Summary
Nós relatamos métodos para a caracterização da ruptura de membrana de plasma MLKL-mediada em necroptosis incluindo imagem de microscopia de viver-pilha convencional e confocal, varredura microscopia eletrônica e vinculação de lipídios NMR-baseado.
Abstract
Necroptosis é uma via de morte celular programada desencadeada pela ativação do receptor interagindo proteína quinase 3 (RIPK3), que fosforila e ativa o pseudokinase quinase-como domínio de linhagem mista, MLKL, ruptura ou permeabilize a membrana plasmática . Necroptosis é uma via inflamatória associada com múltiplas patologias, incluindo a auto-imunidade, doenças infecciosas e cardiovasculares, acidente vascular cerebral, neurodegeneração e câncer. Aqui, descrevemos os protocolos que podem ser usados para caracterizar MLKL como o carrasco de ruptura de membrana plasmática em necroptosis. Visualizamos o processo de necroptosis nas células usando a imagem latente da viver-pilha com microscopia de fluorescência confocal e convencional e nas células fixas usando microscopia eletrônica, que juntos, revelou a redistribuição do MLKL do citosol para o plasma membrana antes da indução de grandes buracos na membrana plasmática. Apresentamos em vitro ressonância magnética nuclear (NMR) análise usando lipídios para identificar putativos moduladores de necroptosis MLKL-mediada. Com base neste método, identificamos quantitativas preferências de ligação de lipídios e fosfatos de fosfatidil-inositol (PIPs) como ligantes críticos do MLKL que são necessárias para direcionamento de membrana plasmática e permeabilização em necroptosis.
Introduction
Identificar componentes genéticos de necroptosis tem facilitado o uso de modelos animais para testar a implicação de necroptosis em fisiologia e doença1,2,3,4,5. Nocaute de RIPK3 ou MLKL em ratos teve implicação mínima na homeostase desenvolvimento e adulto, sugerindo que necroptosis não é essencial para a vida de3,6. Além disso, certas espécies não contêm genes ou RIPK3 ou MLKL, apoiando o papel de não-essenciais da necroptosis em animais7,8. Por outro lado, desafiar modelos animais nocaute com várias patologias induzidas em laboratório revelou um importante papel de necroptosis na inflamação, imunidade inata e infecção viral9,10, 11 , 12.
Necroptosis podem ser ativadas de várias maneiras por sinalização através de sensores diferentes imunidade inata, todos que se traduzam na ativação de RIPK31,13,14. RIPK3 ativo, por sua vez, fosforila e ativa MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. O mais estudado, e talvez a forma mais complexa, levando à ativação de RIPK3 envolve a morte do receptor da ligadura, que bifurca com base na composição a jusante dos complexos sinalização também induzir apoptose ou necroptosis1. Necroptosis segue-se quando é favorecida e sinalização através de RIPK1 resulta em noivado de RIPK319,20. Este resultado é facilmente favorecido mediante inibição farmacológica ou exclusão genética de caspase 8, um inibidor endógeno putativo de necroptosis que fica necroptosis na baía. RIPK1 liga a e ativa RIPK3. Outra maneira de ativar necroptosis é através de receptores Toll-like TLR3/TLR4 de sinalização, que se envolve e ativa RIPK3 a TIR-domínio-contendo adaptador de indução interferon-β (TRIF)21. Ainda outra forma de morrer por necroptosis é pela ativação do sensor DNA DAI, que diretamente se engaja e ativa RIPK322.
MLKL é uma proteína citosólica, composta de um domínio do N-terminal hélice bundle (NB) e um domínio de pseudokinase C-terminal (psKD) ligados por uma região reguladora chave3. Em células normais, MLKL é encontrado no citosol onde é pensado para ser um complexo inativo com RIPK314. Ativação de necroptosis desencadeia fosforilação de RIPK3 de MLKL no loop ativação do psKD e sites potencialmente adicionais no NB e cinta3,15,23. Fosforilação induz uma mudança conformacional na MLKL que resulta na dissociação do RIPK314. Mudanças conformacionais mal-compreendidos liberar a chave do psKD24. A joelheira, que contém 2 hélices, Medeia oligomerização de MLKL em um trímero putativo através do C-terminal hélice25. A hélice do N-terminal do contraventamento inibe o domínio NB, que é essencial para a membrana permeabilização24,26. Isoladamente, o domínio NB é suficiente para induzir a permeabilização da membrana plasmática e necroptosis16,24,27. A atividade de pro-necroptotic de NB foi reconstituída em fibroblastos embrionários de rato deficientes em MLKL (mlkl- / - MEFs). NB é um domínio de ligação de lipídios que envolve preferencialmente o difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP2). Propusemos um mecanismo gradual de ativação do MLKL, no qual cinta oligomerização facilita o recrutamento de MLKL para a membrana plasmática através de interações fracas de NB com o PIP2 grupo cabeça polar24. Na membrana, o NB sofre exposição regulamentada de um site adicional de alta afinidade de ligação para PIP2, que é mascarada pelo contraventamento em MLKL inativo. Em geral, as várias interações de NB com PIP2 desestabilizam a membrana plasmática, levando a sua ruptura, embora o mecanismo molecular desses eventos não ter sido elucidado.
