Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

Published: July 28, 2018 doi: 10.3791/58139
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

نحن ينص بروتوكول في المختبر فحوصات التنظيم الذاتي للعقل والأعمال المتعلقة بالألغام على بلير دهن معتمدة في دائرة مفتوحة. بالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف كيفية أرفق المقايسة في الدهن يرتدون ميكروكومبارتمينتس PDMS تحاكي ظروف في فيفو برد فعل الحبس.

Abstract

جوانب عديدة من تنظيم خلايا الزمانية المكانية الأساسية تحكمها نظم نوع نشر رد فعل. في المختبر إعادة تشكيل نظم من هذا القبيل يسمح لدراسات تفصيلية لآلياتها الأساسية التي لن يكون بالإمكان في المجراة. هنا، نحن نقدم على بروتوكول لإعادة نظام مينكدي الإشريكيّة القولونيةالتي المواقف حاجز انقسام الخلية في منتصف الخلية في المختبر . المقايسة مصمم للعرض فقط المكونات اللازمة للتنظيم الذاتي، هما غشاء والبروتينات هما العقل والأعمال المتعلقة بالألغام والطاقة في شكل ATP. ولذلك نحن اختﻻق دائرة رد فعل مفتوحة على ساترة، الذي يتشكل بلير دهن معتمدة. يسمح تصميم الدائرة المفتوحة للإعداد الأمثل لبلير الدهن والتي تسيطر عليها التلاعب بمضمون الجملة. ثم تتم إضافة البروتينات اثنين، العقل والأعمال المتعلقة بالألغام، كذلك ATP، في حجم الجملة أعلاه الغشاء. من الممكن تصوير بالعديد من ميكروسكوبيس البصرية، كما يدعم تصميم [كنفوكل]، وواسع المجال ومجهرية TIRF على حد سواء. ويتكون بلير الدهن في اختلاف من البروتوكول، على دعم منقوشة، على شكل الخلية المجهرية PDMS، بدلاً من الزجاج. خفض الحل الأكبر إلى حافة هذه المقصورات يرفق رد فعل في حجرة صغيرة، ويوفر الحدود التي تسمح لمحاكاة سلوك متذبذبة في فيفو . أخذت معا، يمكننا وصف البروتوكولات إلى إعادة تشكيل النظام مينكدي على حد سواء مع ودون حبس المكانية، يسمح للباحثين التحكم بدقة في جميع الجوانب التي تؤثر في تشكيل النمط، مثل نطاقات التركز، وإضافة عوامل أخرى أو البروتينات، وزيادة تعقيد النظام في إعداد تجريبية بسيطة نسبيا بشكل منهجي.

Introduction

أنماط الزمانية المكانية ضرورية في طبيعتها، وتنظم مهام معقدة على حد سواء على مستوى متعددة الخلايا والهاتف الخلوي، من morphogenesis إلى انقسام الخلية ينظم1،2. نظم نشر رد فعل دوراً هاما في إنشاء هذه الأنماط، ولكن هي لا تزال غير مفهومة. مثال على نظام نشر رد وأفضل النظام البيولوجي تتسم حتى الآن مينكدي الإشريكيّة القولونية نظام4،3،5،،من67. النظام مينكدي يتذبذب من خلية القطب إلى القطب الخلية في كولاي لتحديد منتصف الخلية كموقع شعبة مستقبلا. ويقوم هذا النظام على العقل ATPase، ATPase تفعيل البروتين في الأعمال المتعلقة بالألغام، والغشاء ك رد فعل مكانية مصفوفة8. MinC ليس جزءا من نمط تشكيل إليه، بل هو عامل الوظيفية الفعلية: المانع من البروتين الرئيسي ديفيسومي فتسز5،6. MinC بربط العقل وذلك يتبع الذبذبات، نتج عنه تدرج تركيز بروتين متوسط الوقت القصوى في أقطاب الخلية والحد الأدنى في منتصف الخلية، فقط السماح فتسز بلمرة في ميدسيل9،10 . نظام مينكدي هو جزء من الأسرة الكبيرة من أتباسيس بوكر التي أساسية للمنظمة الزمانية المكانية في البكتيريا2، لتحديد المواقع، ونقل البروتين المجمعات11 ووالبلازميدات12 وتنظيم الخلية شعبة13 وكروموسوم الفصل14. ومن ثم، نظام نشر رد فعل مينكدي يمثل نظام نشر رد فعل التوراتية، بل جذبت أيضا اهتمام بسبب أهميتها بالنسبة للمنظمة الزمانية المكانية في البكتيريا.

الدراسات الفنية المفصلة مينكدي النظام في فيفو معقدة، كالتلاعب بالجينات والبروتينات حذف عادة إلى عيوب انقسام الخلية. وعلاوة على ذلك، يتم تغيير تكوين غشاء أو خصائص سيتوسول في فيفو صعبة للغاية15،16. إدخال تغييرات على النظام، والعوامل المؤثرة التي يصعب تفسيره في بيئة معقدة من الخلية، وحتى أكثر من ذلك إذا كانت تشعر بالانزعاج في وظيفة أساسية كانقسام الخلية. نحن وآخرون ولذلك تحولت إلى نهج إعادة تشكيل في المختبر ، تخفيض النظام إلى عناصره الأساسية: العقل، الألغام، ATP كمصدر للطاقة، وبلير الدهن معتمدة كرد فعل مصفوفة6،17، 18. ويسمح هذا النهج التصاعدي للتحقيق في إليه التنظيم الذاتي بالتفصيل دون التعقيد لخلية حية. شكل البروتينات السفر سطح موجات6 وأنواع أخرى من أنماط،من1719 في ظل هذه الظروف، أن كان ذلك مع طول موجه التي عادة حول حجم أكبر من فيفو. يسهل استخدام دائرة مفتوحة لدقة السيطرة على جميع جوانب التأثير على تشكيل نمط: تركيزات البروتين6و خصائص البروتين20و تكوين غشاء10، تكوين المخزن المؤقت وتركيز ATP 6، فضلا عن إضافة عوامل أخرى مثل الازدحام وكلاء21 وأخرى بروتينات ديفيسومي22. وبالمقارنة، يمكن استخدامها في المختبر إعادة تشكيل نظام مينكدي في19،18،تدفق خلية23 للتحقيق في تأثير تدفق17،23، البروتين الحد من الشروط19و تكوين غشاء19 و حبس كامل 3D18 على أنماط البروتين، ولكن يعرض عنصر تحكم دقيق لتركيز البروتين/المكون وإضافة مكون متسلسلة أكثر تعقيداً.

