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Biology

Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis

Published: August 7, 2018 doi: 10.3791/58088
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Divulgamos los métodos para la caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en necroptosis incluyendo proyección de imagen de la microscopia convencional y confocal de células vivas, análisis de microscopia electrónica y enlace de lípidos basada en NMR.

Abstract

Necroptosis es una vía de muerte celular programada desencadenada por la activación de los receptores interactúan quinasa 3 (RIPK3), que fosforila y activa la pseudokinase quinasa-como dominio de linaje mixto, MLKL, ruptura o permeabilizar la membrana plasmática . Necroptosis es un inflamatorio asociado a múltiples patologías, incluyendo autoinmunidad, enfermedades infecciosas y cardiovasculares, derrame cerebral, neurodegeneración y cáncer. Aquí, describimos protocolos que pueden utilizarse para caracterizar MLKL como el verdugo de la ruptura de la membrana plasmática de la necroptosis. Visualizamos el proceso de la necroptosis en las células usando proyección de imagen de células vivas con microscopía de fluorescencia confocal y convencionales y en células fijas usando microscopia electrónica, que reveló a la redistribución de MLKL desde el citosol al plasma membrana antes de la inducción de grandes agujeros en la membrana plasmática. Presentamos en vitro el análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) con lípidos para identificar supuestos moduladores de la necroptosis MLKL mediada. Basado en este método, identificamos cuantitativas preferencias de unión a lípidos y fosfatidil-inositol fosfatos (PIPs) como crítico aglutinantes de MLKL que se requieren para targeting de membrana plasmática y permeabilización en necroptosis.

Introduction

Identificación de componentes genéticos de la necroptosis ha facilitado el uso de modelos animales para probar la implicación de la necroptosis en fisiología y enfermedad1,2,3,4,5. Nocaut de RIPK3 o MLKL en ratones tenía implicación mínima en desarrollo y adulto homeostasis sugiriendo que necroptosis no es esencial para la vida3,6. Por otra parte, algunas especies no contienen genes RIPK3 o MLKL, apoyando la función de no esenciales de la necroptosis en animales7,8. Por otro lado, desafiando los modelos animales knockout con diversas patologías inducidas en el laboratorio ha revelado un papel importante de la necroptosis en inflamación, la inmunidad innata y la infección viral9,10, 11 , 12.

Necroptosis puede activarse de varias maneras mediante señales a través de sensores de diferentes inmunidad innata, todos los cuales resultan en la activación de RIPK31,13,14. RIPK3 activa a su vez fosforila y activa MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. El más estudiado, y tal vez lo más complejo, conduciendo a la activación de RIPK3 implica la muerte del receptor la ligadura, que bifurca en base a la composición aguas abajo de los complejos de señalización o inducir apoptosis o necroptosis1. Necroptosis sobreviene cuando señalización mediante RIPK1 se favorece y da lugar a compromiso de RIPK319,20. Este resultado es fácilmente favorecido sobre inhibición farmacológica o genética supresión de caspasa 8, un inhibidor endógeno putativo de la necroptosis que mantiene necroptosis en Bahía. RIPK1 ata a y activa RIPK3. Otra manera de activar necroptosis es a través de receptores Toll-like TLR3/TLR4 señalización, que se activa y activa RIPK3 TIR-dominio-que contienen adaptador induce interferón-β (TRIF)21. Sin embargo, otra forma de morir por necroptosis es por activación del sensor de ADN DAI, que directamente se activa y activa RIPK322.

MLKL es una proteína citosólica compuesta por un dominio N-terminal hélice paquete (NB) y un dominio de pseudokinase C-terminal (psKD) Unidos por una abrazadera reguladora región3. En las células normales, MLKL se encuentra en el citosol donde se cree que en un complejo inactivo con RIPK314. Activación de la necroptosis desencadena la fosforilación RIPK3 de MLKL en el circuito de activación de la psKD y potencialmente otros sitios en la NB y soporte3,15,23. La fosforilación induce un cambio conformacional en MLKL que produce disociación de RIPK314. Cambios conformacionales mal entendidos suelte la abrazadera del psKD24. El soporte, que contiene 2 hélices, media Oligomerización de MLKL en un trímero putativo el C-terminal hélice25. La hélice N-terminal de la abrazadera inhibe el dominio NB, que es esencial para la permeabilización de la membrana24,26. En aislamiento, dominio NB es suficiente para inducir la permeabilización de la membrana plasmática y necroptosis16,24,27. La actividad de pro-necroptotic de nota fue reconstituida en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en MLKL (mlkl- / - MEFs). NB es un dominio de unión a lípidos que compromete preferentemente el difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP2). Hemos propuesto un mecanismo paso a paso de activación de MLKL, donde Oligomerización de apoyo facilita el reclutamiento de MLKL a la membrana plasmática a través de las interacciones débiles de NB con el PIP2 grupo de cabeza polar24. En la membrana, el NB somete a exposición regulada de un sitio de unión de alta afinidad adicional PIP2, el que es enmascarado por la rodillera en MLKL inactivo. En general, las múltiples interacciones de NB con PIP2 desestabilizan la membrana del plasma a su ruptura, aunque no ha aclarado el mecanismo molecular de estos eventos.

Aquí ilustran métodos específicos utilizados para caracterizar la función de MLKL como verdugo de la necroptosis24. En particular, nos centramos en el más mínimo dominio MLKL, NB y ortesis (NBB), que está regulado por la inhibición de la rodillera y pueden activarse a través de la dimerización forzada para inducir necroptosis y ruptura de la membrana plasmática. Describimos nuestro sistema de expresión inducible con forzada dimerización de FKBP-mediada inducida por medicamentos para la proyección de imagen de células vivas y la microscopia electrónica de las células que experimentan necroptosis. Además, ilustramos nuestro análisis en vitro NMR de las interacciones de NBB con fosfatidilinositoles (PIPs).

