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Biology

Necroptosis में MLKL-मध्यस्थता प्लाज्मा झिल्ली टूटना का लक्षण वर्णन

Published: August 7, 2018 doi: 10.3791/58088
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital
* These authors contributed equally

Summary

हम necroptosis में MLKL-मध्यस्थता प्लाज्मा झिल्ली टूटना के लक्षण वर्णन के लिए तरीकों की रिपोर्ट पारंपरिक और फोकल लाइव सेल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और एनएमआर आधारित लिपिड बाध्यकारी ।

Abstract

Necroptosis एक क्रमादेशित सेल मौत मार्ग रिसेप्टर के सक्रियकरण के सक्रियण से ट्रिगर प्रोटीन कळेनासे 3 (RIPK3) है, जो phosphorylates और मिश्रित वंश कळेनासे जैसे डोमेन pseudokinase, MLKL, टूटना या प्लाज्मा झिल्ली permeabilize को सक्रिय करता है . Necroptosis एक भड़काऊ मार्ग उन्मुक्ति, संक्रामक और हृदय रोगों, स्ट्रोक, neurodegeneration, और कैंसर सहित कई विकृतियों के साथ जुड़ा हुआ है । यहां, हम प्रोटोकॉल है कि necroptosis में प्लाज्मा झिल्ली टूटना के जल्लाद के रूप में MLKL विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन । हम पारंपरिक और फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ रहते सेल इमेजिंग का उपयोग कर कोशिकाओं में necroptosis की प्रक्रिया कल्पना, और निश्चित कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर, जो एक साथ प्लाज्मा को cytosol से MLKL के पुनर्वितरण का पता चला झिल्ली प्लाज्मा झिल्ली में बड़े छेद के प्रेरण से पहले । हम में मौजूद इन विट्रो नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) विश्लेषण लिपिड का उपयोग करने के लिए ख्यात मॉडुलन की पहचान करने के लिए MLKL-मध्यस्थता necroptosis. इस विधि के आधार पर, हम मात्रात्मक लिपिड बाध्यकारी वरीयताओं को और phosphatidyl-inositol फॉस्फेट (PIPs) MLKL कि प्लाज्मा झिल्ली लक्ष्यीकरण और necroptosis में permeabilization के लिए आवश्यक हैं के महत्वपूर्ण बांधने के रूप में की पहचान की ।

Introduction

necroptosis के आनुवंशिक घटकों की पहचान पशु मॉडल के उपयोग के लिए शरीर विज्ञान और रोग1,2,3,4,5में necroptosis के निहितार्थ का परीक्षण करने में मदद की है । RIPK3 या चूहों में MLKL के नॉकआउट विकास में ंयूनतम निहितार्थ था और वयस्क homeostasis सुझाव है कि necroptosis जीवन3,6के लिए आवश्यक नहीं है । इसके अलावा, कुछ प्रजातियों में या तो RIPK3 या MLKL जीन शामिल नहीं है, गैर-पशुओं में necroptosis की आवश्यक भूमिका7,8का समर्थन । दूसरी ओर, प्रयोगशाला में प्रेरित विभिंन विकृतियों के साथ चुनौती नॉकआउट पशु मॉडल सूजन में necroptosis की एक महत्वपूर्ण भूमिका से पता चला है, जंमजात प्रतिरक्षा, और वायरल संक्रमण9,10, 11 , 12.

Necroptosis विभिंन जंमजात प्रतिरक्षा सेंसरों के माध्यम से संकेत द्वारा कई मायनों में सक्रिय किया जा सकता है, जो सभी RIPK31,13,14के सक्रियण में परिणाम । सक्रिय RIPK3 में बारी phosphorylates और सक्रिय करता है MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18। सबसे अधिक अध्ययन किया है, और शायद सबसे जटिल तरीका है, RIPK3 के सक्रियकरण के लिए अग्रणी मौत रिसेप्टर बंधाव, जो bifurcates संकेतन परिसरों के बहाव संरचना के आधार पर या तो apoptosis या necroptosis1प्रेरित शामिल है । Necroptosis मग्न जब RIPK1 के माध्यम से संकेत है इष्ट और RIPK319,20की सगाई में परिणाम है । इस परिणाम को आसानी से औषधीय बाधा या 8 caspase, necroptosis की एक ख्यात अंतर्जात अवरोध करनेवाला है कि खाड़ी में necroptosis रहता है की आनुवंशिक विलोपन पर एहसान है । RIPK1 बाँधता है और RIPK3 को सक्रिय करता है. necroptosis सक्रिय करने के लिए एक और तरीका है जैसे रिसेप्टर्स TLR3/TLR4 संकेतन, जो संलग्न और सक्रिय करता है के माध्यम से RIPK3 तिर-डोमेन युक्त अनुकूलक-उत्प्रेरण इंटरफेरॉन-β (TRIF)21. अभी तक एक और रास्ता necroptosis द्वारा मरने के लिए डीएनए सेंसर दाई है, जो सीधे संलग्न है और RIPK322सक्रिय के सक्रियण द्वारा है ।

MLKL एक cytosolic एक एन के शामिल प्रोटीन-टर्मिनल कुण्डली बंडल (एनबी) डोमेन और एक सी-टर्मिनल pseudokinase डोमेन (psKD) एक विनियामक धनुकोष्ठक क्षेत्र3से जुड़ा हुआ है । सामान्य कोशिकाओं में, MLKL cytosol में पाया जाता है, जहां यह RIPK314के साथ एक निष्क्रिय परिसर में माना जाता है । necroptosis के सक्रियकरण psKD के सक्रियकरण लूप में MLKL के फास्फारिलीकरण ट्रिगर RIPK3, और संभवतः अतिरिक्त एनबी और धनुकोष्ठक3,15,23में साइटों । फास्फारिलीकरण RIPK314से पृथक्करण में परिणाम है कि MLKL में एक गठन परिवर्तन लाती है । खराब समझ गठन परिवर्तन psKD24से संभालो जारी । ब्रेस् ट, जिसमें 2 helices हैं, मध्यस्थता oligomerization MLKL की एक ख्यात ट्रिमर में सी-टर्मिनल के माध्यम से25कुंडलित । N-टर्मिनल के कुंडलित धनुकोष्ठक एनबी डोमेन, जो झिल्ली permeabilization24,26के लिए आवश्यक है रोकता है । अलगाव में, एनबी डोमेन प्लाज्मा झिल्ली permeabilization और necroptosis16,24,27प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है । एनबी के समर्थक necroptotic गतिविधि में माउस भ्रूण fibroblasts की कमी MLKL में पुनर्गठन किया गया था (MLKL-/ MEFs) । एनबी एक लिपिड बाध्यकारी डोमेन है कि तरजीही फॉस्फोलिपिड phosphatidylinositol 4, 5 diphosphate (रंज2) संलग्न है । हम MLKL के सक्रियकरण के एक stepwise तंत्र का प्रस्ताव किया, जिसमें ब्रेस oligomerization रंज2 ध्रुवीय सिर समूह24के साथ नायब की कमजोर बातचीत के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली को MLKL की भर्ती की सुविधा । झिल्ली पर, एनबी एक अतिरिक्त उच्च संबंध बाइंडिंग साइट के रंज2, जो निष्क्रिय MLKL में ब्रेस द्वारा नकाबपोश है के लिए विनियमित जोखिम । । कुल मिलाकर, रंज2 के साथ नायब के कई बातचीत अपने टूटना करने के लिए अग्रणी प्लाज्मा झिल्ली को अस्थिर, हालांकि इन घटनाओं के आणविक तंत्र का आविर्भाव नहीं किया गया है ।