باستخدام هذه الدائرة المفتوحة، ونحن أيضا منقوشة دعم بليرس الدهن مستو بموجبه أحد التحقيق كيف هندسية حدود تأثير نمط تشكيل21، هي ظاهرة مؤخرا أيضا بالتحقيق في فيفو باستخدام البكتيريا مصبوب في المجهرية7. استخدمنا هذا الفحص للتحقيق في كيفية تعريف الطفرات في الأعمال المتعلقة بالألغام أيضا يؤثر على نمط تشكيل نظام20. وعلاوة على ذلك، استخدمت نفس تنسيق التحليل الأساسي للتحقيق في كيفية تشكيل نمط يمكن التحكم بالضوء، إدخال ببتيد الألغام أزوبينزيني-كروسلينكيد المقايسة، والتصوير مع TIRF المجهري24.

ووجدنا أن تشكيل الاحتفال من أجل تكرار نمط MinDE في فيفو في حبس نظام، في المختبر هو المفتاح. يسمح باستخدام ميكروكومبارتمينتس على شكل قضيب، مع أبعاد تعديل للطول الموجي أكبر من MinDE في المختبر (10 × 30 ميكرومتر)، يرتدون ملابس مع بيلايير دهن معتمدة إعادة تشكيل MinDE القطب إلى القطب ذبذبات وتشكيل البروتين التدرج 10،25. في هذا التحليل، تودع بليرس الدهن معتمدة على الركازة PDMS منقوشة الذي يحتوي على النسخ المتماثلة مئات عدة من ميكروكومبارتمينتس على شكل قضيب التي تبقى مفتوحة في الجزء العلوي. بذلك، يمكن إعداد رد الفعل في دائرة مفتوحة، وبعد ذلك يتم تخفيض المخزن المؤقت إلى حافة ميكروكومبارتمينتس، وبالتالي حصر رد الفعل على وحدة تخزين صغيرة. على الرغم من هذه المقصورات واجهة المخزن مؤقت هواء على جانب واحد وبالتالي لا تمثل حبس كامل 3D بغشاء، يحاكي ديناميات البروتين في فيفو ذبذبات10،25. مقارنة بحبس كامل 3D، مما يدل على مشابهة جداً ينتج18، المقايسة المجهرية المفتوح بسيطة وسهلة نسبيا التعامل معها، ويمكن أيضا أن يقوم بها المختبرات التي ليست مجهزة بمعدات ميكروفلويديكس المتخصصة و مرافق غرفة نظيفة.

نقدم هنا، على بروتوكول تجريبي لإعادة تشكيل مينكدي يؤيد تشكيل نمط في دهن بليرس في المختبر باستخدام دائرة مفتوحة لتسمح بمراقبة جميع مكونات وسهولة الوصول بالمجهر الضوئي، ومع القاصر التعديلات، هي أيضا قابلة للتكيف لتقنيات التحقيق سطح26. بجوار بليرس الدهن معتمدة مستو، نعرض أيضا كيف يمكن أن تكون الولادة البروتين المتحصل عليها باستخدام بليرس بسيطة من الدهن معتمدة منقوشة على شكل قضيب PDMS المجهرية. هذه الاختبارات، على الرغم من أن الأمثل لنظام مينكدي، يمكن أيضا نقلها إلى نظم البروتين الأخرى التي تتفاعل بطريقة مشابهة مع الغشاء، مثل فتسز27 أو لحاء أكتين أدنى28.