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Protocol

1. clonación y generación de la línea de la célula

  1. PCR amplifica la región NBB, correspondiente a residuos de aminoácidos 1-140 (NBB140), de humano cDNA MLKL para marco estándar basados en la enzima de la restricción la clonación con la Oligomerización dominio 2 x FK506 proteína de unión (2xFKBP o 2xFV) y Venus fluorescente proteína en la doxiciclina (Dox) - inducible vector retroviral pRetroX-TRE3G para obtener NBB140- 2xFV-Venus (tabla 1, figuras 1A-B).
  2. Inmortalizar la primaria mlkl- / - o ripk3- / - mlkl- / - ratón embrionarios fibroblastos (MEFs) obtenidos de los respectivos ratones disponibles en el laboratorio verde por transfección transitoria con antígeno SV40 grande expresando el plásmido. Seleccionar las células inmortalizadas en ~ 1-2 semanas y mantener en DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM y aminoácidos no esenciales en 37 ° C y 5% de CO2 en tejido estándar incubadoras de cultivo.
  3. Transduce inmortalizó SV40 mlkl- / - MEFs con el transactivator de tetraciclina inversa controlada (rtTA)-que contienen retrovirus de un plásmido que contiene el gen de resistencia blasticidin (nuestro plásmido modificado) y tratar de 1 semana con 5 μg/mL blasticidin para seleccionar las células que expresan estable rtTA28.
  4. Transduce las MEFs rtTA expresando con el Dox-inducible vector retroviral conteniendo la quimérica MLKL (NBB pRetroX140-2xFV-Venus-puro) y seleccione con 4 puromicina μg/mL para una semana, 2 días después de la transducción de señales.

2. proyección de imagen de microscopia células vivas de la Necroptosis MLKL mediada

  1. Placa mlkl- / - MEFs expresando NBB140-2xFV-Venus en densidades de 50.000 células por pocillo (1 mL/pocillo) de 24 bien las placas e incubar durante una noche (figura 2A). Utilizar la tinción de células vivas para el recuento de células automatizado (véase Tabla de materiales).
  2. Tratar células por 12 h con Dox (0,5 μg/mL) para inducir la expresión de NBB140-2xFV-Venus.
  3. Inducir la necroptosis con 25 dimerizer FKBP nM (Dim) además de fluorescente verde membrana impermeable de 25 nM (véase Tabla de materiales) del tinte en DMEM estándar (véase 1.2). Las células que experimentan necroptosis acumulan el tinte como está comprometida su integridad de la membrana plasmática por NBB140-mediada por la ruptura. Realizar ensayos en triplicado o cuadruplicado.
  4. Para supervisar necroptosis mediante sistemas de imagen de color solo o dual (véase Tabla de materiales), coloque los vasos en la respectiva unidad de imagen en una incubadora de cultivo de tejidos de mamíferos.
  5. Abra el software (véase Tabla de materiales) y seleccione la ficha calendario próximas exploraciones bajo la lista de tareas.
    Nota: este protocolo es para proyección de imagen usando sistemas del solo-color, pero un software similar está disponible para sistemas de dos colores.
  6. Seleccione la "bandeja, recipiente, tipos de análisis" y el "patrón de análisis" en la ficha "Diseño físico" y el "Rápido de la fluorescencia" en la ficha Propiedades.
  7. Añadir "Scan Time" haciendo clic en la ventana de "Timeline" y el número total de puntos de tiempo y frecuencia de adquisición (típicamente 1 adquisición cada 0.5 h a 1 h 6 h a 12 h o cada 5 min para rápida cinética necroptosis) y comenzar la adquisición de la imagen seleccionando "App ly"(botón rojo).
  8. Cuantificar necroptosis utilizando el software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales) seleccionando desde el "panel de tareas", "Análisis de nueva cuenta objeto con umbral fijo de segmentación por encima del nivel de fondo", que puede ser determinada por rondando la cursor del ratón sobre las regiones de fondo en varias imágenes utilizadas en el análisis.
  9. Examinar objetos fluorescentes seleccionando Previewing usando imagen actual y perfeccionar los niveles de umbral según sea necesario.
  10. Integrar cuentas de fluorescencia verde abriendo la pestaña de "Lanzamiento de un nuevo análisis", elija el "intervalo de tiempo", seleccione los pozos analizados, introduzca el "nombre de trabajo de análisis" y pulse "OK".
  11. Acceso analizaron datos de la pestaña "Análisis de puestos de trabajo" por hacer doble clic sobre el nombre del respectivo trabajo y exportar de la ventana de gráfico y exportación para análisis adicional en software gráficos externo (véase Tabla de materiales).
  12. Cuantificar datos como fluorescencia verde positivo (+ ve) cuentas/mm2 o normalizar las cuentas por confluencia y expresar los datos como fluorescencia verde + ve cuentas/confluencia.
  13. Opcionalmente, en el extremo experimental, teñir células con 100 nM del membrana-permeant verde fluorescente tinte (véase Tabla de materiales). Normalizar datos % necroptotic células como el cociente de la fluorescencia fluorescencia verde al final.