Aqui ilustramos métodos específicos usados para caracterizar a função do MLKL como executor do necroptosis24. Em particular, enfocamos o domínio mínimo do MLKL, NB e cinta (NBB), que é regulada pela inibição de contraventamento e pode ser ativadas através de dimerização forçada para induzir necroptosis e ruptura da membrana plasmática. Nós descrevemos o nosso sistema de expressão inducible combinado com forçada induzido FKBP-mediada dimerização para imagem latente da viver-pilha e microscopia eletrônica de células em fase necroptosis. Além disso, ilustramos nossa análise em vitro NMR das interações do NBB com phosphatidylinositols (PIPs).
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Protocol
1. clonagem e geração de linha da pilha
- PCR amplificar a região do NBB, correspondente a resíduos de aminoácidos 1-140 (NBB140), do cDNA MLKL humano no quadro padrão baseada em enzimas de restrição clonagem com a proteína de ligação de oligomerização domínio 2 x FK506 (2xFKBP ou 2xFV) e fluorescentes de Venus proteína em doxiciclina (Dox) - inducible vetor retroviral pRetroX-TRE3G para obter o NBB140- 2xFV-Venus (tabela 1, figuras 1A-B).
- Imortalizar primário mlkl- / - ou ripk3- / - mlkl- / - rato embrionários fibroblastos (MEFs) obtidos os respectivos ratos disponíveis no laboratório verde por transfecção transiente com antígeno SV40-grande expressando o plasmídeo. Selecionar células imortalizadas em ~ 1-2 semanas e manter-se em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e estreptomicina, piruvato de sódio 1 mM e aminoácidos não essenciais em 37 ° C e 5% CO2 em tecido padrão incubadoras de cultura.
- Transduce SV40-imortalizado mlkl- / - MEFs com liberada a tetraciclina reversa controlada (rtTA)-contendo retrovírus expressado de um plasmídeo contendo o gene de resistência de blasticidin (nosso plasmídeo modificado) e tratar para 1 semana com 5 μg/mL blasticidin para selecionar para celulas que expressam estàvel rtTA28.
- Transduce os MEFs rtTA-expressando com o vetor retroviral Dox-inducible contendo o MLKL Quimérico (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) e selecione usando 4 puromicina μg/mL para uma semana, 2 dias depois de transdução.
2. imagem de microscopia viver-pilha de Necroptosis mediada por MLKL
- Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Vênus em uma densidade de 50.000 células por poço (1 mL/poço) em 24 bem as placas e incubar durante uma noite(Figura 2). Viver-pilha uso coloração para a célula automatizada contagem (ver Tabela de materiais).
- Tratar as células para 12 h com Dox (0.5 μg/mL) para induzir a expressão do NBB140-2xFV-Venus.
- Induzir a necroptosis com dimerizer FKBP 25 nM (Dim) Além de fluorescente verde-membrana impermeável de 25 nM tingir (ver Tabela de materiais) em DMEM padrão (ver 1.2). Células em fase necroptosis acumulam o corante como sua integridade de membrana plasmática é comprometida pelo NBB140-mediada por ruptura. Realize ensaios em triplicado ou quadruplicado.
- Para monitorar necroptosis usando sistemas de imagem single ou duplo-cor (ver Tabela de materiais), coloque os vasos na unidade de imagem respectiva abrigada em uma incubadora de cultura de tecidos de mamíferos.
- Abra o software (consulte a Tabela de materiais) e selecione a guia Agenda Scans programados sob a lista de tarefas.
Nota: o presente protocolo é para tratamento de imagens usando sistemas de cor única, mas um software similar está disponível para sistemas dual-cores. - Selecione a "bandeja, vaso, tipos de varredura" e o padrão de"varredura" na guia "Layout físico" e "Fast fluorescência" na guia Propriedades.
- Adicione o "Scan Time" clicando na janela de "Timeline" e o número total de pontos de tempo e frequência de aquisição (tipicamente 1 aquisição cada 0,5 h a 1 h para 6 h às 12 h, ou a cada 5 min para necroptosis rápido-cinética) e comece a aquisição de imagens, selecionando "App ly"(botão vermelho).
- Quantificar necroptosis usando o software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais), selecionando o "painel de tarefas", "Objeto Counting nova análise com limite fixo de segmentação acima do nível do plano de fundo", que pode ser determinado pelo pairar a cursor do mouse sobre as regiões de fundo em várias imagens usadas na análise.
- Examinar objetos fluorescentes selecionando visualização usando a imagem atual e refinar os níveis de limite conforme necessário.
- Integrar a fluorescência verde contagens abrindo a aba "Lançar nova análise", escolher o "intervalo de tempo", selecione os poços analisados, digite o nome de trabalho"análise" e pressione "Okey".
- Acesso analisou dados da guia "Trabalhos de análise" clicando duas vezes sobre o nome do respectivo trabalho e exportar a partir da janela de gráfico/exportação para análise adicional no software gráfico externo (ver Tabela de materiais).
- Dosar dados como fluorescência verde positivo (+ ve) contagens/mm2 ou normalizar as contagens por confluência e expressar os dados como fluorescência verde + ve contagens/confluência.