Protocol

1-البروتين الإنتاج

  1. تعبير البروتين
    1. تحويل BL21 كولاي بليس (DE3) مع بلازميد كل منهما للتعبير عن العقل6، اجفب-العقل29، mRuby3-العقل24، الألغام6 أو MinC30. خرائط بلازميد، يرجى الاطلاع على المعلومات التكميلية.
    2. تلقيح ثقافة بين عشية وضحاها في المتوسط رطل مع مستعمرة واحدة باستخدام المضادات الحيوية الخاصة بكل منها (مثلاً100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين أو 50 ميكروغرام/مل كاناميسين) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 14-16 بينما تهتز.
    3. تطعيم 500 مل من السل المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية ذات الصلة بالثقافة بين عشية وضحاها (تخفيف 1: 200) واحتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية بينما تهز 180 لفة في الدقيقة.
    4. حمل التعبير البروتين بإضافة 0.5 مم إيبتج عندما يصل الثقافة بكثافة بصرية في 600 نيوتن متر من 0.5-0.7. في حالة اجفب-العقل أو العقل mRuby3، إزاحة الخلايا إلى حاضنة مع 16 درجة مئوية وتنمو خلايا ح 14-16، وفي حالة MinC أو العقل أو الأعمال المتعلقة بالألغام، وتنمو خلايا ح 3-4 في 37 درجة مئوية بعد التعريفي.
      ملاحظة: التعريفي MinC أو العقل أو الألغام التعبير السامة للخلايا، كنتائج overexpression في انقسام الخلية العيوب؛ ومن ثم، فمن المهم أن يبقى وقت الحضانة عند 37 درجة مئوية أدناه ح 4. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من البروتين، زيادة مقدار الثقافة، ولكن ليس حضانة الوقت.
    5. بعد الحضانة كل وقت حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 4000 x ز لمدة 10 دقائق وتخزين بيليه الخلية في-80 درجة مئوية حتى استخدام المزيد.
  2. تنقية البروتين
    ملاحظة: يمكن تنقية البروتينات أما استخدام شحنت ني-جاتا الأعمدة على نظام تنقية بروتين الآلي أو باستخدام الخرز ني-الإدارة الوطنية للسياحة لتنقية مقاعد البدلاء تدفق الجاذبية.
    1. لتنقية شحنت ني-جاتا أعمدة على البروتين الآلي تنقية نظم استخدام المخزن المؤقت A1 (50 مم فوسفات الصوديوم pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم)، المخزن المؤقت B1 (50 مم فوسفات الصوديوم pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 20 ملم)، والمخزن المؤقت C1 (الصوديوم 50 مم فوسفات pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 250 ملم). لتنقية مقاعد البدلاء التدفق خطورة استخدام ني-جاتا الخرز استخدام المخزن المؤقت A2 (50 مم تريس-HCl pH 8.0، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم) والمخزن المؤقت B2 (50 مم تريس-HCl pH 8.0، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 20 ملم)، والمخزن المؤقت C2 (50 مم تريس-HCl pH 8.0، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 250 ملم). تكملة كافة المخازن المؤقتة مع 10 ملم ß-mercaptoethanol أو 0.4 مم تسيب (tris(2-carboxyethyl)phosphine) كعامل تخفيض الحق قبل الاستخدام.
    2. الخلايا ريسوسبيند في 20-30 مل من المخزن المؤقت A1 أو A2 تزويده بملغ2 +-ADP يدتا خالية من مثبطات البروتياز، 100 ميكروغرام/مل lysozyme، الدناز يو/مليلتر ~ 250 و 0.2 مم (Mg2 +ADP-في حالة تنقية العقل أو العقل اجفب فقط، من 100 مم ADP الأسهم في 100 مم مجكل 2 مع درجة الحموضة تعديلها إلى 7.5.)
    3. الخلايا باستخدام سونيكاتور نصيحة (السعة 30%، 2.5 دقيقة، 30 ثانية النبض، 30 s إيقاف) مع الحفاظ على القنينة التي تحتوي على الخلايا في حمام الثلج.
    4. إزالة الحطام خلية بواسطة سينتريفوجينج الخلية على 45 دقيقة في 25,000 س ز و 4 درجة مئوية.
    5. احتضان المادة طافية على عمود ني-جاتا أو الخرز ني-الإدارة الوطنية للسياحة.
      1. شحنت الأعمدة ني-جاتا، تحميل العينة على العمود باستخدام مضخة عينة نظام تنقية البروتين الآلي.
      2. لتنقية أعلى مقاعد البدلاء، احتضان العينة مع الخرز ني-الإدارة الوطنية للسياحة في أنبوب 50 مل رد على شاكر الدورية عند 4 درجة مئوية عن ح 1. للخطوات اللاحقة، نقل الخرز ني-الإدارة الوطنية للسياحة في عمود فارغ باستخدام ماصة 25 مل.
    6. يغسل مع أحجام العمود 5 على الأقل من المخزن المؤقت A1 أو A2.
    7. يغسل مع أحجام العمود 5 على الأقل من المخزن المؤقت B1 أو B2.
    8. الوت البروتين مع المخزن المؤقت C1 أو C2.
    9. تقييم نقاوة البروتين عن طريق صفحة الحزب الديمقراطي الصربي.
    10. الاختياري: كذلك تنقية البروتين قبل تطبيقه على عمود ترشيح جل اكويليبراتيد في المخزن المؤقت لتخزين (50 مم حبيس/كوه pH 7.2، 150 مم بوكل، والغليسيرول 10%، 0.1 مم يدتا، 0.4 مم تسيب، (0.2 مم Mg2 +-ADP في حالة العقل)).
      ملاحظة: من المستحسن هلام الترشيح للعقل إزالة جزء من البروتين مجمعة.
    11. إذا كان يعمل لا جل-الترشيح، تبادل ني-جاتا شطف المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت لتخزين (50 مم حبيس/كوه الرقم الهيدروجيني 7.2، 150 مم بوكل، والغليسيرول 10 ٪، يدتا 0.1 ملم، 0.4 مم تسيب، (مم 0.2 مغ-شرطة أبوظبي في حالة العقل)) باستخدام جاذبية تدفق الملحي العمود (انظر الجدول للمواد).
    12. صدمة-تجميد البروتينات في مختبرين في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    13. قياس تركيز البروتين المخزون باستخدام "مقايسة برادفورد"، وتحديد نشاط البروتين مع الإنزيم أتباسي20.
      ملاحظة: لا تقدير تركيز البروتين باستخدام الامتصاص في 280 نانومتر. وجود النوكليوتيدات أثناء تنقية العقل وعدم تريبتوفانس في الأعمال المتعلقة بالألغام تشوه قياسات تركيز280 . برادفورد الاستخدام أو اتفاق التعاون الأساسي فحوصات لقياس تركيزات البروتين بدلاً من ذلك.
  3. وسم البروتين
    ملاحظة: الانصهار بروتين فلوري للبروتين الصغيرة الألغام يستحث الرئيسية التغييرات على خصائص انتشارية ووظيفة؛ ومن ثم وضع العلامات الكيميائية من البروتين (سيستين في موقف 51) المفضل على الانصهار للبروتينات الفلورية.
    1. حل 0.125 مغ المتقارن صبغ ماليميدي في 5-10 ميليلتر من [دمس] (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) وإضافة إطار تهتز لمل 0.5 منجم الكوة في المخزن المؤقت لتخزين عند درجة الحموضة 7-2، أعدت كما هو مفصل أعلاه.
    2. احتضان 2 (ح) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 2 في RT تحت تهز لطيف أو إثارة.
    3. صبغ منفصلة والبروتين باستخدام تدفق جاذبية الملحي العمود اكويليبراتيد مع المخزن المؤقت لتخزين (50 مم حبيس/كوه الرقم الهيدروجيني 7.2، 150 مم بوكل، والغليسيرول 10 ٪، يدتا 0.1 ملم، 0.4 مم تسيب).
    4. كذلك إزالة أي صبغة فاتحة، دياليزي البروتين ضد وجود فائض من المخزن المؤقت لتخزين.
    5. التحقق من وضع العلامات الناجحة عن طريق قياس الانقراض في الحد الأقصى لصبغ كل منهما وحساب كفاءة وضع العلامات المقدرة. يرجى الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة صبغ لبروتوكول مفصلة لتقدير درجة وضع العلامات. تحليل مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتحديد مجموع الكتلة بقياس الطيف الكتلي لمزيد من المعلومات المفيدة حول تجانس العينة ونجاح وضع العلامات.