3. células vivas la microscopia Confocal imagen de reclutamiento de la membrana plasmática y permeabilización por MLKL

  1. Placa mlkl- / - MEFs expresando NBB140-2xFV-Venus con una densidad de 20.000 células por pocillo (0,5 mL/pocillo) en un vaso inferior cámara 4 pozos microscopia pretratado con fibronectina de 50 μg/mL en PBS a 37 ° C durante 30 minutos e incubar ~ 12 h ( Figura 2B).
  2. Tratar las células con Dox (0,5 μg/mL) por ~ 12 h para inducir la expresión de NBB140-2xFV-Venus.
  3. Inducir la necroptosis por incubación con medio fresco (1 mL/pocillo) que contiene 25 nM Dim para inducir NBB140-2xFV-Venus la activación y translocación a la membrana plasmática.
  4. Coloque la cámara en un laser de disco de giro confocal microscopio construido sobre un soporte invertido equipado con control ambiental y un 63 1.4 objetivo de NA y utilizando el software de la opción de adquisición de imágenes (véase Tabla de materiales).
  5. Inicializar el software, seleccione el icono de "Enfoque" y configuración de filtro YFP (nm de longitud de onda 515 de excitación).
  6. Ubique el campo de visión y el plano focal y el sistema de mantenimiento de enfoque utilizando la ficha de "Enfoque definido".
  7. Para iniciar la adquisición, seleccione la pestaña "Captura" seguida de configuración de filtro, apropiado EMCCD cámara exposición tiempo e intensificación ganancia y parámetros de adquisición Time-lapse como intervalo y duración de la adquisición.
  8. Supervisar la redistribución celular de los NBB fluorescente140-2xFV-proteína de Venus durante necroptosis adquiriendo imágenes cada 10 s con una cámara EMCCD usando un láser 515 (película 1).
    Nota: Photobleaching es una preocupación con la proyección de imagen de proteína fluorescente. Venus es una de las proteínas fluorescentes más resistentes al fotoblanqueo29. Si se utilizan proteínas fluorescentes que son más susceptibles a fotoblanqueo, una imagen cada 30 s o más para permitir la recuperación de señales entre puntos de tiempo de proyección de imagen.
  9. Controlar la Asociación de la membrana plasmática de NBB140-2xFV-imagen de Venus durante la necroptosis, cada 10 s la muestra preparada en 3.3 por fluorescencia de reflexión interna total microscopia (TIRF) usando un microscopio equipado con un deslizador TIRF automatizado y un Objetivo de 100 x 1.4 NA y una cámara EMCCD (película 2). Siga los pasos de 3.5-3.7, pero ajustar el ángulo de la TIRF dentro de la pestaña foco TIRF según muestra e inferior grueso de cristal de la sala de microscopía.
    Nota: los marcadores de membrana plasmática como LCK-C-RFP pueden utilizarse como controles para la localización de la membrana plasmática en el análisis de la TIRF.
  10. Realizar el tratamiento para mejorar la calidad por convolución con la segunda normalizada negativa derivada de una función Gaussiana (algoritmo de Marr) de la imagen.

4. microscopia electrónica

  1. Placa mlkl- / - MEFs expresando NBB140-2xFV-Venus con una densidad de 5 millones células de revestimiento de plasma 150 mm placa de cultivo de células e incubar durante 12 h (figura 3).
  2. Tratar las células con doxiciclina (0,5 μg/mL) para inducir la expresión de la nota1-140-2xFV-Venus de 12 h.
  3. Inducir a NBB140-2xFV-Venus la activación y translocación a la membrana plasmática con 25 nM de homodimerizer durante 5 minutos. Este tiempo se establece de la cinética de la necroptosis observados en imágenes de células vivas.
  4. Quite los medios de comunicación y las células, usando 10 mL de glutaraldehído al 2.5%, 2% paraformaldehído en 0.1 M sodio cacodilato de tampón pH 7,4 (tampón cacodilato) calentado previamente a 37 ° C.
  5. Recoger la muestra por raspado y centrifugar las muestras durante 10 minutos a 500 x g. Deseche el sobrenadante.
  6. Postfix la muestra durante 1,5 h en tetróxido de osmio 2% reducido con ferrocianuro de potasio de 1.5% en buffer de cacodilato de sodio de 0.1 M. Tetróxido de osmio es un agente de tinción utilizado en TEM para proporcionar contraste. Utilizamos TEM como análisis preliminar antes de SEM de la célula que experimenta necroptosis.
  7. Enjuague la muestra 5 veces en agua ultrapura por 5 min a 500 x g, seguido por enjuagues en buffer (ver 4.6), agua y etanol en un procesador automático. Deseche el sobrenadante.
  8. Para el SEM, mancha las muestras previamente fijadas con 1% uranilo acetato y plomo aspartato metales pesados mancha31.
  9. Deshidratan las muestras a través de una serie gradual de soluciones de alcohol propileno óxido.
  10. Embeber la muestra en resina dura32 para obtener un bloque de resina.
  11. Corte secciones de espesor de 0.5 μm para determinar el área correcta del análisis.
  12. Cubrir las muestras con una película ultra delgada de metal eléctricamente conductor (iridio).
  13. Imagen y análisis de las muestras (figura 3). Para la cuantificación, se escanea una imagen de bajo aumento de la superficie del bloque de resina con las células expuestas a 5 keV usando un microscopio electrónico.
  14. Visualizar las células a través de imágenes individuales, capturadas por SEM o software de imágenes puede utilizarse para unirse a múltiples campos de la vista en una imagen contigua30. Aproximadamente 100 células pueden ser utilizadas para evaluar la fracción de células que experimentan necroptosis de esta manera generando un montaje de alta resolución en el software de elección (véase Tabla de materiales).
    Nota: Puntuación morfología necrótica por SEM compara características de células normales con la progresión de fenotipos previamente necróticas o necróticos. Estas características incluyen alteraciones de la membrana del plasma incluyendo la desaparición de las microvellosidades, aplanar, rupturas en las células que van desde 10 nm y 1 μm de tamaño o pérdida de la estructura del organelo en por lo menos 30-40% de la superficie celular citosólica.