यहां हम विशिष्ट necroptosis24के जल्लाद के रूप में MLKL के समारोह विशेषताएं इस्तेमाल किया तरीकों को वर्णन । विशेष रूप से, हम MLKL के सबसे कम डोमेन पर ध्यान केंद्रित, एनबी और ब्रेस (NBB), जो ब्रेस निषेध द्वारा विनियमित है और प्लाज्मा झिल्ली टूटना और necroptosis प्रेरित करने के लिए लागू dimerization के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता है । हम हमारे inducible अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ संयुक्त लागू दवा प्रेरित FKBP-मध्यस्थता dimerization के लिए लाइव सेल इमेजिंग, और necroptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का वर्णन. इसके अतिरिक्त, हम हमारे इन विट्रो एनएमआर phosphatidylinositols (PIPs) के साथ NBB की बातचीत के विश्लेषण में वर्णन ।

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Protocol

1. क्लोनिंग और सेल लाइन पीढ़ी

  1. पीसीआर बढ़ाना NBB क्षेत्र, एमिनो एसिड अवशेषों के लिए इसी 1-140 (NBB१४०), मानव MLKL सीडीएनए से फ्रेम मानक प्रतिबंध एंजाइम में oligomerization डोमेन 2x FK506 बंधन प्रोटीन (2xFKBP या 2xFV) और वीनस फ्लोरोसेंट के साथ क्लोनिंग आधारित Doxycycline (Dox) में प्रोटीन-inducible retroviral वेक्टर pRetroX-TRE3G NBB१४०-2xFV-वीनस (तालिका 1, आंकड़े 1a-बी) प्राप्त करने के लिए ।
  2. अमर प्राथमिक mlkl-/ -या ripk3-/- mlkl-/- माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) अभिकर्मक-बड़े प्रतिजन के साथ क्षणिक SV40 द्वारा हरी प्रयोगशाला में उपलब्ध संबंधित चूहों से प्राप्त व्यक्त प्लाज्मिड. का चयन करें में अमर कोशिकाओं ~ 1 – 2 सप्ताह, और DMEM में बनाए रखने के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी L-glutamine, १०० U/एमएल पेनिसिलिन और streptomycin, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और गैर-आवश्यक अमीनो एसिड पर ३७ ° c और 5% सह2 मानक ऊतक में संस्कृति मशीन ।
  3. Transduce SV40-अमर mlkl-/- MEFs के साथ रिवर्स टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित transactivator (rtTA) युक्त retrovirus प्लाज्मिड प्रतिरोध जीन युक्त blasticidin से व्यक्त (हमारे संशोधित प्लाज्मिड) और इलाज के लिए 1 5 μg/एमएल blasticidin के साथ सप्ताह rtTA28व्यक्त की कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए ।
  4. Transduce ने rtTA-व्यक्ती MEFs के साथ Dox-inducible retroviral वेक्टर युक्त chimeric MLKL (pRetroX-NBB१४०-2xFV-शुक्र-पूरो) और एक सप्ताह के लिए 4 μg/एमएल puromycin का प्रयोग कर के 2 दिन बाद transduction का चयन करें ।

2. MLKL-मध्यस्थता Necroptosis के सेल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग रहते हैं

  1. प्लेट mlkl-/- MEFs व्यक्त NBB१४०-2xFV-वीनस प्रति अच्छी तरह से ५०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर (1 मिलीलीटर/अच्छी तरह से 24 प्लेटों में), और रात भर गर्मी (चित्रा 2ए) । स्वचालित सेल गिनती के लिए लाइव सेल धुंधला का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. Dox के साथ 12 एच के लिए कोशिकाओं का इलाज (०.५ μg/एमएल) NBB१४०-2xFV-वीनस की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए ।
  3. 25 एनएम झिल्ली के अलावा 25 एनएम FKBP dimerizer (मंद) के साथ necroptosis प्रेरित-अभेद्य हरी फ्लोरोसेंट डाई ( सामग्री की तालिकादेखें) मानक DMEM में (१.२ देखें) । necroptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं उनके प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के रूप में डाई जमा NBB१४०द्वारा समझौता किया है-टूटना मध्यस्थता । तपसिल या quadruplicate में परख करते हैं ।
  4. एकल या दोहरे रंग इमेजिंग प्रणालियों का उपयोग necroptosis मॉनिटर करने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें), संबंधित इमेजिंग एक स्तनधारी ऊतक संस्कृति मशीन में स्थित इकाई में जहाजों जगह है ।
  5. सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और कार्य सूची के तहत टैब अनुसूची आगामी स्कैन का चयन करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल एकल रंग प्रणालियों का उपयोग इमेजिंग के लिए है, लेकिन एक समान सॉफ्टवेयर दोहरे रंग प्रणालियों के लिए उपलब्ध है ।
  6. "ट्रे, पोत, स्कैन प्रकार", और "भौतिक लेआउट" टैब में "स्कैन पैटर्न" और गुण टैब में "Fast प्रतिदीप्ति" का चयन करें ।
  7. "समयरेखा" विंडो पर क्लिक करके "स्कैन समय" जोड़ें और समय अंक और अधिग्रहण की आवृत्ति की कुल संख्या (आम तौर पर 1 अधिग्रहण हर ०.५ ज करने के लिए 1 ज के लिए 6 ज करने के लिए 12 घंटे, या फास्ट-कैनेटीक्स necroptosis के लिए हर 5 मिनट) और चयन द्वारा छवि अधिग्रहण शुरू "App "(लाल बटन) ।
  8. "कार्य फलक" से चयन करके छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करते हुए necroptosis को बढ़ाता है, "पृष्ठभूमि स्तर के ऊपर निश्चित सेगमेंटेशन थ्रेशोल्ड के साथ नए विश्लेषण की गणना करने वाला ऑब्जेक्ट", जिसे होवर करके निर्धारित किया जा सकता है विश्लेषण में प्रयुक्त कई छवियों में पृष्ठभूमि क्षेत्रों पर माउस कर्सर ।
  9. वर्तमान छवि का उपयोग कर पूर्वावलोकन का चयन करके फ्लोरोसेंट वस्तुओं की जांच और सीमा के स्तर को परिष्कृत के रूप में की जरूरत है ।
  10. एकीकृत ग्रीन प्रतिदीप्ति काउंट्स "लांच नई विश्लेषण" टैब खोलने के द्वारा, "समय सीमा" का चयन, कुओं का विश्लेषण करने के लिए, "विश्लेषण नौकरी का नाम" दर्ज करें, और "ठीक" दबाएँ ।
  11. प्रवेश संबंधित नौकरी के नाम पर डबल क्लिक करके "विश्लेषण नौकरियां" टैब से डेटा का विश्लेषण किया और बाहरी रेखांकन सॉफ्टवेयर में अतिरिक्त विश्लेषण के लिए ग्राफ/निर्यात खिड़की से निर्यात ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  12. Quantitate डेटा को हरा प्रतिदीप्ति धनात्मक (+ ve) के रूप में गिना जाता है या संगम द्वारा गणना को सामान्य करता है और डेटा को ग्रीन प्रतिदीप्ति + ve गिनता/
  13. वैकल्पिक, प्रायोगिक समापन बिंदु पर, झिल्ली के १०० एनएम के साथ दाग कोशिकाओं-permeant हरी फ्लोरोसेंट डाई ( सामग्री की तालिकादेखें) । समापन बिंदु पर हरी प्रतिदीप्ति/हरी प्रतिदीप्ति के अनुपात के रूप में% necroptotic कक्षों के लिए डेटा को सामान्य करें ।

3. लाइव-सेल फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्लाज्मा झिल्ली भर्ती और Permeabilization के MLKL द्वारा