2. إعداد الصغيرة أونيلاميلار حويصلة (سيارات الدفع الرباعي)

  1. جيل حويصلات مولتيلاميلار
    1. حساب كمية lipid(s) في كلوروفورم الخليط المطلوب الخاص بك حجم سيارات الدفع الرباعي النهائي. وينبغي التركيز 4 مغ/مل الدهون في المخزن المؤقت دقيقة (25 مم تريس-HCl pH 7.5، 150 مم بوكل، 5 مم مجكل2). مقايسة دقيقة قياسية يوصي بخليط DOPC:DOPG 7:3 (مول في المئة). عند استخدام الدهن القطبي كولاي استخراج، استخدام SLB المخزن المؤقت (25 مم تريس-HCl pH 7.5، 150 مم بوكل) لجميع خطوات التحضير.
      ملاحظة: لا ينصح لأول مرة للمستخدمين لاستخدام استخراج الدهن القطبي كولاي كما جيل بيان متجانسة مع هذا الخليط تحديا أكبر بكثير.
    2. استخدام ماصة تشريد إيجابية مع نصائح الزجاج، مزيج من الدهون في كلوروفورم في قنينة زجاج 1.5 مل.
      1. الجاف للدهون تحت تيار نيتروجين طفيفة حين تحول القنينة ببطء. مكان الدهون تحت دفق نيتروجين أقوى لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ضع قنينة تحتوي على الفيلم الدهن المجففة في مجفف فراغ وتطبيق فراغ على الأقل 1 ح.
    3. ترطيب الدهون في المخزن المؤقت الحد الأدنى من فورتيكسينج في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح الخليط البلوتينيوم معتمة.
      ملاحظة: لجيل حويصلات أونيلاميلار صغيرة من حويصلات مولتيلاميلار، الدهون يمكن أما مقذوف كما هو موضح في 2.2. أو سونيكاتيد كما هو موضح في 2.3. وبصفة عامة، البثق غلة أضيق حجم توزيع التي يمكن أن تساعد في تشكيل بليرس الدهن المعتمدة.
  2. إعداد سيارات الدفع الرباعي بقذف
    1. كسر المجاميع الدهن وهياكل مولتيلاميلار وكذلك جعل الدهون بذوبان التجميد لدورات 7 إلى 10.
      1. تحضير كوب مع الماء عند 70 درجة مئوية إلى 99 درجة مئوية على طبق ساخن وحاوية مع النتروجين السائل.
      2. عقد القنينة في النتروجين السائل بملاقط كبيرة حتى يتوقف النيتروجين الغليان. ثم نقل القنينة الماء الساخن حتى الحل هو مذاب تماما. كرر هذه الخطوات حتى يظهر واضحا للعين، وتبعاً لهذا الخليط خليط الدهن.
    2. تجميع الطارد دهن وشطف قبل النظام مع المخزن المؤقت لدقيقة. بثق خليط الدهن بين 35 و 41 مرات عبر غشاء من 50 حجم المسام في شمال البحر الأبيض المتوسط. تأكد من وضع حد على عدد فردي من تصاريح الدخول لتجنب المجاميع التي اجتاز الغشاء ابدأ.
  3. إعداد سيارات الدفع الرباعي سونيكيشن
    1. لأفضل حل تعيين الدهون في المخزن المؤقت، وتضع القنينة الزجاجية التي تحتوي على الحل في كتلة حرارة إلى 37 درجة مئوية ودوامه كل 20 دقيقة لمدة 1 دقيقة. احتضان في المجموع لحوالي 1 ساعة.
    2. تزج أسفل القنينة في حمام سونيكاتور (في هذا العمل 1.91 لتر، 80 واط) عن طريق إرفاق القنينة على موقف المشبك في الارتفاع المطلوب.
    3. تعيين ارتفاع المياه في حمام سونيكاتور حيث أن الحل المحيطة القنينة هو تحريكها جيدا قبل البقول و sonicate خليط الدهن لمدة 20 دقيقة. التحقق من وجود سونيكيشن ناجحة بتقدير وضوح الدهون.
  4. يمكن تخزين عند 4 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع سيارات الدفع الرباعي أو المجمدة في-20 درجة مئوية في مختبرين الصغيرة (~ 20 ميليلتر) وتخزينها لعدة أسابيع. إذابة الجليد في قنينات أو الأنابيب في درجة حرارة الغرفة و sonicate مرة أخرى كما هو موضح تحت 2.2.3 أو 5.3 حتى الحل الواضح قبل استخدام سيارات الدفع الرباعي لإعداد أيد بليرس الدهن (بيان). الرجاء يضيع علما بأن توزيع المساحة الضيقة لسيارات الدفع الرباعي التي تم الحصول عليها بقذف بعد التجميد وما تلاه من ذوبان الجليد و sonication.

3-تنظيف الزجاج كوفيرسليبس

ملاحظة: تنظيف وهيدروفيليزيشن من الزجاج كوفيرسليبس عاملاً هاما بليرس الدهن المعتمدة متجانسة والسوائل. يمكن تنظيف زجاج كوفيرسليبس استخدام حل البيرانا، مصنوعة من نسبة حامض الكبريتيك 7:2 إلى 50% فوق أكسيد الهيدروجين (3.1)، أو مع بلازما أكسجين في بلازما أنظف (3.2). كلا الأسلوبين إلى نتائج مماثلة.

  1. تنظيف البيرانا كوفيرسليبس
    1. تطبيق الحل البيرانا
      1. توزيع كوفيرسليبس الزجاج على طبق بيتري زجاج مقلوب أو غيرها من سطح خامل. مع ماصة زجاجية، إضافة 7 قطرات حمض الكبريتيك (98 في المائة) إلى مركز كل ساترة.
        تنبيه: حمض الكبريتيك الحمضية بشدة والتآكل. يعمل في خزانة الأبخرة ومع المعدات الواقية المناسبة فقط.
      2. إضافة نقطتين بيروكسيد الهيدروجين 50% إلى وسط قطرات حمض.
        تنبيه: بيروكسيد الهيدروجين التآكل في العينين والجلد.
      3. تغطية رد فعل واحتضان لمدة 45 دقيقة على الأقل.
        ملاحظة: وقت الانتظار الحد الأقصى هنا ليست حاسمة بالنسبة لنتائج التجربة ويمكن أن تمتد إلى عدة أيام.
    2. تنظيف البيرانا أغسل كوفيرسليبس.
      1. التقاط كوفيرسليبس شكل فردي باستخدام الملقط وشطف حمض مع الماء عالي النقاوة. مكان كوفيرسليبس غسلها في أصحاب غير عصا أو الأجهزة المماثلة في النقل.
      2. شطف كل ساترة على نطاق واسع مع الماء عالي النقاوة وجفف السطح مع الغاز المضغوط (النيتروجين، والهواء إلا إذا كانت خالية من النفط). مارك إلى جانب تنظيفها ساترة مع علامة دائمة.
  2. تنظيف البلازما كوفيرسليبس
    1. أشطف كوفيرسليبس مع الإيثانول الزائدة، وبعد ذلك مع فائض المياه عالي النقاوة. كوفيرسليبس الجافة بالغاز المضغوط. قم بتجميع الدائرة كما هو موضح في 4.
    2. بعد قاعة الجمعية العامة كما هو موضح في 4 تأخذ كوفيرسليبس مع الدائرة المرفقة ومكان في البلازما أنظف مع الأكسجين كغاز عملية. تنظيف كوفيرسليبس مع البلازما (في هذه السلطة 30% عمل، 0.3 ضغط الأكسجين [مبر] لمدة 1 دقيقة واستخدمت). قم بتنظيف الحق قبل تشكيل SLB كما هو موضح في 5، كتأثير هيدروفيليزينج لتنظيف البلازما يلبس على مر الزمن.
      ملاحظة: توقيت وقوة البلازما التنظيف ينبغي أن يكون الأمثل باستخدام الأغشية المسمى فلوريسسينتلي، جداً قليلاً أو تنظيف البلازما المفرط يمكن أن كلاهما يؤدي إلى الأغشية غير متحرك أو أغشية ذات ثقوب.