5. lípidos vinculante de MLKL por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN)

  1. Preparar 15NBB N etiquetado1-156 por expresión de la proteína estándar y purificación como descrito previamente24.
  2. Disolver 500 μg de sal de amonio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (PI 18:0) y sal de amonio de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (18:1 PI) en 500 μl de helada CHCl3 cada para concentraciones finales de 1 mg/mL.
  3. Someter a ultrasonidos 1 mg/mL 18:0 y 18:1 PI en un baño de sonicación durante 1 min a temperatura ambiente o hasta 5 minutos en una mezcla de hielo y agua.
  4. Alícuota de 1 mg/mL 18:0 y 18:1 PI en frascos de vidrio limpios para series individuales de titulación NMR (figura 4). Transferencia de lípidos en solventes orgánicos utilizando jeringas herméticas de vidrio.
    1. Alícuota 132 μl de 1 mg/mL 18:1 PI (masa molar = 880.137 g/mol) en CHCl3 para un volumen de resuspensión final de 1.200 μL en concentración μm 125.
      Nota: Para tubos de 5 m m NMR, preparar volúmenes de dilución seriada de > 1.000 μl y final RMN muestra volúmenes de > 500 μl. Para tubos de 3 mm NMR, preparar volúmenes de dilución seriada de > 300 μl y final RMN muestra volúmenes de > 150 μL.
  5. 1 mg/mL alícuota porcino cerebro sal de amonio de L-α-fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato en 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cerebro de PI (4,5) P2) en frascos de vidrio limpios.
  6. Coloque los frascos en una corriente gaseosa de argón (Ar) o nitrógeno (N2) con flujo moderado a evaporar el solvente orgánico sin salpicar contra las paredes del frasco de vidrio. Cinco a treinta min es normalmente suficiente para los volúmenes de solvente orgánico de 10-200 μl.
  7. Colocar frascos de vidrio en la parte inferior de un Büchner o matraz de vacío con unas pinzas grandes, sellar con un tapón de goma y conecte el tubo de plástico conectado a una línea de vacío. Evacuar el matraz vacío suave durante la noche para eliminar materia orgánica residual.
  8. Superposición de partes alícuotas de la película de lípidos con gas inerte y sellar con una tapa hermética, almacenar a-20 ° C para el uso dentro de un mes o a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
  9. Preparación de buffers de NMR muestra sin detergente (-Det) que contiene 20 mM NaxHyPO4 de pH 6.8, 10% D2O y con detergente (+ Det) que contiene 20 mM NaxHyPO4 de pH 6.8, 10% D2O, 0.34 m m n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. Add + Det buffer al frasco de vidrio con película de lípidos para alcanzar la concentración deseada y someter a ultrasonidos en baño de agua durante 30 minutos, alternando sonicación durante 10 min seguida por inspección visual.
    Nota: Sonicación puede calentar la muestra. Deje que se enfríe a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la reconstitución de proteínas final muestra.
  11. Realizar dilución seriada de micelas de detergente lípidos en + Det búfer mediante sonicación de las mezclas 1:1 para la serie de la concentración deseada. Comenzando en la concentración de lípidos de 125 μm, tres repeticiones dará 62.5 μm, μm 31.3 y 15.6 lípidos μm en 0,34 mM DDM.
  12. Preparación control y referencia a muestras de NMR de proteínas y aditivos - Det y + Det buffers, respectivamente. Añadir proteína y aditivos para cada dilución de lípido en + buffer de Det.
    Nota: Para 15NBB N156, proteína es añadida a una concentración final de 40 μm y suplementada con 2 mM deuterado Ditiotreitol para mantener residuos de Cys reducidos.
  13. Transferir el volumen apropiado de las muestras a 5 mm o 3 mm tubos NMR (ver nota en el paso 5.4).
  14. Manual cargar muestras en instrumento NMR o arreglar en una plataforma de automatización como el cargador de SampleCase.
  15. Adquisición de espectros de RMN compuestos utilizando programas de pulso estándar para espectros de protón H 1como control de calidad seguido por espectros de correlación 2D 1H -15N como espectroscopía de relajación transversal optimizada (TROSY) o heteronuclear múltiples quantum coherencia (SOFAST-HMQC)33.
    Nota: El uso de tubos de 3 mm NMR requiere 64 análisis por 1 H -15N TROSY (3 h) ó 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Analizar números se reduce a la mitad para tubos de 5 m m NMR.
  16. Espectros de RMN 2D procesados pueden añadirse a un repositorio de CARA34 para el análisis u otro software de elección para el usuario.
  17. Análisis de software por anotación de resonancias de NMR 2D para tres picos bien dispersos y resueltos para cada estado de la proteína. Grabar las amplitudes de pico para cada uno de los seis picos para cada condición de búfer que contiene NBB156 (figura 5A).
    1. Uso de CARA a preparar una lista por lotes-integración (título del menú principal, haga clic en "espectro | Configuración por lotes lista"...) de todos los espectros recogidos y analizar utilizando un archivo de asignación solo pico (título del menú principal, haga clic en "cumbres | Importar Peaklist".. .y elegir un archivo definido por el usuario .peaks con 6 picos total, 3 para cada estado de la proteína, definido dentro de).
    2. La programación del tono ("integrador | Ajustar modelo de pico"...) de ancho X 0,06 ppm y ancho Y 0,30 ppm (título del menú principal, haga clic en "integrador | Ajustar modelo de pico"...) antes de grabar el resultado final en dos selecciones de menú (1. Haga clic en título del menú principal "integrador | Integrar la lista por lotes") (2. Haga clic en título del menú principal "picos | Exportar tabla de integración") (figura 5B).
      Nota: Las resonancias de amida de la espina dorsal para residuos M21, V53, L105 han sido asignadas para el estado NBB156 rodillera cerrada. El estado abierto-brace fue asignado a la columna vertebral amida resonancias de residuos G130 A141 y la epsilon protón cadena lateral resonancia de W133 usando 3D NMR experimentos24.
  18. Normalizar las muestras para la comparación directa de diferentes imanes o condiciones de la muestra por promedio de las amplitudes de rodillera abierta tres de las muestras de referencia y calcular un factor de normalización relacionadas con las dos referencias. Calcular las amplitudes escaladas de resonancias de156 NBB utilizando el factor de normalización y amplitudes negativas del ajuste a cero (tabla 2).
    Ejemplos: 1) comparando muestras de diferentes imanes: imán A, NBB156DDM e imán B, NBB156+ DDM. 2) comparación detergente: 0,34 DDM y 1,7 mM DDM.
  19. Calcular para cada resonancia la fracción escala de cerrado o abierto-soporte dividiendo con la gama de mínima a máxima amplitud de todos los espectros recogidos que contienen referencias apropiadas de NBB libre156 y totalmente abierto-brace NBB156 en detergente.
  20. Parcela las amplitudes NMR normalizadas en función de la concentración de lípidos y comparar la fracción de rodillera abierta NBB156 en diferentes condiciones (Fig. 5C).
    Nota: Como alternativa, análisis de la fracción de la conformación de la rodillera cerrada contra la concentración de lípidos se pueden realizar para comparar atascamiento del lípido a NBB156. Nosotros preferimos el análisis anterior porque es más rápido y mejores informes sobre la fracción completamente comprometido por lípidos.