  1. प्लेट mlkl-/- MEFs व्यक्त NBB१४०-2xFV-वीनस प्रति अच्छी तरह से २०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर (०.५ मिलीलीटर/-५० µ जी के साथ अच्छी तरह से माइक्रोस्कोपी चैंबर का इलाज ३७ डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में 30 मिनट और के लिए मशीन के लिए ~ 12 ज ( चित्रा 2बी) ।
  2. NBB१४०-2xFV-वीनस की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए ~ 12 एच के लिए Dox (०.५ μg/एमएल) के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
  3. NBB१४०-2xFV-वीनस सक्रियण और प्लाज्मा झिल्ली को translocation के लिए प्रेरित करने के लिए 25 एनएम मंद युक्त ताजा माध्यम (1 मिलीलीटर/
  4. एक कताई डिस्क लेजर पर एक औंधा पर्यावरण नियंत्रण और एक ६३ १.४ ना उद्देश्य से सुसज्जित स्टैंड पर बनाया फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग पर चैंबर प्लेस और इमेजिंग पसंद के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिग्रहण शुरू ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  5. सॉफ्टवेयर शुरू, "फोकस" आइकन और YFP फ़िल्टर विन्यास (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ५१५ एनएम) का चयन करें.
  6. देखने और फोकल विमान के क्षेत्र का पता लगाएं, और ध्यान रखरखाव "निश्चित ध्यान" टैब का उपयोग कर प्रणाली संलग्न हैं ।
  7. अधिग्रहण शुरू करने के लिए, "कैप्चर" टैब फ़िल्टर विंयास, उचित EMCCD कैमरा जोखिम समय और गहनता लाभ, और अंतराल और अधिग्रहण की लंबाई सहित समय चूक अधिग्रहण मापदंडों के असाइनमेंट के बाद का चयन करें ।
  8. एक ५१५ एनएम लेजर (फिल्म 1) का उपयोग कर एक EMCCD कैमरा द्वारा हर 10 एस छवियों को प्राप्त करने के द्वारा necroptosis के दौरान फ्लोरोसेंट NBB१४०-2xFV-वीनस प्रोटीन की सेलुलर पुनर्वितरण मॉनिटर ।
    नोट: Photobleaching फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग के साथ एक चिंता का विषय है । वीनस29photobleaching करने के लिए और अधिक प्रतिरोधी फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक है । यदि फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि और अधिक photobleaching के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, छवि हर 30 एस या अब इमेजिंग समय अंक के बीच संकेत की वसूली की अनुमति के लिए उपयोग किया जाता है ।
  9. NBB१४०के प्लाज्मा झिल्ली एसोसिएशन की निगरानी करने के लिए-2xFV-वीनस necroptosis के दौरान, छवि हर 10 s कुल आंतरिक प्रतिबिंब द्वारा ३.३ में तैयार नमूना प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी एक स्वचालित TIRF स्लाइडर और एक से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग 100X १.४ न उद्देश्य और एक EMCCD कैमरा (फिल्म 2) । कदम 3.5 – 3.7 का पालन करें, लेकिन नमूना और माइक्रोस्कोपी चैंबर के नीचे कांच मोटाई के अनुसार TIRF फोकस टैब के भीतर TIRF कोण को समायोजित ।
    नोट: LCK-C-आरएफपी के रूप में प्लाज्मा झिल्ली मार्करों TIRF विश्लेषण में प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  10. एक गाऊसी समारोह (विवाह एल्गोरिथ्म) के नकारात्मक सामान्यीकृत दूसरा व्युत्पंन के साथ कनवल्शनफ़िल्टर्स द्वारा गुणवत्ता बढ़ाने के लिए छवि प्रसंस्करण प्रदर्शन ।

4. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. प्लेट mlkl-/- MEFs व्यक्त NBB१४०-2xFV-वीनस एक प्लाज्मा में ५,०००,००० कोशिकाओं के घनत्व पर-लेपित १५० mm सेल संस्कृति पकवान और 12 घंटे के लिए मशीन (चित्रा 3) ।
  2. Doxycycline के साथ कोशिकाओं का इलाज (०.५ μg/एमएल) एनबी1-140की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए-2xFV-वीनस 12 एच के लिए ।
  3. प्रेरित NBB१४०-2xFV-वीनस सक्रियकरण और homodimerizer के 25 एनएम के साथ प्लाज्मा झिल्ली को translocation 5 मिनट के लिए । इस बार लाइव सेल इमेजिंग में मनाया necroptosis के कैनेटीक्स से स्थापित किया गया है ।
  4. मीडिया को निकालें और २.५% glutaraldehyde की 10 मिलीलीटर, ०.१ मीटर सोडियम cacodylate बफर पीएच ७.४ (cacodylate बफर) पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम में 2% paraformaldehyde का उपयोग कर कोशिकाओं को ठीक ।
  5. स्क्रैप और ५०० एक्स जीमें 10 मिनट के लिए नमूने स्पिन द्वारा नमूना ले लीजिए supernatant को त्यागें ।
  6. पोस्टफिक्स में १.५ ज के लिए नमूने को घटाकर 2% आज़मियम tetroxide में १.५% पोटेशियम ferrocyanide के साथ ०.१ मीटर सोडियम cacodylate बफर है । आज़मियम tetroxide एक दाग व्यापक रूप से उनि में इस्तेमाल के लिए विपरीत प्रदान एजेंट है । हम प्रारंभिक विश्लेषण के रूप में इस्तेमाल किया उनि सेल के necroptosis के दौर से गुजर SEM से पहले ।
  7. 5 मिनट के लिए ultrapure पानी में नमूना 5 बार कुल्ला ५०० एक्स जीपर प्रत्येक, बफर में कुल्ला द्वारा पीछा किया (४.६ देखें), पानी, और एक स्वचालित प्रोसेसर पर इथेनॉल । supernatant को त्यागें ।
  8. SEM के लिए, 1% uranyl एसीटेट और सीसा aspartate भारी धातु दाग31के साथ पहले से तय नमूनों दाग ।
  9. शराब और propylene ऑक्साइड समाधान के एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से नमूने निर्जलीकरण ।
  10. एक राल ब्लॉक प्राप्त करने के लिए हार्ड राल३२ में नमूना एंबेड ।
  11. विश्लेषण का सही क्षेत्र निर्धारित करने के लिए ०.५ माइक्रोन की मोटी वर्गों में कटौती ।
  12. कोट विद्युत के एक अल्ट्रा पतली फिल्म के साथ नमूनों का संचालन धातु (इरिडियम) ।
  13. छवि और नमूनों का विश्लेषण (चित्रा 3) । ठहराव के लिए, उजागर कोशिकाओं के साथ राल ब्लॉक सतह के एक कम आवर्धन छवि 5 कीव एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्कैन कर रहा है ।
  14. कल्पना के पार व्यक्तिगत चित्र SEM या इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है एक निरंतर छवि30में एकाधिक क्षेत्रों के दृश्य में शामिल होने का उपयोग किया । मोटे तौर पर १०० कोशिकाओं की पसंद के सॉफ्टवेयर में एक उच्च संकल्प असेंबल पैदा करके इस तरह से necroptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं के अंश का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    ध्यान दें: SEM द्वारा स्कोरिंग आकृति विज्ञान, पूर्व-गल या गल phenotypes की प्रगति के साथ सामान्य कोशिका सुविधाओं की तुलना करता है । इन सुविधाओं microvilli गायब सहित प्लाज्मा झिल्ली परिवर्तन शामिल हैं, समतल, 10 एनएम से आकार में 1 µm को लेकर कोशिकाओं में टूटना, या organelle संरचना के कम से कम 30 में नुकसान-cytosolic सेल क्षेत्र के 40% ।

५. नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) द्वारा MLKL की लिपिड बाइंडिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी

  1. तैयार 15N-लेबल NBB1-156 मानक प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि द्वारा पहले वर्णित के रूप में24।
  2. 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol अमोनियम सॉल्ट (18:0 PI) और 1, के ५०० µ g को भंग 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1 '-myo-inositol) अमोनियम साल्ट (18:1 PI) में ५०० µ एल के बर्फ-शीत CHCl3 प्रत्येक के अंतिम सांद्रता के लिए 1 मिलीग्राम/
  3. Sonicate 1 मिलीग्राम/एमएल 18:0 और एक sonication पानी स्नान में 18:1 PI कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए या एक बर्फ पानी के मिश्रण में 5 मिनट के लिए ।
  4. Aliquot 1 मिलीग्राम/एमएल 18:0 और 18:1 PI व्यक्तिगत एनएमआर अनुमापन श्रृंखला (चित्रा 4) के लिए साफ गिलास शीशियों में । ग्लास एयर तंग सीरिंज का उपयोग कार्बनिक सॉल्वैंट्स में लिपिड स्थानांतरण ।
    1. Aliquot १३२ µ एल के 1 मिलीग्राम/एमएल 18:1 PI (दाढ़ मास = ८८०.१३७ g/मॉल) में CHCl3 १,२०० µ एल के एक अंतिम resuspension मात्रा के लिए १२५ µ m एकाग्रता में ।
      नोट: के लिए 5 मिमी एनएमआर ट्यूबों, के धारावाहिक कमजोर पड़ने की मात्रा तैयार > 1, 000 µ एल और अंतिम एनएमआर नमूना संस्करणों के > 500 µ l 3 मिमी एनएमआर ट्यूबों के लिए, के धारावाहिक कमजोर पड़ने की मात्रा तैयार > 300 µ एल और अंतिम एनएमआर नमूना संस्करणों के > 150 µ एल
  5. Aliquot 1 मिलीग्राम/एमएल सुअर का ब्रेन एल-α-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate में अमोनियम नमक 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2ओ (ब्रेन पीआई (4, 5) पी2) साफ गिलास शीशियों में ।
  6. आर्गन (ए. ए.) या नाइट्रोजन (एन2) के एक गैसीय स्ट्रीम के तहत की शीशियों को कांच की शीशी दीवारों के खिलाफ छप बिना कार्बनिक विलायक वाष्पित करने के लिए मध्यम प्रवाह के साथ जगह है । पांच से तीस मिनट के संस्करणों के लिए आम तौर पर पर्याप्त है 10 – 200 µ एल कार्बनिक विलायक ।
  7. एक Büchner या वैक्यूम कुप्पी बड़ी चिमटी का उपयोग कर के तल पर कांच की शीशी (ओं) की व्यवस्था, एक रबर डाट के साथ सील, और प्लास्टिक एक वैक्यूम लाइन से जुड़े टयूबिंग देते हैं । अवशिष्ट ऑर्गेनिक्स हटाने के लिए रात भर हल्के वैक्यूम के नीचे कुप्पी खाली करें ।
  8. निष्क्रिय गैस के साथ लिपिड फिल्म aliquots ओवरले, एक वाटरप्रूफ ढक्कन के साथ सील, और लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक महीने या-८० डिग्री सेल्सियस के भीतर उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस की दुकान ।
  9. डिटर्जेंट (-Det) के बिना एनएमआर नमूना बफ़र्स तैयार 20 मिमी नाxजyपो4 पीएच ६.८, 10% डी2ओ और के साथ डिटर्जेंट (+ Det) युक्त 20 मिमी नाxजyपो4 पीएच ६.८, 10% डी2ओ, ०.३४ मिमी n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (डीडीएम).
  10. जोड़ें + Det बफर करने के लिए लिपिड फिल्म के साथ कांच की शीशी को प्राप्त करने के लिए वांछित एकाग्रता और sonicate के लिए पानी में स्नान करने के लिए 30 मिनट, बारी sonication के लिए 10 दृश्य निरीक्षण के बाद मिनट ।
    नोट: Sonication गर्म नमूना हो सकता है । अंतिम प्रोटीन नमूना पुनर्गठन से पहले 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान को शांत करने की अनुमति दें ।
  11. के सीरियल कमजोर पड़ने लिपिड-डिटर्जेंट micelles में + Det बफर वांछित एकाग्रता श्रृंखला के लिए 1:1 मिश्रण के sonication का उपयोग कर प्रदर्शन । १२५ से शुरू µ मीटर लिपिड एकाग्रता, तीन पुनरावृत्ति ६२.५ µ मीटर, ३१.३ µ मीटर, और १५.६ µ मीटर लिपिड में ०.३४ मिमी डीडीएम उपज होगी ।
  12. नियंत्रण और संदर्भ एनएमआर प्रोटीन और additives के नमूनों में-Det और + Det बफ़र्स, क्रमशः तैयार करें । + Det बफर में लिपिड के प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए प्रोटीन और additives जोड़ें ।
    नोट: के लिए 15N NBB१५६, प्रोटीन के लिए जोड़ा गया है एक अंतिम एकाग्रता के ४० µ m और पूरक के साथ 2 मिमी deuterated dithiothreitol रखने के लिए Cys अवशेषों को कम.
  13. 5 मिमी या 3 मिमी एनएमआर ट्यूबों के लिए नमूनों की उचित मात्रा स्थानांतरण (५.४ चरण में नोट देखें).
  14. मैन्युअल रूप से एनएमआर साधन में नमूने लोड या ऐसे SampleCase लोडर के रूप में एक स्वचालन मंच में व्यवस्था.
  15. अधिग्रहण समग्र एनएमआर स्पेक्ट्रा 1एच प्रोटॉन स्पेक्ट्रा के लिए मानक पल्स कार्यक्रमों का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में 2 डी 1एच15N सहसंबंध स्पेक्ट्रा के रूप में या तो अनुप्रस्थ विश्राम अनुकूलित स्पेक्ट्रोस्कोपी (TROSY) के रूप में या heteronuclear एकाधिक क्वांटम जुटना (SOFAST-HMQC)३३।
    नोट: 3 मिमी एनएमआर ट्यूबों का उपयोग 1-15n TROSY के लिए ६४ स्कैन की आवश्यकता है (~ 3 एच) या एकएच15एन SOFAST-HMQC (~ ९० मिनट). स्कैन संख्या 5 मिमी एनएमआर ट्यूबों के लिए आधी कर रहे हैं ।
  16. प्रोसेस्ड 2d एनएमआर स्पेक्ट्रा को उपयोगकर्ता के लिए पसंद के विश्लेषण या अन्य सॉफ्टवेयर के लिए एक कारा भंडार३४ में जोड़ा जा सकता है ।
  17. तीन अच्छी तरह से फैलाया और प्रत्येक प्रोटीन राज्य के लिए हल चोटियों के लिए 2 डी एनएमआर अनुनादों व्याख्या द्वारा सॉफ्टवेयर का विश्लेषण । प्रत्येक बफ़र शर्त NBB१५६ युक्त के लिए छह चोटियों में से प्रत्येक के लिए चोटी आयाम रिकॉर्ड (चित्रा 5ए) ।
    1. उपयोग कारा एक बैच एकीकरण सूची तैयार करने के लिए (मुख्य मेनू शीर्षक क्लिक करें "स्पेक्ट्रम । सेटअप बैच सूची "...) सभी स्पेक्ट्रा एकत्र की और एक ही चोटी असाइनमेंट फ़ाइल का उपयोग कर विश्लेषण (मुख्य मेनू शीर्षक क्लिक करें "चोटियों । आयात Peaklist ".. । और एक यूज़र-डिफ़ाइंड चुनें. चोटियों 6 कुल चोटियों के साथ फ़ाइल, प्रत्येक प्रोटीन राज्य के लिए 3, भीतर परिभाषित).
    2. धुन सेटिंग्स ("घालमेल । धुन पीक मॉडल "...) X-चौड़ाई ०.०६ पीपीएम और Y-चौड़ाई ०.३० पीपीएम (मुख्य मेनू शीर्षक क्लिक करें "करनेवाला । धुन पीक मॉडल "...) दो मेनू चयन में अंतिम आउटपुट रिकॉर्डिंग से पहले (1. मुख्य मेनू शीर्षक क्लिक करें "घालमेल । एकीकृत बैच सूची ") (2 । मुख्य मेनू शीर्षक क्लिक करें "चोटियों । निर्यात एकीकरण तालिका ") (चित्रा 5बी) ।
      नोट: अवशेषों के लिए अनुनादों के बीच रीढ़ M21, V53, और L105 NBB१५६ बंद-ब्रेस राज्य के लिए आवंटित किया गया है । ओपन-ब्रेस राज्य अवशेषों की अनुनादों के बीच रीढ़ की G130 और A141 और एप्सिलॉन प्रोटॉन साइड-चेन W133 की प्रतिध्वनि 3d एनएमआर प्रयोगों24का उपयोग करने के लिए सौंपा गया था ।
  18. संदर्भ नमूनों के तीन खुले-ब्रेस आयाम औसत और दो संदर्भों से संबंधित एक सामान्य कारक की गणना करके विभिन्न मैग्नेट या नमूना शर्तों से प्रत्यक्ष तुलना के लिए नमूनों को सामान्य. सामान्य कारक का उपयोग कर NBB१५६ अनुनादों के लिए स्केल्ड आयाम की गणना और शून्य करने के लिए नकारात्मक आयाम की स्थापना (तालिका 2).
    उदाहरण: 1) विभिन्न मैग्नेट से नमूनों की तुलना: चुंबक ए, NBB१५६+ डीडीएम और चुंबक बी, NBB१५६+ डीडीएम. 2) डिटर्जेंट तुलना: ०.३४ एमएम के डीडीएम और १.७ एमएम के डीडीएम ।
  19. प्रत्येक के लिए गणना बंद-या ओपन-ब्रेस के अधिकतम आयाम के लिए न्यूनतम की सीमा के साथ विभाजित करके--या मुक्त NBB१५६ और पूरी तरह से खुला-ब्रेस NBB१५६ के उचित संदर्भ युक्त एकत्र की दूरी के साथ एक प्रतिध्वनि का छोटा अंश डिटर्जेंट.
  20. लिपिड एकाग्रता के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत एनएमआर आयाम साजिश और विभिन्न स्थितियों (चित्रा. 5C) में खुले ब्रेस NBB१५६ के अंश की तुलना करें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, लिपिड एकाग्रता के खिलाफ बंद-ब्रेस अनुरूप के अंश का विश्लेषण१५६NBB के लिए लिपिड बाइंडिंग की तुलना करने के लिए किया जा सकता है । हम पूर्व विश्लेषण पसंद करते हैं क्योंकि यह तेजी से और भिन्न पर बेहतर रिपोर्ट पूरी तरह से लिपिड द्वारा लगे हुए है.