4-قاعة الجمعية العامة

  1. مع مقص حاد، قطع وتجاهل الغطاء والجزء المخروطي من أنبوب رد فعل 0.5 مل. تطبيق الأشعة فوق البنفسجية-الغراء إلى الحافة العليا من الأنبوب وتوزيعها بالتساوي باستخدام تلميح ماصة.
  2. الصق الأنبوب رأسا إلى ساترة تنظيفها مسبقاً. في حالة البيرانا التنظيف تأكد من الصقه إلى جانب تنظيف الزجاج. علاج الأشعة فوق البنفسجية-الغراء بوضع دوائر متعددة تحتها مصباح nm 360 أو الصمام لمدة 5 إلى 15 دقيقة.

5-يؤيد تشكيل الدهون بلير (SLB)

  1. قبل الحرارة كتلة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، واحتضان 2 مل رد فعل أنابيب مع المخزن المؤقت لدقيقة أو SLB، أنبوب 1 كل دائرة.
  2. ضربة النيتروجين في الدوائر المجتمعة وعلاجه لإزالة أي غبار أو الجزيئات الأخرى التي قد استقر خلال علاج الأشعة فوق البنفسجية، والجمعية العامة. تنظيف البلازما كما هو موضح في 3.2 إذا كنت لا تنظيف الخاص بك كوفيرسليبس مع البيرانا الحل (3.1). ضع دوائر على كتلة الحرارة.
  3. تمييع قاسمة 20 ميليلتر من الدهون واضحة (في 4 مغ/مل) مع ميليلتر 130 دقيقة المخزن المؤقت أو المخزن المؤقت SLB في حالة استخراج الدهن القطبي كولاي ، مما أسفر عن تركيز عامل 0.53 ملغ/مل. في حال تم تجميد الدهون، sonicate أولاً بعقد الأنبوب في سونيكاتور حمام قبل إضافة المخزن المؤقت، ثم sonicate مرة أخرى مع المخزن المؤقت.
  4. إضافة ميليلتر 75 من خليط الدهن لكل دائرة، وتعيين جهاز ضبط وقت لمدة 3 دقائق (لخلائط دوبك/دوبج؛ حضانة أطول قد يكون ضروريا بالنسبة لمخاليط الدهون الأخرى). في حالة استخراج الدهن القطبي كولاي ، "الماصة؛" كاكل2 من أصل 100 مم إلى الدائرة لتركيز نهائي من 3 مم. خلال فترة حضانة المرض، الحويصلات تنفجر على سطح الزجاج ماء والصمامات لتشكيل SLB متماسكة.
  5. بعد مرور 60 ثانية، إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت دقيقة لكل دائرة.
  6. الغسيل الدوائر: بعد آخر 120 ثانية (مجموع 3 دقائق) يغسل كل دائرة بإضافة ميليلتر 200 من المخزن المؤقت دقيقة أو SLB، بيبيتينج بدقة أعلى وأسفل عدة مرات، إزالة وإضافة آخر 200 ميليلتر.
    1. بعد أن تم غسلها كل دائرة مرة واحدة، انتقل إلى غسل الدائرة الأولى جيدا حتى 2 مل من المخزن المؤقت المستخدمة. الغسيل لبيان يحتاج بعض الخبرة للكمال القدر الطلبات في الدائرة وإيجاد كثافة الغسيل الصحيح.
      ملاحظة: ابدأ إزالة السائل كل من الدائرة بتجنب تجفيف SLB.
      ملاحظة: على رأس الغسيل، تتنوع خصائص الغشاء تبعاً للعديد من العوامل الإضافية: نوع من الدهون وعلى تركيزات النسبية في دهن المزائج، أسلوب إعداد لسيارات الدفع الرباعي، السطحية العلاج والتنظيف المسبق للدعم.

6-التنظيم الذاتي بالانزيم

  1. ضبط حجم المخزن المؤقت في قاعة ميليلتر 200 دقيقة العازلة مطروحاً منها كمية البروتين والحل ATP، ثم أضف العقل، المسمى العقل، الأعمال المتعلقة بالألغام، وكذلك، إذا رغبت، MinC. مزج المكونات بلطف بيبيتينج. مثال على تركيزات من 1 ميكرومتر العقل (يخدر بنسبة 30% اجفب-العقل)، 1 ميكرومتر الألغام (يخدر مع 10% كيميائيا يسمى الألغام) و 0.05 ميكرومتر MinC، ولكن أنماط تشكل أكثر من مجموعة من تركيزات6،10،،من2030 .
  2. إضافة 2.5 ملم ATP (من الأسهم ATP 100 ملم في 100 ملم مجكل2، الرقم الهيدروجيني 7.5) البدء في التنظيم الذاتي ل MinDE.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف ترتيب إضافة مكون (العقل والأعمال المتعلقة بالألغام و ATP) ولن تؤثر على النتيجة النهائية نمط4.
  3. مراقبة MinDE التنظيم الذاتي في المجهر الفلورية (انظر الجدول للمواد). ويمكن أيضا ملاحظة MinDE التنظيم الذاتي باستخدام الفحص المجهري TIRF. للتصوير اجفب-العقل، واستخدام الليزر الأرجون 488 في شمال البحر الأبيض المتوسط أو ليزر صمام ثنائي قابلة للمقارنة (مثل، 490 نيوتن متر). للتصوير mRuby3 العقل، فمن الأفضل توظف 561 نانومتر ليزر صمام ثنائي.
    ملاحظة: تجنب المستويات العالية من الإثارة لأوقات أطول كما نحن وآخرون لاحظنا17 الضيائية في نظام MinDE، مما يؤدي إلى البلمرة البروتين لا رجعة فيه على الغشاء.