- Opcionalmente, no ponto de extremidade experimental, mancha células com 100 nM da membrana-permeant verde fluorescente tintura (ver Tabela de materiais). Normalize os dados às células de necroptotic % como a razão de fluorescência fluorescência verde/verde no ponto de extremidade.
3. imagem de microscopia Confocal live-célula de recrutamento de membrana plasmática e permeabilização por MLKL
- Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Venus em uma densidade de 20.000 células por poço (0,5 mL/poço) em um copo baixo câmara 4-bem microscopia pré-tratados com 50 µ g/mL fibronectina em PBS a 37 ° C por 30 min e incube por ~ 12 h ( Figura 2B).
- Tratar as células com Dox (0.5 μg/mL) para ~ 12 h induzir a expressão do NBB140-2xFV-Venus.
- Induzir a necroptosis pela incubação com meio fresco (1 mL/poço) contendo 25 nM Dim para induzir NBB140-2xFV-Venus ativação e translocação para a membrana plasmática.
- Coloque a câmara em um laser do disco girando microscópio confocal, construído em uma posição invertida equipada com controle ambiental e um 63 1.4 objetivo at e começar usando o software de escolha de aquisição de imagem (consulte a Tabela de materiais).
- Inicializar o software, selecione o ícone de "Foco" e configuração de filtro YFP (excitação de onda 515 nm).
- Localize o campo de visão e plano focal e envolver o sistema de manutenção de foco usando a guia "Foco definitivo".
- Para começar a aquisição, selecione a guia de "Captura", seguida por atribuição de configuração de filtro apropriado EMCCD câmera exposição tempo e intensificação ganho e parâmetros de aquisição de lapso de tempo, incluindo o intervalo e a duração da aquisição.
- Monitorar celular redistribuição dos fluorescente NBB140-2xFV-proteína de Venus durante necroptosis através da aquisição de imagens a cada 10 s por uma câmera EMCCD usando um laser de 515 nm (1 filme).
Nota: O fotobranqueamento é uma preocupação com a imagem de proteína fluorescente. Vênus é uma das mais resistentes proteínas fluorescentes fotobranqueamento29. Se forem utilizadas proteínas fluorescentes que são mais suscetíveis à fotobranqueamento, imagem a cada 30 s ou mais para permitir a recuperação de sinal entre os pontos de tempo de imagem. - Para monitorar a membrana plasmática associação do NBB140-2xFV-Venus durante necroptosis, imagem a cada 10 s a amostra preparada em 3.3 por fluorescência de reflexão interna total microscopia (TIRF) usando um microscópio equipado com um slider TIRF automatizada e um 100 x 1.4 at objetivo e uma câmera EMCCD (filme 2). Siga os passos 3.5-3.7, mas ajustar o ângulo TIRF dentro guia TIRF foco, de acordo com a espessura de vidro de amostra e na parte inferior da câmara de microscopia.
Nota: os marcadores de membrana plasmática como LCK-C-RFP podem ser utilizados como controles para localização da membrana plasmática em análise TIRF. - Execute o processamento para realçar a qualidade por convolução com a negativa normalizada segunda derivada de uma função gaussiana (algoritmo de Marr) de imagem.
4. microscopia de elétron
- Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Venus em uma densidade de 5 milhões de células em um plasma-revestido 150 mm placa de cultura de células e incubar durante 12 h (Figura 3).
- Tratar as células com doxiciclina (0.5 μg/mL) para induzir a expressão de NB1-140-2xFV-Venus para 12h.
- Induzir a NBB140-2xFV-Venus ativação e translocação para a membrana plasmática com 25 nM de homodimerizer por 5 min. Desta vez é estabelecida de cinética de necroptosis observados em imagem latente da viver-pilha.
- Remova a mídia e corrigir células usando 10 mL de glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído de 2% em 0,1 M de sódio cacodylate tampão pH 7,4 (cacodylate tampão) pré aquecido a 37 ° C.
- Coletar a amostra por raspagem e girar as amostras por 10 min a 500 x g. Desprezar o sobrenadante.
- O postfix a amostra por 1,5 h em tetróxido de ósmio reduzido 2% com ferrocianeto de potássio 1,5% em tampão de cacodylate de sódio 0,1 M. Tetróxido de ósmio é um agente de coloração amplamente usado TEM para fornecer contraste. Nós usamos TEM como análise preliminar antes SEM das células, passando por necroptosis.
- Enxágue a amostra 5 vezes em água ultrapura por 5 min cada a 500 x g, seguido de lavagens em buffer (ver 4.6), água e etanol em um processador automático. Desprezar o sobrenadante.
- Para a SEM, mancha as amostras previamente corrigidas com 1% de uranilo acetato e chumbo aspartato heavy metal mancha31.
- Desidrate as amostras através de uma série graduada de soluções de óxido de álcool e propileno.
- Incorpore a amostra em resina dura32 para obter um bloco de resina.
- Seções de corte espessura de 0.5 μm para determinar a área correta de análise.
- Revesti as amostras com uma ultra fina película de metal eletricamente condutor (Iridium).
- Imagem e analisar as amostras (Figura 3). Para a quantificação, uma imagem de baixa ampliação da superfície do bloco de resina com células expostas é digitalizada em 5 keV usando um microscópio eletrônico.