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Representative Results

लाइव कोशिकाओं में विनियमित necroptosis निष्पादन visualizing एक न्यूनतम कटा हुआ MLKL का निर्माण, NBB१४०-2xFV-वीनस की inducible अभिव्यक्ति के माध्यम से संभव हो गया है. यह निर्माण प्लाज्मा झिल्ली permeabilization को प्रेरित करने की क्षमता रखता है और FKBP कैसेट (2xFV) के मंद प्रेरित oligomerization के माध्यम से सक्रिय है । हम निरीक्षण और लाइव सेल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा necroptosis यों तो, निगरानी काइनेटिक (हर 5 मिनट) एक सेल अभेद्य ग्रीन प्रतिदीप्ति डीएनए बाइंडिंग डाई (चित्रा 6ए) के एक । इस inducible प्रणाली बहुत मजबूत है, और पूरा necroptosis mlkl-/ MEFs के भीतर मनाया जा सकता ~ 1 oligomerization के मंद मध्यस्थता Dox पर--की-की-प्री-की कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस NBB१४०-2xFV-वीनस (चित्रा 1A ). हम फास्ट-कैनेटीक्स necroptosis के रूप में इन शर्तों को देखें । शुक्र की अभिव्यक्ति अकेले ± मंद या NBB१४०-2xFV-शुक्र मंद के अभाव में necroptosis प्रेरित नहीं किया (चित्रा 6ए) । हम आमतौर पर तपसिल या quadruplicate में 24-, ९६-, या ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों में दोहराने इमेजिंग प्रयोगों में से एक प्रदर्शन ।

NBB१४०-2xFV-वीनस (चित्रा 6ए) के प्रवर्तित dimerization से प्रेरित तेज-कैनेटीक्स necroptosis प्लाज्मा झिल्ली टूटना के MLKL ख्यात के रूप में जल्लाद की भूमिका का समर्थन करता है । NBB१४०के पुनर्वितरण की कल्पना करने के लिए-2xFV-वीनस necroptosis के दौरान प्लाज्मा झिल्ली के लिए, लाइव सेल फोकल माइक्रोस्कोपी वीनस प्रतिदीप्ति की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है. तेजी के दौरान-कैनेटीक्स necroptosis, 2 के भीतर-मंद के साथ मशीन के 3 मिनट, सेल परिधि के वीनस कोटिंग, क्रमिक सेल गोलाई (फिल्म 1) के बाद मनाया जाता है । NBB१४०-2xFV प्लाज्मा झिल्ली पर वीनस संचय TIRF फोकल माइक्रोस्कोपी, जो cytosol-प्लाज्मा झिल्ली ग्लास इंटरफेस पर सेल मात्रा पर ध्यान केंद्रित द्वारा कल्पना की है । प्लाज्मा झिल्ली-जुड़े वीनस puncta 1 के भीतर दिखाई दे रहे हैं-2फिल्म (2) मंद के साथ मशीन के मिनट । इस प्रकार, NBB१४०के प्रबलित oligomerization-2xFV-वीनस प्लाज्मा झिल्ली को अपनी तेजी से पुनर्वितरण लाती है ।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) necroptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं में रूपात्मक परिवर्तन प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । फास्ट necroptosis के तहत NBB१४०-2xFV-वीनस के oligomerization द्वारा प्रेरित, कोशिकाओं सामान्य लम्बी आकृतियों (समय 0 मिनट) से गोल और (5 मिनट) के लिए आंशिक रूप से उठी (10 मिनट) और बड़े पैमाने पर ध्वस्त जहां cytosol है आकृति विज्ञान बदल लुप्त (20 मिनट) (चित्रा 6बी) । SEM लाइव सेल माइक्रोस्कोपी correlating MLKL स्थानीयकरण से पिछले टिप्पणियों पूरक झिल्ली टूटना के साथ प्लाज्मा झिल्ली के लिए । कुल मिलाकर माइक्रोस्कोप तकनीक प्रस्तुत की पेशकश के लिए पूरक का मतलब है की निगरानी, मूल्यांकन और सेलुलर स्तर पर necroptosis मात्रा और NBB१४०-2xFV-वीनस प्लाज्मा झिल्ली टूटना के निष्पादन में फंसाने ।