7-PDMS المجهرية

ملاحظة: PDMS (بولي دايمثيل سيلوكسان) هو بوليمر التي يمكن استخدامها لإنتاج المجهرية وأجهزة موائع جزيئية. رقاقة سيليكون منقوشة بمثابة قالب الصب بنيات PDMS. ثم هياكل PDMS بمثابة دعم لتشكيل SLB والاعتداء الإعداد.

  1. أما إنتاج رقاقة السيليكون مع ميكروكومبارتمينتس نفسك باستخدام الطباعة الحجرية التصويرية (انظر زيسكي وشويل للبروتوكول مفصلاً31 أو Gruenberger et al. ل بروتوكول فيديو32) أو النظام الخاص بك رقاقة السيليكون المرجوة من الصب . لنمط يفر المستخدمة هنا الرجاء راجع المعلومات التكميلية.
  2. إنتاج PDMS المجهرية من رقائق السليكون منقوشة.
    1. استخدم كوب بلاستيك لوزن 10 جرام من قاعدة PDMS وز 1 من PDMS crosslinker. أما استخدام جهاز خلط لمزيج ديغا الخليط PDMS أو مزيج يدوياً في PDMS وثم ديغا تحت الفراغ.
    2. استخدام تلميح ماصة بإسقاط كمية صغيرة من PDMS مباشرة على الهيكل على رقاقة السيليكون.
      ملاحظة: احرص على عدم خدش رقاقة السيليكون.
    3. فورا ساترة #1 على إسقاط PDMS وتأخذ نهاية العلوي من تلميح ماصة نظيف اضغط برفق ساترة على رقاقة السيليكون. ينبغي أن ينتشر PDMS رقيقة بين ساترة ورقاقة السيليكون.
    4. ضع يفر مع كوفيرسليبس داخل فرن وعلاج في PDMS لمدة 3-4 ساعات أو بين عشية وضحاها في 75 درجة مئوية. إزالة يفر من الفرن وندعه يبرد وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة. مع شفرة حلاقة، بعناية إزالة ساترة مع PDMS المرفقة من الدولية الاشتراكية ويفر.
      ملاحظة: للحيلولة دون الحصول على قذرة أو تلف رقاقة السيليكون، تغطي دائماً المجهرية مع PDMS وساترة. ومع ذلك، ومن ثم الإعمار PDMS، أسفر عن الشقوق في المجهرية، عدم استخدام PDMS الهياكل التي مضى عليها أكثر من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع.

8-التنظيم الذاتي في PDMS المجهرية

  1. ووصف استخدام كوفيرسليبس مع PDMS المجهرية لإرفاق دائرة تحت 4.
  2. تنظيف وهيدروفيليزي السطح في بلازما أكسجين نظافة كما هو موضح تحت 3.2.2. هل عدم البيرانا ركائز نظيفة PDMS.
  3. الإعداد فحص تنظيم الذاتي MinDE كما هو موضح تحت 6.
  4. بعد إعداد المقايسة، تحقق لتشكيل نمط MinDE العادية والمجهرية المشكلة بشكل صحيح في المجهر الأسفار.
  5. عندما شكلت أنماط MinDE العادية (10-30 دقيقة)، بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مرتين لخلط المكونات وثم إزالة المخزن المؤقت خطوة بخطوة عن طريق بيبيتينج. إزالة كميات كبيرة من المخزن المؤقت باستخدام 100 ميليلتر ماصة ثم قم بإزالة بقية استخدام ماصة 10 ميليلتر عناية.
    ملاحظة: قد تحتاج هذه الخطوة بعض الممارسة. إذا كان المخزن المؤقت كبير جداً مأخوذ أو العملية تستغرق وقتاً طويلاً، المجهرية سوف تكون جفت؛ إذا كان أيضا أخذ القليل، البروتينات لا تنحصر في المجهرية، ولكن لا تزال تشكل السفر الموجات السطحية.
  6. فورا إغلاق الدائرة مع غطاء لتجنب تجفيف المخزن المؤقت المتبقية في المجهرية.
  7. للسماح لأوقات أطول في التصوير، توصيل ترطب قطعة من الأسفنج داخل الدائرة ثم قم بإغلاق مع غطاء. تأكد من الأسفنج لا اتصال سطح ساترة.
  8. قبل تصوير الشيك المجهرية على السطح أن المخزن المؤقت الذي تم خفض ما يكفي، حيث أنه قد أوقف في السطح أعلاه تشكيل نمط MinDE المجهرية. صورة MinDE التذبذبات في المجهرية. تحقق من أن لا جفت المجهرية أو يتم تجفيف أثناء التصوير.
    ملاحظة: تجاهل كوفيرسليبس مع ميكروكومبارتمينتس بعد كل استخدام، كالشقوق في شكل PDMS.

9-تحليل تشكيل نمط MinDE

  1. تحديد طول الموجه وسرعة الموجه وملامح الموجه للتنظيم الذاتي MinDE على مستو الدهن معتمدة بيلاييرس. فيجي مع المجموعة من الإضافات حزم القياسية غير كافية للتحليل الأساسي33.
  2. تحليل ذبذبات القطب إلى القطب في ميكروكومبارتمينتس بالحصول على كيموجرافس وبلغ متوسط الوقت البروتين تركيز الملامح. يمكن الحصول على كيموجرافس الأساسية بإعادة تشريح سلسلة زمنية على طول خط تحديد في فيجي.

Representative Results

تنقية البروتين بعد أن البروتوكول ينبغي أن تسفر عن البروتينات دقيقة من النقاء الكافية. ويقدم الشكل 1 كمرجع، صورة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة العقل، المسمى فلوريسسينتلي العقل والأعمال المتعلقة بالألغام، و MinC. يتم وصف الخطوات الفردية من الإجراءات لتنفيذ مقايسة تنظيم الذاتي MinDE على بيلاييرس الدهن المعتمدة غير منقوشة في الشكل 2. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن ملاحظة منتظمة MinDE السفر الموجات السطحية في جميع أنحاء الدائرة (الشكل 3). الطول الموجي يمكن أن تختلف بشكل طفيف داخل الدائرة، ولكن بشكل عام تبدو أنماط مشابهة. ينبغي أن لا تستخدم حواف الدائرة للمقارنات الكمية، كالأغشية أن النموذج على الغراء الأشعة فوق البنفسجية ويبدو أن لها خصائص مختلفة من على الزجاج السطحية (انظر الشكل 3). يمكن تحليل الموجات السطحية السفر بالتآمر كثافة على طول اتجاه نشر (الشكل 3B). بينما العقل fluorescence هضاب سريع بدلاً من الحافة الأمامية للموجة وثم يتناقص بشدة على حافة trailing، الأسفار الألغام يزيد تقريبا خطيا من بدء موجه العقل وتصل إلى الحد الأقصى بعد العقل في الحافة، حيث أنها يقع قبالة ملحوظة6.