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Representative Results

Visualizar la ejecución de la necroptosis regulado en células vivas ha sido posible a través de la expresión inducible de una mínima construcción MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Esta construcción mantiene la capacidad de inducir la permeabilización de la membrana plasmática y se activa a través de Oligomerización Dim-inducida de la cassette FKBP (2xFV). Observar y cuantificar necroptosis por microscopía de células vivas imágenes, monitoreo cinéticamente (cada 5 min) la absorción de un tinte de unión de ADN celular fluorescencia verde impermeable (figura 6A). Este sistema inducible es muy robusto y completo necroptosis de MEFs mlkl- / - pueden observarse dentro de ~ 1 h sobre Oligomerización Dim-mediada de células incuba Dox que expresan NBB140-2xFV-Venus (figura 1A ). Nos referimos a estas condiciones como cinética rápida necroptosis. Expresión de Venus sólo ± Dim o NBB140-2xFV-Venus en la ausencia de Dim no indujo la necroptosis (figura 6A). Generalmente Realizamos experimentos de replicar por lo menos 3 en triplicado o cuadruplicado en 24, 96 o placas de 384 pocillos.

La necroptosis rápida cinética inducida por dimerización forzada de NBB140-2xFV-Venus (figura 6A) apoya el papel de MLKL como el supuesto verdugo de la ruptura de la membrana plasmática. Para visualizar la redistribución de los NBB140-2xFV-Venus a la membrana plasmática durante la necroptosis, microscopia confocal de células vivas se utiliza para observar la fluorescencia de Venus. Durante necroptosis rápida cinética, dentro de 2 a 3 minutos de incubación con Dim, Venus se observa la capa de la periferia de la célula, seguido por redondeo (película 1) gradual de la célula. NBB140-2xFV-acumulación de Venus en la membrana plasmática es visualizada por microscopía confocal TIRF, que se centra en el volumen de la célula en la interfase de la membrana de vidrio de plasma citosol. Asociada a la membrana plasmática puncta de Venus son accesibles dentro de 1 a 2 min de incubación con Dim (película 2). Así, forzadas Oligomerización de NBB140-2xFV-Venus induce su rápida redistribución a membrana del plasma.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) es una poderosa herramienta para revelar los cambios morfológicos en las células que experimentan necroptosis. Bajo rápido necroptosis inducida por Oligomerización de NBB140-2xFV-Venus, células cambio de morfología de formas alargadas normales (tiempo 0 min) hasta redondeado y henchido (5 min) a parcialmente roto (10 min) y desmontado en el citosol se ha desaparecido (20 min) (figura 6B). SEM complementa las anteriores observaciones de microscopía de células vivas correlación localización MLKL a la membrana plasmática con ruptura de la membrana. En general las técnicas de microscopía presentadas ofrecen medios complementarios para supervisar, evaluar y cuantificar necroptosis a nivel celular e implicar NBB140-2xFV-Venus en la ejecución de la ruptura de la membrana plasmática.