- Visualizar as células através de imagens individuais, capturadas por SEM ou software de imagem pode ser utilizado para unir vários campos de visão em uma imagem contíguo30. Aproximadamente 100 células podem ser usadas para avaliar a fração de células em fase necroptosis, desta forma gerando uma montagem de alta resolução no software de escolha (ver Tabela de materiais).
Nota: Marcar morfologia necrótica por SEM compara características de célula normal com a progressão dos fenótipos pre-necróticos ou necróticos. Esses recursos incluem alterações de membrana plasmática, incluindo o desaparecimento microvilli, achatamento, rupturas em células que variam de 10 nm a 1 µm em tamanho, ou perda da estrutura das organelas através de pelo menos 30 – 40% da área celular citosólica.
5. lipídios vinculação do MLKL por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR)
- Prepare-se 15N-rotulado NBB1-156 pela expressão da proteína padrão e purificação, como descrito anteriormente,24.
- Dissolva 500 µ g de sal de amónio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (PI 18:0) e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) sal de amónio (18:1 PI) em 500 µ l de gelado CHCl3 cada para concentrações finais de 1 mg/mL.
- Proceda à sonicação 1mg/mL 18:0 e 18:1 PI num banho de água sonication para 1 min à temperatura ambiente ou em até 5 min em uma mistura de água gelada.
-
Alíquota de 1 mg/mL 18:0 e 18:1 PI em frascos de vidro limpo para série de titulação individual NMR (Figura 4). Transferência de lipídios em solventes orgânicos, usando seringas de vidro herméticos.
- Alíquota µ l 132 de 1 mg/mL 18:1 PI (massa molar = 880.137 g/mol) em CHCl3 para um volume final de ressuspensão de 1.200 µ l na concentração de 125 µM.
Nota: Para tubos de 5mm NMR, preparar volumes de diluição serial de > 1.000 µ l e NMR final da amostra volumes de > 500 µ l. Para tubos de 3 mm NMR, preparar volumes de diluição serial de > 300 µ l e NMR final da amostra volumes de > 150 µ l.
- Alíquota µ l 132 de 1 mg/mL 18:1 PI (massa molar = 880.137 g/mol) em CHCl3 para um volume final de ressuspensão de 1.200 µ l na concentração de 125 µM.
- Alíquota de 1 mg/mL de suínos no cérebro L-α-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato sal de amónio em 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cérebro P PI (4,5)2) em frascos de vidro limpo.
- Coloque os frascos sob um fluxo gasoso de argônio (Ar) ou nitrogênio (N2) com fluxo moderado para evaporar o solvente orgânico sem salpicar contra as paredes do frasco de vidro. Cinco a trinta min é normalmente suficiente para volumes de solvente orgânico de 10 a 200 µ l.
- Providenciar conj de vidro no fundo de um balão de vácuo usando uma pinça grande, ou Büchner selar com uma rolha de borracha e prenda o tubo plástico conectado a uma linha de vácuo. Evacue o balão sob vácuo suave durante a noite para remover resíduos orgânicos.
- Sobreposição de alíquotas de filme lipídico com gás inerte, selar com uma tampa hermética e armazenar a-20 ° C para uso dentro de um mês ou -80 ° C para o armazenamento de longo prazo.
- Preparar os buffers de amostra NMR sem detergente (-Det) contendo pH 20 mM ndxHyPO4 6,8, 10% D2Ó e com detergente (+ Det) contendo pH 20 mM ndxHyPO4 6,8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).
- Adicionar + Det buffer para frasco de vidro com película de lipídios para atingir a concentração desejada e proceda à sonicação em banho de água de até 30 min., alternando sonication por 10 min, seguido por inspeção visual.
Nota: Sonication pode aquecer a amostra. Deixe arrefecer à temperatura ambiente por 15 minutos antes da reconstituição de amostra de proteína final. - Realize uma diluição serial de micelas de lipídios-detergente em + Det buffer usando sonication de misturas 1:1 para a série de concentração desejada. A partir da concentração de lipídios 125 µM, três repetições renderá 62,5 µM, 31.3 µM e 15,6 lipídico µM em 0,34 mM DDM.
- Preparar o controle e amostras de NMR de proteína e de aditivos no Det - e + Det amortecedores, respectivamente. Adicione a proteína e aditivos para cada diluição de lipídio em + Det buffer.
Nota: Para 15NBB N156, proteína é adicionada a uma concentração final de 40 µM e suplementada com 2mm deuterado ditiotreitol manter resíduos Cys reduzidos. - Transferi o volume apropriado de amostras de 5 mm ou 3 mm tubos NMR (ver nota na etapa 5.4).
- Carregar amostras em instrumento NMR ou organizar-se em uma plataforma de automação, tais como o carregador de SampleCase manualmente.
- Adquirir o composto espectro RMN usando programas padrão de pulso para espectros de prótons H 1como controle de qualidade, seguido por espectros de correlação 2D 1H -15N quer como espectroscopia de relaxação transversal otimizada (TROSY) ou heteronuclear múltiplas quântica coerência (SOFAST-HMQC)33.
Nota: Uso de tubos de 3 mm NMR requer 64 varreduras para 1 H -15N TROSY (~ 3 h) ou 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Varredura de números são cortadas ao meio para tubos de 5mm NMR. - Espectro de RMN 2D transformados pode ser adicionados a um repositório de CARA34 para análise ou outro software de escolha para o usuário.