إلى جانب جودة البروتين، نوعية بليرس الدهن المعتمدة الأكثر أهمية لتنظيم الذاتي منتظم مينكدي. من ناحية إذا كان الغشاء يتم غسلها أيضا مفرطة أو تم تنظيفها وهكذا اتهم أيضا بقوة على السطح الأساسي، يمكن أن تشكل ثقوب في الغشاء (الشكل 6A، أعلى). من ناحية أخرى إذا لم يتم غسلها الغشاء بشكل صحيح أو السطح الأساسي ليس تنظيف/هيدروفيليزيد، ستلتزم الحويصلات الغشاء أو سيولة الغشاء سوف يتعرض للخطر (الشكل 6A، أسفل). حتى وأن كان ليس واضحا كما عند مراقبة الغشاء مباشرة عن طريق الدهون المسماة، يمكن أيضا اكتشاف هذه المشاكل من إشارة fluorescence العقل، أنماط غير عادية، والأسفار في الحدود القصوى ليست متجانسة ولكن يحتوي على "ثغرات" أو النقاط المضيئة كما هو مبين في الفريق الأوسط من الشكل 6A.

ويرد الإجراء للتنظيم الذاتي في شكل قضيب المجهرية PDMS MinDE في الشكل 4. العديد من الخطوات البروتوكول لا تحتاج إلى تكرار، كما يمكن إعادة استخدام البروتينات والدهون. مثل على ركائز غير منقوشة، هو تنظيف الركازة وهيدروفيليزيد (بواسطة تنظيف البلازما)، تتشكل بلير دهن معتمدة على PDMS ويتم إعداد المقايسة التنظيم الذاتي في حجم 200 ميليلتر. للتحقق من أن شكلت غشاء سليم وينظم MinDE ذاتيا على الغشاء، يتم تصويرها في الدوائر. عندما تم تشكيل، أشكال MinDE السفر العادية الموجات السطحية على سطح PDMS بين المجهرية الفردية غشاء سليم وكما ينظم ذاتيا في الجزء السفلي من المجهرية كما يمكن الموجات بحرية التحرك عبر كامل المغطاة بغشاء السطح (الشكل 5A). بعد إزالة المخزن المؤقت، ينبغي على السطح بين الأقسام لا تظهر أي أنماط MinDE نشر (الشكل 5 (ب))، كما ينبغي أن تكون جافة تماما. إذا كانت الأنماط MinDE لا تزال تتحرك، المخزن المؤقت أكثر تحتاج إلى إزالتها. البروتينات تنحصر الآن في ميكروكومبارتمينتس على شكل قضيب PDMS يرتدون ملابس الغشاء والهواء على الواجهة العلوية (الشكل 5)، فيها أنها ستنظم ذاتيا. في ظل هذه الظروف يمكن أداء البروتينات هما ذبذبات القطب إلى القطب كما هو موضح في الشكل 5. كما جزء بسيط من العقل والأعمال المتعلقة بالألغام دائماً غشاء زمنياً، أيضا أثناء إزالة المخزن المؤقت، تركيزات بعد إزالة المخزن المؤقت غير قابلة للمقارنة لإدخال تركيزات. سبب هذا التأثير التركيزات أيضا تختلف بين المجهرية الفردية على ساترة نفسها كما أنها تعتمد على موقف الأنماط قبل إزالة المخزن المؤقت. يمكن أن يؤدي إنتاج رقاقة السيليكون أو صب PDMS من رقاقة السيليكون ناقصة المجهرية التي لا يمكن استخدامها لتحليل (الشكل 6B). علاوة على ذلك، نظراً للمخزن المؤقت المجهرية إزالة قد تجف أثناء العملية، ومن هنا، ينبغي أن تستبعد من مزيد من التحليل (الشكل 6B). وكنتيجة لذلك يظهر سوى جزء صغير من المجهرية في دائرة واحدة ذبذبات القطب إلى القطب المنشود. لتحليل ديناميات البروتين في المجهرية، ويمكن الحصول كيموجراف الرسم تحديد على هيكل كامل (الشكل 5E). عندما يتذبذب مينكدي من القطب إلى القطب، MinC والعقل سوف تظهر تدرج تركيز متوسط الوقت مع التركيز الأقصى في القطبين المقصورة وتركيز الحد الأدنى في منتصف المقصورة (5F الشكل).