Para determinar si MLKL puede contactar directamente con la membrana plasmática se realizan en vitro experimentos enlace lipídico por espectroscopia de RMN con recombinante NBB156. Diluciones seriadas de micelas lipídicas-detergente, usando una constante concentración de detergente (vehículo de presentación de lípidos) y las concentraciones de lípidos variable, se prueban para la Unión a 15NBB N etiquetado156 por espectroscopia de RMN 2D, que monitores enlace inducida por cambios en la proteína. NBB156 sufre cambios estructurales importantes en lípidos vinculante para desplazar la región inhibitoria rodillera (aminoácidos 132-156) de la cerrada y helicoidal (llave cerrada) a la conformación abierta e intrínsecamente desordenada (llave abierta) (figura 7 A). Espectroscopia de RMN bidimensional ofrece por información de residuos de mezclas de ambos conformadores (Figuras 7B-7C). Hemos asignado previamente las amidas de la columna vertebral de ambos conformadores24. Podemos monitorear fácilmente los porcentajes de conformadores cerrados y abiertos en una muestra determinada como se indica en la figura 5A-C. Usando este análisis de enlace, exploramos enlace156 de NBB para PIPs en detergente DDM, que es inerte a NBB156 vinculante (figura 5B). En este ensayo, PIP2 es el mejor ligando156 de NBB, que induce la apertura total de la ortesis inhibitoria a 125 μm (figura 5C). En contraste, saturados (18:0) PI y PI (18:1) insaturado son pobres ligandos de156 NBB inducir refuerzo parcial apertura bajo las mismas condiciones (figura 5C). Nuestro análisis de unión de lípidos basada en NMR proporciona evidencia de apoyo para la interacción de NBB MLKL156 con fosfolípidos y sugieren una relación directa entre MLKL y la membrana plasmática.

Figure 1
Figura 1: Estable línea de celular que un Tet-en 3 G inducible sistema modificado. (A) célula estable líneas fueron generadas por transducción retroviral de/mlkl- / - MEFs con la pTREX-rtTA-explosión seguida por la de pRetroX-TRE3G-NBB140-2xFV-Venus-puro. Cada transducción fue seguida por selección antibiótica hasta 1 semana antes de pasar al análisis posterior. (B) representación esquemática del sistema de expresión inducible MLKL. Este sistema se basa en 2 pasos regulatorios droga-inducible: i) MLKL gene expresión y producción de proteína (+ Dox) y ii) activación por Oligomerización (+ Dim). Cuando la producción de proteína es inducida en avance + Dox, necroptosis rápida cinética puede ser activado + Dim. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Proyección de imagen de células vivas de la necroptosis rápida cinética revela relocalización rápida membrana de MLKL. (A) rápido-cinética necroptosis inducida como en la figura 1B pueden ser monitoreados en un sistema de proyección de imagen. Necroptosis es puntuada por absorción del tinte fluorescente verde impermeable a la célula. (B) representación esquemática de las imágenes de células vivas de cinética rápida necroptosis con epifluorescencia y total análisis de microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representación esquemática de la exploración de la microscopia electrónica (SEM) preparación de muestras y análisis. Las células de rápida cinética necroptosis inducida como se describe en la figura 1 se fijan en la placa en diferentes puntos temporales después de la adición de Dim. Las células entonces están preparadas para el análisis de SEM raspando y agrupación, coloración de metales pesados, incrustación de resina, y capa del iridio como se describe en la sección 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: De la muestra preparación y recopilación de datos de titulaciones de NMR de micelas de156 y lípidos-detergente de NBB N 15. Este análisis y el análisis se realiza generalmente en 3 a 4 días: durante el día 1, alícuotas de lípidos son dispensadas y secados durante la noche. Durante el día 2, las películas lipídicas son rehidratadas en ensayo buffer ± detergentes, sonicados y diluidas en serie (doble) mezclando volúmenes iguales de la solución de lípidos rehidratar con solución tampón libre de lípidos. Cada dilución se sonicó para asegurar la mezcla homogénea y distribución de lípidos en micelas de detergente antes de diluciones subsecuentes. Muestras de proteína mezcladas en las diluciones serie micela lipídica-detergente, cargadas en los correspondientes tubos NMR, coloca en un cargador de SampleCase (o cargadas manualmente), y se inicia la recopilación automática de datos NMR. Durante los días posteriores, recopilación de datos NMR es completado y seguida por 2D NMR análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Preferencias de unión a lípidos de NBB156 medición mediante RMN 2D. (A) superpuestas espectros 1H -15N TROSY 15NBB N156 en la presencia (rojo) o ausencia (azul) 125 μm PI (4,5) P2 en 0,34 mM DDM visualizado en la CARA. (B) rodajas unidimensional de resonancias utilizados para mediciones de amplitud y normalización. El espectro crudo (verde) es overlaid con el límite de amplitud e integración por el programa de CARA. (C) normalizado amplitudes de NBB156 en presencia de micelas de Fosfoinositol-DDM conspiraron contra la concentración de lípidos. PIP2 induce la apertura total de la ortesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Cinética rápida necroptosis inducida por Oligomerización de NBB140-2xFV-Venus en/mlkl- / - MEFs. (A) cuantificación de la Necroptosis por proyección de imagen de alto rendimiento de la fluorescencia de la absorción de colorante fluorescente verde impermeable a la célula, ADN. Inducción necroptosis robusto se observa sólo al Dim inducida por Oligomerización de NBB140-2xFV-Venus, pero no en la ausencia de Dim. También se realizan experimentos de control sólo Venus. Todas las condiciones se hacen por triplicado y se trazan como media y SD de un representante replicar. (B) cinética rápida necroptosis inducida en presencia de Dim visualizada con microscopía electrónica de barrido. El tiempo curso revela morfológicos cambios necroptosis subyacente incluyendo redondeo de las células y la inflamación (5 min), ruptura de la membrana plasmática (10 min) y completar la extravasación del citosol (20 min). Cada muestra tenía un número similar de células en el tiempo 0 min. De izquierda a derecha, el área ampliado en contiene 26, 23, 32 y 36 células con núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Unión de NBB156 a fosfoinosítidos por espectroscopia de RMN. Espectro de TROSY N de15(A) 1H - 15N-NBB156. Los desplazamientos químicos de resonancias utilizados para la normalización del espectro rodillera cerrada o cuantificación del estado abierto se destacan con cuadrados o círculos, respectivamente. Derecha, esquema de firmas de NMR en la ausencia o presencia de micelas de detergente de lípidos. NBB156 no bind micelas de detergente DDM en ausencia de fosfoinosítidos. (B) superpuestas 1H -15espectros de TROSY N 15N-NBB156 en presencia de las micelas de detergente lípidos respectivos. (C) solo 1H -15N TROSY los espectros de 15NBB N156 en presencia de las micelas de detergente lípidos respectivos del panel B. Detectando las conformaciones abiertas y cerradas sin ambigüedades en mezclas de las dos conformaciones podemos cuantificar los porcentajes de los dos conformadores en una muestra determinada. PIP2 es el ligando lipídico recomendado: de NBB156 proporcionando un enlace directo entre MLKL y fosfolípidos de la membrana plasmática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tampón PCR (10 x) 5.0 ΜL
Plantilla de la DNA (100 ng/μL) 1,0 ΜL
cDNAs para MLKL, 2 x FKBP, Venus)
dNTPs (25 mM cada NTP) 0.5 ΜL
Cartillas de la polimerización en cadena hacia adelante (F) (100 ng/μL) 1.3 ΜL
Cartillas de la polimerización en cadena hacia adelante (FR (100 ng/μL) 1.3 ΜL
NBB140 F ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT
NBB140 R TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC
2xFKBP F ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT
2xFKBP R TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC
Venus F ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG
Venus R TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC
Polimerasa de la DNA (2.5 U/μL) 1,0 ΜL
Agua destilada desionizada (ddH2O) ΜL DE 39,9
Volumen de reacción total 50,0 ΜL
Parámetros de ciclo de PCR
1 ciclo 94-98 ° C; 45 s
25 – 30 ciclos 94-98 ° C; 45 s
58 ° C; 45 s
72 ° C; 1-2 min.
1 ciclo 72 ° C; 10 min