-
Analise software, anotando 2D ressonâncias NMR para três picos bem dispersos e resolvidos para cada Estado de proteína. Grave as amplitudes de pico para cada um dos seis picos para cada condição de buffer contendo NBB156 (Figura 5A).
- Usar o CARA para preparar uma lista de lote-integração (rubrica clique em Main Menu "espectro | Configurar lista de lote"...) de todos os espectros coletados e analisar usando um arquivo de atribuição único pico (rubrica clique em Main Menu "picos | Peaklist de importação"... e escolher um arquivo definido pelo usuário .peaks com 6 picos totais, 3 para cada Estado de proteína, definidos dentro).
- Ajustar as configurações ("integrador | Ajustar o modelo pico"...) de largura X 0,06 ppm e Y-largura 0,30 ppm (rubrica clique em Main Menu "integrador | Ajustar o modelo pico"...) antes de gravar a saída final em duas seleções de menu (1. Clique Menu principal título "integrador | Integrar a lista de lote") (2. Clique Menu principal título "picos | Exportar tabela de integração") (Figura 5B).
Nota: As ressonâncias de amida de espinha dorsal para resíduos M21, V53 e L105 foram atribuídas para o estado de fechado-cinta de156 NBB. O estado aberto-cinta foi atribuído ao ressonâncias de amida de espinha dorsal dos resíduos G130 e A141 e a Épsilon próton cadeia lateral ressonância de W133 usando 3D NMR experimentos24.
- Normalize as amostras para comparação directa de ímãs diferentes ou condições de amostra em média as três amplitudes aberto-cinta das amostras de referência e calculando um fator de normalização, relativos as duas referências. Calcule as amplitudes dimensionadas para ressonâncias de156 NBB usando o fator de normalização e amplitudes negativas de ajuste a zero (tabela 2).
Exemplos: 1) comparando amostras de ímãs diferentes: ímã A, NBB156DDM e ímã B, NBB156+ DDM. 2) detergente comparação: 0,34 mM DDM e 1,7 mM DDM. - Calcular para cada ressonância a fração reduzida da fechado - ou aberto-cinta, dividindo com o intervalo de mínimo para máximo amplitude de todos os espectros coletados contendo referências apropriadas da enciclopédia NBB156 e totalmente aberto-cinta NBB156 em detergente.
- Plotar as amplitudes de NMR normalizadas em função da concentração de lipídios e comparar a fração de aberto-cinta NBB156 em diferentes condições (figura. 5C).
Nota: Como alternativa, análise da fração de conformação fechada-Segurem-se contra a concentração de lipídios pode ser realizada para comparar a ligação de lipídios a NBB156. Preferimos a análise anterior, porque é mais rápido e melhores relatórios sobre a fração totalmente-noivos por lipídios.
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Representative Results
Visualizar regulamentados necroptosis execução em células vivas foi possível através da expressão inducible de uma construção mínima de MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Essa construção mantém a capacidade de induzir a permeabilização da membrana plasmática e é ativada através da oligomerização Dim-induzido da fita FKBP (2xFV). Observamos e quantificar necroptosis por microscopia de viver-pilha de imagem, monitoramento cineticamente (a cada 5 min), a absorção de um corante de ligação de DNA celular impermeável fluorescência verde (Figura 6A). Este sistema inducible é muito robusto, e necroptosis completa de MEFs mlkl- / - pode ser observado dentro de ~ 1 h após mediada por Dim oligomerização de Dox-pré-incubada células que expressam o NBB140-2xFV-Venus (Figura 1A ). Nos referimos a estas condições como rápido-cinética necroptosis. Expressão de Venus sozinho ± Dim ou NBB140-2xFV-Venus na ausência de Dim não induz a necroptosis (Figura 6A). Normalmente realizamos pelo menos 3 replicar experiências de imagens em triplicado ou quadruplicado em 24-, 96 ou 384 poços chapas.
O necroptosis rápido-cinética induzida por dimerização forçada do NBB140-2xFV-Venus (Figura 6A) apoia o papel do MLKL como o carrasco putativo de ruptura da membrana plasmática. Para visualizar a redistribuição do NBB140-2xFV-Venus para a membrana plasmática durante necroptosis, microscopia confocal viver-pilha é usado para monitorar a fluorescência de Venus. Durante necroptosis rápido-cinética, dentro de 2-3 min de incubação com Dim, Venus, revestimento da periferia célula é observado, seguido por célula gradual arredondamento (1 filme). NBB140-2xFV-acúmulo de Venus na membrana plasmática é visualizado pela microscopia confocal TIRF, que incide sobre o volume celular na interface de membrana de vidro do citosol-plasma. Membrana plasmática associada a partitura de Vênus são visíveis dentro de 1 a 2 min de incubação com Dim (filme 2). Assim, aplicada a oligomerização do NBB140-2xFV-Venus induz sua redistribuição rápida à membrana plasmática.