निर्धारित करने के लिए यदि MLKL सीधे प्लाज्मा झिल्ली हम इन विट्रो लिपिड बाध्यकारी प्रयोगों एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी रिकॉमबिनेंट NBB१५६का उपयोग करके निगरानी में प्रदर्शन से संपर्क कर सकते हैं । लिपिड-डिटर्जेंट micelles के सीरियल कमजोर पड़ने, डिटर्जेंट की एक निरंतर एकाग्रता का उपयोग (लिपिड प्रस्तुति के लिए वाहन) और चर लिपिड सांद्रता, के लिए बाध्यकारी के लिए परीक्षण कर रहे हैं 15N-लेबल NBB१५६ 2d एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, जो प्रोटीन में बाध्यकारी प्रेरित परिवर्तन पर नज़र रखता है । NBB१५६ निरोधात्मक ब्रेस् ट क्षेत्र (एमिनो एसिड 132-156) को बंद और पेचदार (बंद ब्रेस् ट) को खुले और आंतरिक रूप से परिक्रमा करने वाले विस्थापन (ओपन ब्रेस) से विस्थापित करने के लिए लिपिड बाइंडिंग पर से बहोत प्रमुख संरचनात्मक परिवर्तन (चित्रा 7 क). दो आयामी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी दोनों अनुरूपता (आंकड़े 7B-7C) के मिश्रण पर अवशेषों की जानकारी प्रदान करता है । हम पहले दोनों अनुरूप24के बीच की रीढ़ सौंपा । हम एक दिए गए नमूने में बंद और खुले क्षेऽ के प्रतिशत की निगरानी आसानी से कर सकते है जैसा कि आंकड़े 5 ए-सीमें वर्णित है । इस बाध्यकारी परख का प्रयोग, हम NBB१५६ डीडीएम डिटर्जेंट, जो NBB१५६ बाध्यकारी (चित्रा 5बी) को निष्क्रिय है में PIPs के लिए बाध्यकारी का पता लगाने । इस परख में, रंज2 सबसे अच्छा NBB१५६ ligand, जो १२५ µ मीटर (चित्रा 5सी) में निरोधात्मक संभालो की पूर्ण खोलने लाती है । इसके विपरीत, संतृप्त (18:0) pi और संतृप्त (18:1) pi गरीब NBB१५६ लाइगैंडों एक ही स्थिति (चित्रा 5सी) के तहत आंशिक ब्रेस खोलने उत्प्रेरण कर रहे हैं । हमारे एनएमआर आधारित लिपिड बाध्यकारी परख फॉस्फोलिपिड के साथ MLKL NBB१५६ की बातचीत के लिए सबूत का समर्थन प्रदान करता है और MLKL और प्लाज्मा झिल्ली के बीच एक सीधा लिंक पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: स्थिर सेल लाइन एक संशोधित Tet-3 जी inducible प्रणाली पर बंदरगाह । (क) स्थिर कोशिका रेखाएँ retroviral transduction द्वारा उत्पन्न की गई थीं mlkl-/- MEFs के साथ pTREX-rtTA-विस्फोट के बाद pRetroX-TRE3G-NBB१४०-2xFV-शुक्र-पूरो. प्रत्येक transduction बाद विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ने से पहले 1 सप्ताह के लिए एंटीबायोटिक चयन के बाद किया गया था । (ख) inducible MLKL अभिव्यक्ति प्रणाली का योजनाबद्ध निरूपण. इस प्रणाली पर आधारित है 2 औषध-inducible विनियामक कदम: i) MLKL जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन उत्पादन (+ Dox) और द्वितीय) oligomerization द्वारा सक्रियण (+ मंद) । जब प्रोटीन उत्पादन अग्रिम में प्रेरित है, + Dox, फास्ट-कैनेटीक्स necroptosis ट्रिगर किया जा सकता है, + मंद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : फास्ट-कैनेटीक्स necroptosis के लाइव सेल इमेजिंग MLKL के तेजी से झिल्ली relocaliz का पता चलता है. (क) चित्रा 1b के रूप में फास्ट-कैनेटीक्स necroptosis प्रेरित एक इमेजिंग प्रणाली में निगरानी की जा सकती है । Necroptosis सेल के ऊपर से रन बनाए है-अभेद्य हरी फ्लोरोसेंट डाई । (ख) epifluorescence और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ फास्ट-कैनेटीक्स necroptosis के लाइव सेल इमेजिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) नमूना तैयारी और विश्लेषण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । चित्रा 1 में वर्णित के रूप में तेजी से कैनेटीक्स necroptosis प्रेरित से कोशिकाओं मंद के अलावा अलग समय अंक पर प्लेट पर तय कर रहे हैं । कोशिकाओं तो परिमार्जन और पूलिंग द्वारा SEM विश्लेषण के लिए तैयार हैं, भारी धातु धुंधला, राल embedding, और इरिडियम कोटिंग के रूप में खंड 4 में वर्णित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: नमूना तैयारी और 15एन NBB१५६ और लिपिड-डिटर्जेंट micelles के एनएमआर titrations के लिए डेटा संग्रह. इस परख और विश्लेषण आमतौर पर 3 में प्रदर्शन किया है-4 दिन: 1 दिन के दौरान, लिपिड aliquots तिरस्कृत और रातोंरात सूख रहे हैं । 2 दिन के दौरान, लिपिड फिल्मों परख बफर ± डिटर्जेंट, sonicated में rehydratेड हैं, और प्रश्नपत्र पतला (दो गुना) लिपिड मुक्त बफर समाधान के साथ rehydratेड लिपिड समाधान के बराबर मात्रा में मिश्रण से । प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए सजातीय मिश्रण और डिटर्जेंट micelles में लिपिड का वितरण बाद में कमजोर पड़ने से पहले सुनिश्चित करने के लिए sonicated है । प्रोटीन के नमूनों सीरियल लिपिड-डिटर्जेंट micelle कमजोर पड़ने में मिश्रित कर रहे हैं, उपयुक्त एनएमआर ट्यूबों में भरी हुई, एक SampleCase लोडर में रखा (या मैंयुअल रूप से भरी हुई), और स्वत: एनएमआर डेटा संग्रह शुरू कर दिया है । बाद के दिनों के दौरान, एनएमआर डेटा संग्रह पूरा हो गया है और 2d एनएमआर विश्लेषण द्वारा पीछा किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : लिपिड NBB१५६ के बाध्यकारी वरीयताओं 2d एनएमआर का उपयोग कर मापा । (क) आरोपित 1एच-15एन TROSY स्पेक्ट्रा के लिए 15एन-NBB१५६ में उपस्थिति (लाल) या अनुपस्थिति (नीला) १२५ µ एम PI (4, 5) पी2 में ०.३४ mM अनुकारा में visualized । (ख) आयाम माप और सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल अनुनादों के एक आयामी स्लाइस. कच्चे स्पेक्ट्रम (हरा) कार्यक्रम कारा द्वारा आयाम और एकीकरण के लिए सीमा के साथ मढ़ा है । (ग) phosphoinositide-डीडीएम micelles की उपस्थिति में NBB१५६ के सामान्यीकृत आयाम लिपिड एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची । रंज2 ब्रेस का पूरा उद्घाटन लाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : व्रत-कैनेटीक्स necroptosis के oligomerization द्वारा प्रेरित NBB१४०-2xFV-शुक्र में mlkl -/ MEFs. (क) कोशिका-अभेद्य, डीएनए-बाध्यकारी हरी फ्लोरोसेंट डाई के उच्च प्रवाह प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा Necroptosis ठहराव । मजबूत necroptosis प्रेरण केवल NBB१४०-2xFV-वीनस के मंद प्रेरित oligomerization पर मनाया जाता है, लेकिन मंद के अभाव में नहीं । वीनस-केवल नियंत्रण प्रयोगों भी प्रदर्शन कर रहे हैं । सभी शर्तों तपसिल में किया जाता है और एक प्रतिनिधि दोहराने से औसत और एसडी के रूप में रची जाती है । (ख) फास्ट-कैनेटीक्स necroptosis की उपस्थिति में प्रेरित मंद स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ visualized. समय पाठ्यक्रम रूपात्मक सेल गोलाई और सूजन (5 मिनट), प्लाज्मा झिल्ली का टूटना (10 मिनट), और cytosol (20 मिनट) के पूरा extravasation सहित अंतर्निहित necroptosis परिवर्तन का पता चलता है । प्रत्येक नमूना समय 0 मिनट पर कक्षों के समान संख्या थी । बाएं से दाएं, ज़ूम की गई क्षेत्र में 26, ३२, 23, और नाभिक के साथ ३६ कक्ष हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : NBB१५६ के बंधन एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा निगरानी phosphoinositides के लिए । (A) 1H-15n TROSY स्पेक्ट्रम ऑफ़ 15n-NBB१५६. बंद ब्रेस स्पेक्ट्रम या खुले राज्य के ठहराव के सामान्यीकरण के लिए प्रयुक्त अनुनादों की रासायनिक पारियों को क्रमशः चौकों या गोलों के साथ हाइलाइट किया जाता है । सही, एनएमआर हस्ताक्षर का योजनाबद्ध अभाव या लिपिड की उपस्थिति-डिटर्जेंट micelles में पाया गया । NBB१५६ phosphoinositides के अभाव में डीडीएम डिटर्जेंट micelles को नहीं बांधता । (ख) आरोपित १एच-१५एन TROSY स्पेक्ट्रा १५एन-NBB१५६ की उपस्थिति में संबंधित लिपिड-डिटर्जेंट micelles. (ग) एकल 1एच-15एन TROSY स्पेक्ट्रा 15एन-NBB१५६ की उपस्थिति में संबंधित लिपिड-डिटर्जेंट micelles से पैनल बी. खुले और बंद संरचनाओं का पता लगाने से दो संरचनाओं के मिश्रण में स्पष्ट रूप से हम एक दिए गए नमूने में दो अनुरूपता के प्रतिशत यों तो कर सकते हैं । PIP2 MLKL और प्लाज्मा झिल्ली फॉस्फोलिपिड के बीच एक सीधा लिंक प्रदान१५६ NBB के पसंदीदा लिपिड ligand है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पीसीआर बफर (10x) ५.० µ l
डीएनए टेंपलेट (१०० एनजी/µ एल) १.० µ l
MLKL, 2x FKBP, वीनस के लिए cDNAs)
dNTPs (२५ मि. मी. प्रत्येक NTP) ०.५ µ l
पीसीआर प्राइमर आगे (एफ) (१०० एनजी/µ एल) १.३ µ l
पीसीआर प्राइमर आगे (FR (१०० एनजी/µ एल) १.३ µ l
NBB१४० च ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT
NBB१४० आर TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC
2xFKBP च ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT
2xFKBP आर TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC
शुक्र च ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG
वीनस आर TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC
डीएनए पोलीमरेज़ (२.५ यू/µ एल) १.० µ l
आसुत जल (ddH2O) ३९.९ µ l
कुल प्रतिक्रिया की मात्रा ५०.० µ l
पीसीआर साइकलिंग पैरामीटर्स
1 चक्र 94-98 ° c; ४५ s
25 – 30 चक्र 94-98 ° c; ४५ s
५८ ° c; ४५ s
७२ ° c; 1-2 मिनट
1 चक्र ७२ ° c; 10 min

