-Venus. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Movie 2: TIRF mikroskopi av fast-kinetics necroptosis. TIRF mikroskopi viser raskt (~ 2 min) relocalization og aggregering av MLKL på plasma membranen ved tillegg av Dim mlkl- / - MEFs uttrykke NBB140-2xFV-Venus. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi tilbyr protokoller for teknikker som kombineres til innblandet MLKL som antatte bøddelen plasma membranen ruptur24. I tillegg til tyde regulatoriske nettverket som regulerer MLKL-mediert necroptosis, kan disse teknikkene brukes uavhengig å karakterisere andre passende biologiske systemer. Praktisk talt, er disse teknikkene middels til lav-gjennomstrømming registreringsverktøy.
Vi har rutinemessig brukes live-celle bildebehandling på NBB140-2xFV-Venus-megle necroptosis, og at indusert av andre MLKL konstruerer, å mechanistically dissekere regulering av MLKL i necroptosis gjennom mutagenese og bruke små molekyl kjemiske sonder. Spesielt vi og andre grupper har vist som menneske og mus konstruksjoner av MLKL som inneholder minimal regionen NBB kan megle necroptosis i menneskelig og mus linjer. En rapportert påminnelse for MLKL-mediert necroptosis er arter spesifisitet av RIPK3 og MLKL interaksjon, som hindrer kryssreaktivitet blant arter observert på oppstrøms stimulering av kombinasjonen av TNF, smac mimetics og caspase hemming 25,35,36. Følgelig menneskets mus RIPK3 og MLKL proteiner ikke cross-react under disse forholdene25,35,36. For å omgå begrensningene Inter-arter, vi introdusere mutasjoner som aktiverer menneskelige MLKL eller bruk oligomerization kassetter som vist her for NBB140-2xFV-Venus24. Menneskelige NBB140 er en konstruksjon som opprettholder hemmende regionen og derfor ikke brukes i sammenheng med NBB140-2xFV-Venus. Dimerization av 2xFV er tenkt å aktivere NBB140 ved å slippe spenne. Derimot induserer menneskelige NBB182 necroptosis selv i fravær av oligomerization, fordi denne konstruksjonen kan spontant oligomerize24. Videre peker mutanter (R30A, R30E, E136A og E136R) aktivere NB regionen i sammenheng med full lengde menneskelige MLKL overvunnet behovet for aktivering av RIPK3 fosforylering24. Videre vi rekonstituert dimerizable menneskelig RIPK3 (Cerulean-2xFV-RIPK3) og Dox-induserbart full lengde menneskelige MLKL-Venus, som er kompatible og robust indusere necroptosis i/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . Andre nylig avdekket flere mutasjoner eller menneske-mus domene byttet MLKL konstruksjoner som kan overvinne arter spesifisitet barrierer25.
Vi typisk optimalisere necroptosis analysen betingelsene ved å utføre flere område-finne eksperimenter i 96-brønnen plater. Så følger med optimalisert eksperimenter i 24-vel plater, som gir nok celler for multiplexing med komplementære fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) og vestlige blotting analyser utført senere på samme prøvene umiddelbart etter bildebehandling siste tidspunktet. Foreløpig er live-celle imaging basert på oppdagelsen av grønne og røde fluorescens, begrense merking mulighetene for mange programmer. En vanlig alternativ til grønne fluorescerende fargestoffer er de celle-ugjennomtrengelige DNA-bindende fluorescerende farge propidium iodide (PI). To farger tenkelig instrumenter tilbyr bruke disse fargestoffer med komplementære grønn eller rød fluorescerende proteiner for å bedre verktøyet og informasjonen innholdet av necroptosis bildebehandling.
Muligheten for MLKL å translocate til plasma membranen etter dens aktivisering, gjør live mikroskopi teknikken ønsker å studere biologi av dette proteinet og å følge i sanntid den morfologiske endrer underliggende necroptosis. TIRF mikroskopi løser utvetydig MLKL protein tilslag på plasma membranen, spesielt når henrettet i nærvær av indikatorer som co Lokaliser til plasma membranen. Vi brukte LCK-C-RFP som en markør for plasma membranen co lokalisering24. Muligheten til å kode proteiner av interesse med ulike fluorophores, kan også for å studere samtidig aktiviteten til flere proteiner involvert i samme prosess. Neste generasjon super-oppløsning mikroskopi delvis overvinner problemet Diffraksjon grense i standard AC confocal mikroskopi og har potensial til å avsløre tilleggsfunksjoner MLKL-mediert necroptosis.
En av kjennetegnene på necroptosis er plasma membran permeabilization. Selv om flere teknikker kan indirekte kvantifisere eller angi membran brudd, kan bare EM visualisere avbrudd i plasma membranen integriteten av MLKL. Mens TEM har høyeste potens oppløsning, har SEM muligheten til å tilordne større prøven områder. Denne funksjonen, kombinert med utvikling av nye og kraftige programvare kunne administrere større volum av dataene, har forbedret verktøyet av SEM i cellen morfologi karakterisering. Videre er SEM også kjøpedyktig avsøke sammenhengende utvalg deler slik at 3D rekonstruksjon når koplet til andre systemer, som fokuserte Ion strålen. Noen av ulempene ved EM analyse omfatter instrumentering og vedlikehold, nødvendigheten av høyt spesialisert personale og betydelig tid investering i prøve behandling og analyse.
Dot blot analyser har brukt opprinnelig å lage direkte forbindelser mellom MLKL og plasma membranen fosfolipider16,27. Våre NMR-baserte lipid bindende analysen implicates definitivt MLKL i bestemte phospholipid binding, markere PIP2 som MLKL ligand valgfrihet. Våre resultater viser en deleterious effekten av acyl kjeden metning på NBB156 binding til phosphatidylinositol. Likevel, hvor MLKL binding til PIP2og potensielt andre fosfolipider, resulterer i plasma membranen brudd er ukjent. Bruker denne protokollen kan noen andre phospholipid testes for å binde MLKL. Våre analysen fungerer som et flott verktøy for å teste nye modeller av MLKL-megle necroptosis, som det kan brukes med mutanter MLKL og ulike ligander for å finne bestemte bidrag til lipid bindende. I tillegg kan det brukes for alle andre membran forbundet systemer avhøre sine lipid bindende profiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