Microscopia eletrônica (SEM) é uma ferramenta poderosa para revelar as mudanças morfológicas nas células em fase necroptosis. Sob necroptosis rápido induzido pela oligomerização do NBB140-2xFV-Venus, células alterar morfologia normais formas alongadas (tempo 0 min) para de arredondado e inchou (5 min) para parcialmente rompido (10 min) e extensivamente desmantelado onde tem o citosol desapareceu (20 min) (Figura 6B). SEM complementa as observações anteriores de microscopia de viver-pilha correlacionando localização MLKL para a membrana plasmática com ruptura da membrana. Em geral as técnicas de microscopia apresentadas oferecem meios complementares para monitorar, avaliar e quantificar necroptosis nível celular e implicar NBB140-2xFV-Venus na execução de ruptura da membrana plasmática.
Para determinar se o MLKL pode contatar diretamente a membrana plasmática, realizamos em vitro experiências vinculação lipídios monitoradas por espectroscopia NMR usando recombinante NBB156. Diluições em série de micelas de lipídios-detergente, usando uma constante concentração de detergente (veículo para apresentação de lipídios) e concentrações de lipídios variável, são testadas para a ligação com 15N-rotulado NBB156 por espectroscopia de RMN 2D, que alterações de monitores induzida por ligação na proteína. NBB156 sofre mudanças estruturais importantes sobre lipídios vinculando a deslocar a região cinta inibitório (aminoácidos 132-156) do fechado e helicoidal (chave fechada) para a conformação aberta e intrinsecamente desordenado (chave de abrir) (Figura 7 A). A espectroscopia NMR bidimensional fornece informações de resíduo em misturas de ambos os conformistas (Figuras 7B-7C) por. Nós anteriormente atribuído as amidas de espinha dorsal de ambos os conformistas24. Podemos facilmente monitorar as percentagens de conformistas abertas e fechadas numa determinada amostra conforme descrito nas figuras 5A-C. Usando este ensaio, nós exploramos vinculação de156 NBB para PIPs em detergente DDM, que é inerte a NBB156 vinculação (Figura 5B). Neste ensaio, PIP2 é o melhor ligante de156 NBB, que induz a abertura total do contraventamento inibitório em 125 µM (Figura 5-C). Em contraste, saturada (18:0) insaturado (18:1) PI e PI são ligantes de156 NBB pobres induzindo parcial joelheira abertura nas mesmas condições (Figura 5-C). Nosso ensaio baseado em NMR lipídica fornece prova de apoio para a interação do MLKL NBB156 com fosfolipídios e sugere uma ligação directa entre MLKL e a membrana plasmática.
Figura 1: Estável abrigando um Tet-na 3 G inducible sistema modificado de linha celular. Linhas de célula estável (A) foram geradas por transdução retroviral do/mlkl- / - MEFs com a pTREX-rtTA-explosão seguida o pRetroX-TRE3G-NBB140-2xFV-Venus-puro. Cada transdução foi seguida pela seleção de antibióticos para até 1 semana antes de passar para as análises subsequentes. (B) representação esquemática do sistema de expressão inducible MLKL. Este sistema baseia-se em 2 etapas reguladoras droga-inducible: i) MLKL expressão dos genes e produção de proteína (+ Dox) e ii) ativação por oligomerização (+ Dim). Quando a produção de proteína é induzida em avanço, + Dox, necroptosis rápido-cinética podem ser acionadas, + Dim. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Imagem latente da viver-pilha de necroptosis rápido-cinética revela relocalization membrana rápida do MLKL. (A) Fast-cinética necroptosis induzido como na figura 1B podem ser monitorados em um sistema da imagem latente. Necroptosis é marcado pela utilização de célula-impermeável corante fluorescente verde. (B) representação esquemática da imagem latente da viver-pilha de necroptosis rápido-cinética com epifluorescência e total análise de microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Representação esquemática de varredura, análise e preparação de amostras de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Células de necroptosis rápido-cinética induzida conforme descrito na Figura 1 são fixadas na placa em pontos diferentes de tempo depois da adição do Dim. As células são então preparadas para análise SEM por raspagem e pool, coloração de heavy metal, resina incorporação e revestimento de irídio, conforme descrito na seção 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Amostra preparação e recolha de dados para titulações NMR de micelas de156 e lipídios-detergente de NBB N 15. Este ensaio e análise geralmente é executada em 3-4 dias: durante o dia 1, alíquotas de lipídios são dispensadas e secas durante a noite. Durante o dia 2, os filmes de lipídios são reidratados em ensaio tampão ± detergentes, lisados e diluídos em série (duplo) misturando volumes iguais da solução lipídica rehidratado com solução tampão isento de lipídios. Cada diluição é lisada para garantir mistura homogênea e distribuição dos lipídios em micelas detergentes antes de diluições subsequentes. Amostras da proteína são misturadas nas diluições serial lipid-detergente micelle, carregadas nos tubos NMR apropriados, colocadas em um carregador de SampleCase (ou carregadas manualmente), e recolha automática de dados NMR é iniciada. Durante os dias subsequentes, a coleta de dados NMR é concluída e seguida de 2D NMR de análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Preferências de lipídios-vinculação do NBB156 medido usando 2D NMR. (A) sobreposta espectros de TROSY N 1H -15para 15N-NBB156 na presença (vermelha) ou ausência (azul) de 125 µM PI (4,5) P2 em 0,34 mM DDM visualizado na CARA. (B) unidimensional fatias de ressonâncias usadas para medições de amplitude e normalização. O espectro cru (verde) é sobreposto com o limite de amplitude e integração pelo programa CARA. (C) Normalized amplitudes de NBB156 na presença de micelas phosphoinositide-DDM plotagem contra a concentração de lipídios. PIP2 induz a abertura total do contraventamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Necroptosis fast-cinética induzida pela oligomerização do NBB140-2xFV-Venus em/mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis quantificação por imagens de fluorescência de alto rendimento de absorção de corante fluorescente verde de célula-impermeável, DNA-ligando. Indução necroptosis robusta só é observada após induzida por Dim oligomerização do NBB140-2xFV-Venus, mas não na ausência de Dim. Também são realizados experimentos de controle somente de Vênus. Todas as condições são feitas em triplicado e são plotadas como média e replicar SD de um representante. (B) necroptosis Fast-cinética induzida na presença de Dim visualizado com microscópio eletrônico de varredura. O tempo muda de curso revela morfológicas necroptosis subjacente, incluindo célula arredondamento e inchaço (5 min), a ruptura da membrana plasmática (10 min) e complete o extravasamento do citosol (20 min). Cada amostra tinha um número semelhante de células no tempo 0 min. Da esquerda para a direita, a área ampliada contém 26, 32, 23 e 36 células com núcleos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Vinculação de NBB156 para remodelamento monitorizado por espectroscopia NMR. (A) 1H -15espectro TROSY N de 15N-NBB156. As mudanças químicas de ressonâncias usadas para normalização do espectro joelheira fechada ou quantificação do estado aberto são realçadas com quadrados ou círculos, respectivamente. Certa, esquema de assinaturas NMR detectada na ausência ou presença de micelas de lipídios-detergente. NBB156 não bind micelas detergentes DDM na ausência de remodelamento. (B) sobreposta espectros de TROSY N 1H -15de 15N-NBB156 na presença das respectivas micelas de lipídios-detergente. (C) Single- 1H - espectros de TROSY N15de 15N-NBB156 na presença das respectivas micelas de lipídios-detergente de painel B. Detectando as conformações abertas e fechadas sem ambiguidade em misturas das duas conformações nós pode quantificar as percentagens dos dois conformistas numa determinada amostra. PIP2 é o ligante de lipídios preferencial do NBB156 , fornecendo uma ligação directa entre MLKL e fosfolipídios da membrana plasmática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tampão PCR (10x) | Μ l 5.0 |
| Modelo de DNA (100 ng / µ l) | 1,0 Μ l |
| os cDNAs para MLKL, 2 x FKBP, Venus) | |
| dNTPs (25 mM cada NTP) | 0,5 Μ l |
| Iniciadores de PCR para a frente (F) (100 ng / µ l) | 1.3 Μ l |
| Iniciadores de PCR para a frente (FR (100 ng / µ l) | 1.3 Μ l |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| F 2xFKBP | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Vênus F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Venus R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA polimerase (2,5 U / µ l) | 1,0 Μ l |
| Água destilada deionizada (ddH2O) | 39,9 Μ l |
| Volume total de reação | 50,0 Μ l |
| Parâmetros de ciclagem do PCR | |
| 1 ciclo | 94-98 ° C; 45 s |
| ciclos de 25 – 30 | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C; 45 s | |
| 72 ° C; 1-2 min | |
| 1 ciclo | 72 ° C; 10 min |
Tabela 1: reação de PCR de NB 140 -2xFV-Venus para a enzima de restrição-baseado clonagem em pRetroX-TRE3G.
Tabela 2: dados brutos para espectro RMN, apresentado na Figura 5, ilustrando a transformação normalizada de dados coletados de um segundo ímã NMR para o estado da chave de abertura média calculada. Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Filme 1: necroptosis Fast-cinética induzida pela oligomerização de NBB 140 -2xFV-Venus em mlkl- / - MEFs. Viver a microscopia confocal, mostrando a rápida translocação do NBB140-2xFV-Vênus do citosol para a membrana plasmática após oligomerização forçada do domínio FKBP. As células foram tratadas conforme descrito na Figura 1. Amarelo: NBB140-2xFV-Vênus. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Movie 2: microscopia TIRF de cinética rápida necroptosis. Microscopia TIRF mostrando relocalization rápido (~ 2 min) e agregação de MLKL na membrana do plasma após adição de Dim mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Venus. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Nós fornecemos os protocolos para técnicas que nós combinamos implicados MLKL como o carrasco putativo de ruptura de membrana plasmática24. Além de decifrar a rede regulamentar que regula MLKL-mediada necroptosis, estas técnicas podem ser usadas independentemente para caracterizar outros sistemas biológicos adequados. Praticamente falando, estas técnicas são ferramentas de descoberta de médio para baixo-taxa de transferência.