तालिका 1: नायब की पीसीआर प्रतिक्रिया १४० -2xFV-वीनस pRetroX-TRE3G में प्रतिबंध एंजाइम आधारित क्लोनिंग के लिए ।

Table 2
तालिका 2: एनएमआर स्पेक्ट्रा के लिए कच्चा डेटा चित्रा 5 में प्रस्तुत की गणना औसत ओपन ब्रेस राज्य के लिए एक दूसरे एनएमआर चुंबक से एकत्र डेटा के सामान्यीकृत रूपांतरण illustrating । इस तालिका का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Movie 1
फिल्म 1: फास्ट-कैनेटीक्स necroptosis प्रेरित द्वारा oligomerization के NBB १४० -2xFV-शुक्र असावा mlkl-/ MEFs । लाइव फोकल माइक्रोस्कोप oligomerization डोमेन के FKBP लागू करने के बाद प्लाज्मा झिल्ली को cytosol से NBB१४०-2xFV-वीनस के तेजी से translocation दिखा. कक्ष चित्रा 1 में वर्णित के रूप में इलाज किया गया । पीला: NBB१४०-2xFV-शुक्र । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
Movie 2: व्रत की TIRF माइक्रोस्कोपी-कैनेटीक्स necroptosis. TIRF माइक्रोस्कोपी तेजी से दिखा रहा है (~ 2 मिनट) स्थानीयकरण और MLKL की MLKL-/- MEFs NBB१४०-2xFV-वीनस के लिए मंद के अलावा पर प्लाज्मा झिल्ली पर एकत्रीकरण । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

हम तकनीक है कि हम प्लाज्मा झिल्ली टूटना24के ख्यात जल्लाद के रूप में फंसाया MLKL के लिए संयुक्त के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । MLKL-मध्यस्थता necroptosis को विनियमित करने वाले विनियामक नेटवर्क को समझने के अलावा, इन तकनीकों को अन्य उपयुक्त जैविक प्रणालियों को वर्गीकृत करने के लिए स्वतंत्र रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है । व्यावहारिक रूप से बोल रहा हूं, इन तकनीकों को मध्यम से कम प्रवाह खोज उपकरण हैं ।

हम नियमित रूप से इस्तेमाल किया लाइव सेल इमेजिंग NBB१४०-2xFV-वीनस-मध्यस्थता necroptosis, और है कि अन्य MLKL constructs द्वारा प्रेरित, mechanistically काटना के माध्यम से MLKL के विनियमन necroptosis के लिए और छोटे अणु रासायनिक का उपयोग करके जांच. विशेष रूप से, हम और अंय समूहों का प्रदर्शन किया है कि मानव और माउस MLKL के निर्माण कि NBB के ंयूनतम क्षेत्र में मानव और माउस सेल लाइनों में necroptosis मध्यस्थता कर सकते हैं । एक सूचना MLKL शासी-मध्यस्थता necroptosis RIPK3 और MLKL बातचीत की प्रजातियों विशिष्टता है, जो पार से रोकता है प्रजातियों के बीच जेट TNF के संयोजन से ऊपर उत्तेजना पर मनाया, smac mimetics, और caspase निषेध 25,३५,३६. तदनुसार, मानव और माउस RIPK3 और MLKL प्रोटीन पार नहीं इन शर्तों के तहत प्रतिक्रिया25,३५,३६। के लिए अंतर प्रजातियों सीमाओं बाईपास, हम उत्परिवर्तनों कि मानव MLKL को सक्रिय करने या oligomerization कैसेट्स का उपयोग के रूप में NBB१४०-2xFV-वीनस24के लिए यहां दिखाया गया परिचय । मानव NBB१४० एक निर्माण है कि निरोधात्मक क्षेत्र को बनाए रखता है और इसलिए NBB१४०-2xFV-वीनस के संदर्भ में निष्क्रिय रहता है । 2xFV के Dimerization को ब्रेस् ट रिलीज कर NBB१४० एक्टिवेट करने का सोचा है । इसके विपरीत, मानव NBB१८२ oligomerization के अभाव में भी necroptosis लाती है, क्योंकि इस निर्माण के लिए सहज24oligomerize करने में सक्षम है । इसके अलावा, बिंदु म्यूटेंट (R30A, R30E, E136A, और E136R) पूर्ण लंबाई मानव MLKL के संदर्भ में एनबी क्षेत्र को सक्रिय RIPK3 फास्फारिलीकरण24द्वारा सक्रियण के लिए की आवश्यकता पर काबू पाने । इसके अलावा, हम dimerizable मानव RIPK3 (आसमानी-2xFV-RIPK3) का पुनर्गठन किया और Dox-inducible पूर्ण लंबाई मानव MLKL-शुक्र है, जो संगत कर रहे हैं और मजबूती से necroptosis में RIPK3 प्रेरित- / MLKL-/ -MEFs24 . दूसरों को हाल ही में अतिरिक्त उत्परिवर्तनों या मानव माउस डोमेन बदली MLKL constructs कि प्रजातियों विशिष्टता25बाधाओं को दूर कर सकते है पता चला ।