Tabla 1: reacción de PCR de NB 140 -2xFV-Venus para clonación basada en la enzima de la restricción en pRetroX-TRE3G.

Table 2
Tabla 2: datos de espectros de RMN presentados en la figura 5 ilustra la transformación normalizada de datos recopilaron de un segundo imán de NMR al estado calculada media rodillera abierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta mesa.

Movie 1
Película 1: cinética rápida necroptosis inducida por Oligomerización de NBB 140 -2xFV-Venus en MLKL- / - MEFs. Microscopía confocal mostrando la rápida translocación de los NBB140en vivo-2xFV-Venus desde el citosol a la membrana plasmática después de la forzada Oligomerización del dominio FKBP. Las células fueron tratadas como se describe en la figura 1. Amarillo: NBB140-2xFV-Venus. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Movie 2
Película 2: microscopía TIRF de cinética rápida necroptosis. Microscopía TIRF que relocalización rápida (~ 2 minutos) y agregación de MLKL de la membrana plasmática sobre la adición de Dim mlkl- / - MEFs expresando NBB140-2xFV-Venus. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

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Discussion

Ofrecemos protocolos para técnicas que se combinaron implicado MLKL como el supuesto verdugo de ruptura de membrana plasmática24. Además de descifrar la red reguladora que regula MLKL-mediada de la necroptosis, estas técnicas se pueden utilizar independientemente para caracterizar otros sistemas biológicos adecuados. Prácticamente hablando, estas técnicas son herramientas de descubrimiento de medio a bajo rendimiento.

Habitualmente hemos utilizado proyección de imagen de células vivas de NBB140-2xFV-Venus-mediar necroptosis y que inducido por otras construcciones MLKL, mecanísticamente diseccionar la regulación de MLKL en necroptosis mediante mutagénesis y mediante el uso de pequeñas moléculas químicas puntas de prueba. En particular, nosotros y otros grupos hemos demostrado que humanos y construcciones ratón de MLKL que contienen la región mínima de NBB pueden mediar necroptosis en humanos y líneas celulares de ratón. Uno informó ADVERTENCIA Consejo necroptosis MLKL mediada es la especificidad de especie de interacción RIPK3 y MLKL, que impide la reactividad cruzada entre especies observadas sobre el estímulo por aguas arriba por la combinación de TNF, smac miméticos y la inhibición de caspase 25,35,36. Por consiguiente, humano y ratón RIPK3 y proteínas MLKL no reacción cruzada bajo estas condiciones25,35,36. Para saltarse las limitaciones entre las especies, se introducen mutaciones que activan MLKL humana o utilizan cassettes de Oligomerización como se muestra aquí por NBB140-2xFV-Venus24. Humano NBB140 es una construcción que mantiene la región inhibitoria y por lo tanto permanece inactiva en el contexto de NBB140-2xFV-Venus. Dimerización de 2xFV se piensa para activar NBB140 soltando la abrazadera. Por el contrario, humano NBB182 induce necroptosis incluso en ausencia de Oligomerización, porque esta construcción puede espontáneamente oligomerize24. Por otra parte, el punto mutantes (R30A R30E, E136A y E136R) activación de la región NB en el contexto de larga duración MLKL humana superar la necesidad de activación por fosforilación de RIPK324. Además, hemos reconstituido dimerizable RIPK3 humano (Cerulean-2xFV-RIPK3) y la MLKL humano integral Dox-inducible-Venus, que son compatibles y robusta inducir necroptosis en/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . Otros recientemente revelaron mutaciones adicionales o dominio de ratón humanos intercambiadas construcciones MLKL que pueden superar de las barreras de especificidad de especie25.