Rotineiramente usamos imagem latente da viver-pilha do NBB140-2xFV-Venus-mediar a necroptosis e que induzida por outras construções MLKL, mecanicamente, dissecar o Regulamento do MLKL em necroptosis através de mutagénese e usando pequena molécula química sondas. Em particular, nós e outros grupos têm demonstrado que humana e construções de rato de MLKL que contêm a mínima região do NBB podem mediar necroptosis em humanos e linhas de células de rato. Um relatado ressalva que regem necroptosis mediada por MLKL é especificidade de espécies de interação RIPK3 e MLKL, que impede que a reactividade cruzada entre espécies observadas após estimulação montante por combinação de TNF, smac mimetics e caspase inibição 25,35,36. Nesse sentido, humana e mouse RIPK3 e proteínas MLKL não reagem de forma cruzada sob estas condições,25,35,36. Para contornar as limitações de entre as espécies, apresentamos as mutações que ativar MLKL humana ou usam fitas oligomerização como mostrado aqui para NBB140-2xFV-Venus24. Humano NBB140 é uma construção que mantém a região inibitória e, portanto, permanece inativo no contexto do NBB140-2xFV-Venus. Dimerização do 2xFV é pensada para ativar o NBB140 liberando a cinta. Em contraste, humano NBB182 induz necroptosis mesmo na ausência de oligomerização, porque essa construção é capaz de oligomerize espontaneamente24. Além disso, aponte os mutantes (R30A, R30E, E136A e E136R) ativando região NB no contexto do longa-metragem MLKL humano superar a necessidade de ativação por fosforilação de RIPK324. Além disso, nós reconstituído dimerizable RIPK3 humano (Cerulean-2xFV-RIPK3) e Dox-inducible completos humano MLKL-Vénus, que são compatíveis e robustamente induzir necroptosis em/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . Outros recentemente revelaram mutações adicionais ou domínio humano-mouse trocadas construções MLKL que podem superar a espécie especificidade barreiras25.
Nós normalmente otimizar as condições de ensaio de necroptosis através da realização de vários experimentos de gama de avarias em placas de 96 poços. Então seguimos com experimentos otimizados em placas de 24 poços, que fornecem células suficientes para multiplexação com a classificação de celular ativado fluorescente complementar (FACS) e ocidentais mancha as análises realizadas posteriormente nas mesmas amostras imediatamente após o ponto de tempo final de imagem. Atualmente, a imagem latente da viver-pilha baseia-se na detecção de fluorescência verde e vermelha, limitando as possibilidades de rotulagem para muitas aplicações. Uma alternativa comum para corantes fluorescentes verdes é o célula-impermeável iodeto de propidium tintura fluorescente DNA-ligando (PI). Instrumentos de imagem dual cor oferecem a opção de usando estes corantes com proteínas fluorescentes verdes ou vermelhas complementares para aprimorar o conteúdo utilitário e informações de necroptosis de imagem.
A capacidade do MLKL para translocar para a membrana plasmática após sua ativação, faz ao vivo microscopia a técnica de escolha para estudar a biologia desta proteína e acompanhar em tempo real a morfológica muda necroptosis subjacente. Microscopia TIRF inequivocamente resolve MLKL agregados de proteínas na membrana plasmática, especialmente quando executado na presença de marcadores que co localizar para a membrana plasmática. Nós usamos LCK-C-RFP como um marcador para a membrana plasmática localização co24. A capacidade de proteínas de marca de interesse com fluorophores diferentes, também permite estudar simultaneamente a atividade de várias proteínas envolvidas no mesmo processo. A próxima geração de microscopia de super-resolução parcialmente supera o problema de limite de difração em microscopia confocal padrão e tem o potencial para revelar características adicionais de necroptosis MLKL-mediada.
Dentre as principais características da necroptosis é a permeabilização da membrana plasmática. Mesmo que várias técnicas indiretamente podem quantificar ou indicar rupturas de membrana, apenas EM Visualizar descontinuidades na integridade da membrana de plasma induzido por MLKL. Enquanto TEM tem o maior poder de resolução, SEM tem a capacidade de mapear áreas maiores do espécime. Esta característica, combinada com o desenvolvimento de um novo e poderoso software capaz de gerenciar o maior volume de dados, aprimorou-se o utilitário de SEM em caracterização de morfologia celular. Além disso, SEM também é capaz de digitalizar secções consecutivas amostra permitindo a reconstrução 3D quando acoplado a outros sistemas, como feixe de íon focalizado. Algumas das desvantagens da análise EM incluem o custo da instrumentação e manutenção, a necessidade de pessoal altamente especializado e investimento de tempo significativo na análise e processamento de amostra.
Os ensaios de mancha de ponto têm sido utilizados originalmente para fazer conexões diretas entre MLKL e fosfolipídios de membrana plasmática16,27. Nosso ensaio baseado em NMR lipídico definitivamente implica MLKL vinculação de fosfolipídeo específicos, destacando o PIP2 como o ligante MLKL de escolha. Nossos resultados demonstram um efeito deletério da saturação de cadeia acil sobre vinculação de156 NBB a fosfatidilinositol. Todavia, como vinculação MLKL PIP2, e potencialmente outros fosfolipídios, resulta em ruptura de membrana plasmática permanece desconhecido. Usando este protocolo qualquer outro fosfolipídeo pode ser testado para a ligação com MLKL. Nosso ensaio serve como uma ótima ferramenta para testar modelos emergentes de necroptosis MLKL-mediar, como ele pode ser usado com mutantes de MLKL e vários ligantes para identificar as contribuições específicas para vinculação de lipídios. Além disso, ele pode ser usado para quaisquer outros sistemas de membrana associada a interrogar seus perfis de ligação de lipídios.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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