हम आम तौर पर कई रेंज प्रदर्शन-९६ में प्रयोग खोज-अच्छी तरह से प्लेटें द्वारा necroptosis परख शर्तों का अनुकूलन । हम तो 24 अच्छी तरह से प्लेटों में अनुकूलित प्रयोगों, जो पूरक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के साथ साथ मल्टीप्लेक्स के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्रदान करने के साथ अनुवर्ती एक ही नमूने पर बाद में प्रदर्शन इमेजिंग के तुरंत बाद अंतिम समय बिंदु । वर्तमान में, लाइव सेल इमेजिंग हरे और लाल प्रतिदीप्ति का पता लगाने पर आधारित है, कई अनुप्रयोगों के लिए लेबलिंग संभावनाओं को सीमित. हरी फ्लोरोसेंट रंजक के लिए एक आम विकल्प सेल-अभेद्य डीएनए है-फ्लोरोसेंट डाई propidium आयोडाइड (PI) बाध्यकारी है । दोहरी रंग इमेजिंग उपकरणों पूरक हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ इन रंगों का उपयोग करने के लिए उपयोगिता और necroptosis इमेजिंग की जानकारी सामग्री को बढ़ाने का विकल्प प्रदान करते हैं ।

MLKL की क्षमता अपने सक्रियण के बाद प्लाज्मा झिल्ली को translocate करने के लिए, जीना माइक्रोस्कोपी इस प्रोटीन के जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए पसंद की तकनीक बनाता है और वास्तविक समय में पालन करने के लिए रूपात्मक अंतर्निहित necroptosis परिवर्तन । TIRF माइक्रोस्कोपी स्पष्ट रूप से प्लाज्मा झिल्ली पर MLKL प्रोटीन समुच्चय का निराकरण करता है, खासकर जब मार्करों की उपस्थिति में मार डाला है कि सह स्थानीयकरण प्लाज्मा झिल्ली के लिए । हम प्लाज्मा झिल्ली सह स्थानीयकरण24के लिए एक मार्कर के रूप में LCK-सी-आरएफपी का इस्तेमाल किया । विभिंन fluorophores के साथ ब्याज की प्रोटीन टैग करने की क्षमता, भी एक ही प्रक्रिया में शामिल कई प्रोटीन की गतिविधि समवर्ती अध्ययन करने की अनुमति देता है । सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी की अगली पीढ़ी आंशिक रूप से मानक फोकल माइक्रोस्कोपी में विवर्तन सीमा समस्या पर काबू पा लिया और MLKL की अतिरिक्त सुविधाओं को प्रकट करने की क्षमता है-मध्यस्थता necroptosis.

necroptosis की पहचान की एक प्लाज्मा झिल्ली permeabilization है । यहां तक कि अगर कई तकनीक परोक्ष रूप से कर सकते है या झिल्ली टूटना संकेत मिलता है, केवल उंहें प्लाज्मा झिल्ली MLKL द्वारा प्रेरित अखंडता में विच्छेदन कल्पना कर सकते हैं । जबकि उनि संकल्प की उच्चतम शक्ति है, SEM बड़ा नमूना क्षेत्रों को मैप करने की क्षमता है । यह सुविधा, नए और शक्तिशाली सॉफ्टवेयर के विकास के साथ संयुक्त करने के लिए डेटा की अधिक से अधिक मात्रा का प्रबंधन कर, सेल आकृति विज्ञान के लक्षण वर्णन में SEM की उपयोगिता बढ़ाया है । इसके अलावा, SEM भी लगातार नमूना जब ऐसी केंद्रित आयन बीम के रूप में अंय प्रणालियों के लिए युग्मित 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति वर्गों को स्कैन करने में सक्षम है । EM विश्लेषण की कमियां में से कुछ उपकरण और रखरखाव, अत्यधिक विशिष्ट कर्मचारियों की आवश्यकता की लागत, और नमूना प्रसंस्करण और विश्लेषण में महत्वपूर्ण समय निवेश शामिल हैं ।

डॉट दाग परख मूल MLKL और प्लाज्मा झिल्ली फॉस्फोलिपिड16,27के बीच सीधे संपर्क बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हमारे एनएमआर आधारित लिपिड बाध्यकारी परख निश्चित फॉस्फोलिपिड बंधन में MLKL फंसाना, पसंद के MLKL ligand के रूप में रंज2 पर प्रकाश डाला । हमारे परिणाम phosphatidylinositol करने के लिए NBB१५६ बंधन पर acyl श्रृंखला संतृप्ति के एक बचके प्रभाव प्रदर्शित करता है । फिर भी, कैसे MLKL2रंज करने के लिए बाध्यकारी है, और संभावित अंय फॉस्फोलिपिड, प्लाज्मा झिल्ली टूटना में परिणाम अज्ञात रहता है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी अंय फॉस्फोलिपिड MLKL के लिए बाध्यकारी के लिए परीक्षण किया जा सकता है । हमारे परख MLKL-मध्यस्थता necroptosis के उभरते मॉडलों के परीक्षण के लिए एक महान उपकरण के रूप में कार्य करता है, के रूप में यह MLKL और विभिंन लाइगैंडों के म्यूटेंट के साथ प्रयोग किया जा सकता लिपिड बाध्यकारी करने के लिए विशिष्ट योगदान तुच्छ । इसके अतिरिक्त, यह किसी भी अंय झिल्ली संबद्ध प्रणालियों के लिए उनके लिपिड बाध्यकारी प्रोफाइल पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

कोई.

Acknowledgments

कोई.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3G Clontech 631188
Tet-On transactivator plasmid Llambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- Dillon et al., 2014
Blasticidin S Hydrochloride Thermo Fisher Scientific BP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
Doxycycline Clontech 631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187 Takara 635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific S7020
Syto16 Thermo Fisher Scientific S7578
NMR
15 N Ammonium Chloride Cambridge Isotope Laboratories NLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTT Cambridge Isotope Laboratories DLM-2622-1
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace D310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) Avanti Polar Lipids 850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) Avanti Polar Lipids 850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOM Essen BioScience, Inc. Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam  Thermo Fisher Scientific Electron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) Essen BioScience, Inc. http://www.essenbioscience.com Imaging analysis
FEI MAPS Thermo Fisher Scientific https://www.fei.com/software/maps/ EM analysis
TopSpin v3.2 Bruker BioSpin http://www.bruker.com NMR data collection
CARA v1.9.1.7 http://cara.nmr.ch/  NMR data analysis
Slidebook 3i (Intelligent Imaging Innovations) https://www.intelligent-imaging.com/slidebook Confocal microscopy

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References

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जीव विज्ञान अंक १३८ Necroptosis मिश्रित वंश kinased डोमेन की तरह (MLKL) प्लाज्मा झिल्ली permeabilization लाइव सेल माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी phosphoinositides
Necroptosis में MLKL-मध्यस्थता प्लाज्मा झिल्ली टूटना का लक्षण वर्णन
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McNamara, D. E., Quarato, G., Guy,… More

McNamara, D. E., Quarato, G., Guy, C. S., Green, D. R., Moldoveanu, T. Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis. J. Vis. Exp. (138), e58088, doi:10.3791/58088 (2018).

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