Típicamente, optimizamos las condiciones de ensayo de la necroptosis realizando varios experimentos de búsqueda de variedad en placas de 96 pocillos. Luego seguimos con experimentos optimizados en placas de 24 pocillos, que proporcionan suficientes células de multiplexado con la clasificación complementaria fluorescente celular activada (FACS) y western blot análisis realizados posteriormente en las mismas muestras inmediatamente después de la proyección de imagen el momento final. Actualmente, proyección de imagen de células vivas se basa en la detección de la fluorescencia verde y roja, limitando las posibilidades de etiquetado para muchas aplicaciones. Una alternativa común a los tintes fluorescentes verdes es la célula impermeable ADN fluorescente tinte propidio (PI). Instrumentos de proyección de imagen de color dual ofrecen la opción de usar estos tintes con proteínas fluorescentes verdes o rojas complementarias para mejorar el contenido de utilidad e información de la imagen de la necroptosis.

La capacidad de MLKL translocan a la membrana plasmática después de su activación, hace vivo microscopia la técnica de elección para el estudio de la biología de esta proteína y seguir en tiempo real el morfológico cambios subyacentes de la necroptosis. Microscopía TIRF resuelve inequívocamente MLKL agregados de proteína en la membrana del plasma, especialmente cuando se ejecuta en presencia de marcadores que se localización junto a la membrana plasmática. Se utilizó C-LCK-RFP como marcador de membrana plasmática co-localización24. La capacidad de las proteínas de la etiqueta de interés con diferentes fluoróforos, también permite para estudiar simultáneamente la actividad de varias proteínas implicadas en el mismo proceso. La próxima generación de la microscopía de superresolución parcialmente supera el problema de límite de difracción en la microscopia confocal estándar y tiene el potencial para revelar características adicionales de la necroptosis MLKL-mediada.

Uno de los sellos de la necroptosis es la permeabilización de la membrana plasmática. Aunque varias técnicas pueden cuantificar indirectamente o indicar rupturas de la membrana, solo EM puede visualizar discontinuidades en la integridad de la membrana plasmática inducida por MLKL. Mientras que TEM tiene el mayor poder de resolución, SEM tiene la capacidad para asignar áreas de muestras más grandes. Esta característica, combinada con el desarrollo de software nuevo y poderoso capaz de manejar mayor volumen de datos, ha mejorado la utilidad de la SEM en caracterización de morfología celular. Además, SEM es capaz de escanear las secciones muestra consecutiva permitiendo reconstrucción 3D cuando se combina con otros sistemas, tales como la viga de Ion enfocada. Algunos de los inconvenientes del análisis de la EM incluyen el costo de la instrumentación y mantenimiento, necesidad de personal altamente especializado y la inversión de tiempo considerable en el análisis y procesamiento de las muestras.

Dot blot ensayos han utilizado originalmente para hacer conexiones directas entre MLKL y membrana plasmática fosfolípidos16,27. Nuestro análisis de unión de lípidos basada en NMR definitivamente implica MLKL en el enlace de fosfolípidos específicos, destacando el PIP2 como el ligand MLKL de elección. Nuestros resultados demuestran un efecto deletéreo de la saturación de cadena acilo en enlace de156 NBB a fosfatidilinositol. Sin embargo, cómo enlace MLKL PIP2, y potencialmente otros fosfolípidos, resulta en ruptura de membrana plasmática permanece desconocido. Mediante este protocolo se puede analizar cualquier otro fosfolípido Unión MLKL. Nuestro ensayo sirve como una gran herramienta para las pruebas de los modelos emergentes de mediar MLKL necroptosis, como puede ser utilizado con mutantes de MLKL y diversos ligandos para identificar las contribuciones específicas al atascamiento del lípido. Además, puede utilizarse para otros sistemas de membrana asociada a interrogar a sus perfiles de unión de lípidos.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Ninguno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3G Clontech 631188
Tet-On transactivator plasmid Llambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- Dillon et al., 2014
Blasticidin S Hydrochloride Thermo Fisher Scientific BP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
Doxycycline Clontech 631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187 Takara 635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific S7020
Syto16 Thermo Fisher Scientific S7578
NMR
15 N Ammonium Chloride Cambridge Isotope Laboratories NLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTT Cambridge Isotope Laboratories DLM-2622-1
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace D310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) Avanti Polar Lipids 850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) Avanti Polar Lipids 850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOM Essen BioScience, Inc. Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam  Thermo Fisher Scientific Electron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) Essen BioScience, Inc. http://www.essenbioscience.com Imaging analysis
FEI MAPS Thermo Fisher Scientific https://www.fei.com/software/maps/ EM analysis
TopSpin v3.2 Bruker BioSpin http://www.bruker.com NMR data collection
CARA v1.9.1.7 http://cara.nmr.ch/  NMR data analysis
Slidebook 3i (Intelligent Imaging Innovations) https://www.intelligent-imaging.com/slidebook Confocal microscopy

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References

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Biología número 138 Necroptosis mezclado linaje kinased dominio-como (MLKL) permeabilización de la membrana plasmática microscopía de células vivas microscopia electrónica espectroscopia NMR fosfoinosítidos
Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis
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McNamara, D. E., Quarato, G., Guy, C. S., Green, D. R., Moldoveanu, T. Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis. J. Vis. Exp. (138), e58088, doi:10.3791/58088 (2018).

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