Figure 1
رقم 1: الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عرض المنتجات النهائية لتنقية البروتين. صاحب العقل (33.3 كاتشين)، صاحب العقل اجفب (60.1 كاتشين)، صاحب العقل mRuby3 (59.9 كاتشين)، صاحب المنجم (13.9 كاتشين) وصاحب MinC (28.3 كاتشين) تظهر في النظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مخطط تدفق عملية عرض الخطوات الفردية وتوقيت البروتوكول بالنسبة تنظيم الذاتي في الدهن المعتمدة غير منقوشة بيلاييرس (الخطوات 1-6)- تشير خانات متقطع إلى أن أحد هذين الخيارين يمكن استخدامها للتنظيف. الأسهم التي تميزت بالدوائر تشير إلى حيث يمكن مؤقتاً البروتوكول واستؤنفت في وقت لاحق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التصوير للمقايسة MinDE بالفحص المجهري [كنفوكل]- A) دوامة "دقيقة منتظمة"، منها سرعة انتشار الموجه، وكثافة الأرض والسرعة ويمكن الحصول على القياسات. التركيزات المستخدمة: 0.6 ميكرومتر العقل (30% اجفب--العقل)، 1.8 ميكرومتر صاحب--الألغام (30% صاحب-الألغام-Alexa647) ب) الأرض كثافة طبيعية مثال للمنطقة ملحوظ في ألف ج) نظرة عامة على غرفة الفحص الكامل (شريط مقياس: 1 مم، وتركيزات البروتين نفسه ك أعلاه). اللوالب تحول أي من الاتجاهين، وكذلك يمكن ملاحظة أنماط الهدف. المنطقة المكبرة يظهر كيف تختلف أنماط الموجات في الأشعة فوق البنفسجية-الغراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: مخطط تدفق عملية عرض الخطوات الفردية وتوقيت للبروتوكول من أجل التنظيم الذاتي في شكل قضيب المجهرية (الخطوات 1-5، 7، 8). مربعات رمادية تبين الخطوات حيث يمكن إعادة استخدام المنتجات من البروتوكول على بليرس الدهن المعتمدة غير منقوشة. الأسهم التي تميزت بالدوائر تشير إلى حيث يمكن مؤقتاً البروتوكول واستؤنفت في وقت لاحق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: نتائج تمثيلية ل MinDE نمط تشكيل في شكل قضيب ميكروكومبارتمينتس PDMS. A) MinDE تنظيم ذاتي على سطح PDMS تشكيل السفر الموجات السطحية (العقل 1 ميكرومتر (30% اجفب-العقل)، 2 ميكرومتر الألغام و 2.5 ملم ATP). ب) بعد المخزن المؤقت خفضت إلى ذروة المجهرية، التنظيم الذاتي البروتين يتوقف على سطح مستو بين ميكروكومبارتمينتس. ج) التخطيطي من ميكروكومبارتمينت على شكل قضيب واحد. د) الصور التمثيلية لتذبذبات القطب إلى القطب MinDE بعد إزالة المخزن المؤقت. ه) كيموجراف للذبذبات على طول الخط المميز هو موضح في الفقرة د). و) الصورة والشخصية على الأسفار متوسط كثافة السلاسل الزمنية المبينة في د) تبين بوضوح التدرج البروتين القصوى في القطبين ميكروكومبارتمينت والحد الأدنى في حجرة الأوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: أمثلة لنتائج التجارب السلبية- A) الأغشية الإفراط المغسول تتراكم الثقوب، بينما الاستعدادات حويصلة دون المستوى الأمثل والتراكيب الدهن يؤدي إلى الخلاف حويصلات. لوحات مركز اثنين تظهر مجموعة من المشاكل وكيف تصبح مرئية عند مراقبة ذبذبات دقيقة. كانت المسمى الأغشية مع 0.05% Atto655-منشطات. (مقياس أشرطة: 50 ميكرومتر) ب) أعلى اللوحة: جفت ميكروكومبارتمينتس يمكن أن يحدث بالكثير بإزالة المخزن المؤقت أو عند المخزن المؤقت يتبخر مع مرور الوقت. لوحة أسفل: المقصورات ناقصة ويمكن أن تشكل خلال إنتاج رقاقة أو صب PDMS. (مقياس أشرطة: 30 ميكرومتر) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الملف التكميلي 1: بلازميد خريطة لصاحب العقل. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: بلازميد خريطة للعقل اجفب له. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: بلازميد خريطة للعقل mRuby3 له. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: بلازميد خريطة لصاحب المنجم. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: بلازميد خريطة لصاحب MinC. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 6: ملف CAD السليكون ويفر من ميكروكومبارتمينتس على شكل قضيب. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

لقد قمنا بوصف بروتوكول لإعادة التنظيم الذاتي مينكدي على مستو في المختبر المعتمدة بيلاييرس الدهن وفي الدهن تغطيها bilayer هياكل ثلاثية الأبعاد، وباستخدام مثال على شكل قضيب PDMS المجهرية. من أجل الحصول على بيانات قيمة من هذه الاختبارات، أهم العوامل لمراقبة نوعية البروتين والغشاء.

لضمان جودة البروتين، البروتين ينبغي تأكيد الكتلة باستخدام صفحة الحزب الديمقراطي الصربي والطيف الكتلي. وعلاوة على ذلك، فإنه ينبغي التحقق من أن البروتينات القابلة للذوبان وغير مجمعة، باستخدام الترشيح جل التحليلية أو تشتت الضوء الحيوي. يمكن استخدام هلام الترشيح لإزالة أي جزء مجمعة من البروتينات. ضبط الأس الهيدروجيني حذراً ونوعية من النيوكليوتيدات وأضاف أمر بالغ الأهمية، لإضافة النوكليوتيدات المتدهورة جزئيا أو غير المعدلة للبروتين الأرصدة أو فحوصات ذاتية التنظيم كافية للقضاء على نشاط البروتين، وبالتالي إلغاء التنظيم الذاتي.

بجوار نوعية البروتين، ونوعية الغشاء الأكثر أهمية، وتكوين غشاء غير لائق في أغلب الأحيان هو السبب للتنظيم الذاتي المعيبة، والمنشأ لهياكل السطحية أرتيفاكتوال.

عند تنفيذ البروتوكول للمرة الأولى، يكون من المفيد لتسمية بليرس الدهن معتمدة من بينها الدهون المسماة مثل أتو-655-المخدر أو دي في انخفاض نسب المولى (0.05%). وبالتالي أن خصائص ونوعية الغشاء يمكن الحكم مباشرة. باستخدام فراب، ويمكن تقييم سيولة الغشاء. وعلاوة على ذلك، واحد مباشرة تقييم نوعية الغسيل من SLB، كما سيكون هناك أما تكون حويصلات كثيرة جداً، لا يوجد غشاء السائل أو لا غشاء على الإطلاق، إذا كان قد تم غسله. يسمح نهج الدائرة المفتوحة دقة يغسل الغشاء، وبالتالي أيضا إزالة الحويصلات التي تتمسك على السطح SLB. أهم العوامل للحصول على السوائل ومتجانسة الدهن المعتمدة بيلاييرس بالتنظيف وهيدروفيليسيتي على السطح التأييد والحجم الصحيح وتجانس سومقابل فإنه يمكن أن يكون مفيداً للتحقق من حجم سيارات الدفع الرباعي وحجم التوزيع باستخدام تشتت الضوء الحيوي. لتوزيع حجم الضيقة، نوصي بالانبثاق الحويصلات بدلاً من سونيكاتينج لهم. طرق أخرى للتنظيف كوفيرسليبس، مثلاً، من العلاجات مع قواعد قوية، والمنظفات الأساسية، أو باستخدام كوفيرسليبس مباشرة بعد الشطف بالماء، قد تسفر عن نتائج جيدة، اعتماداً على التطبيق والدهن المخلوط.

النصف الأول من البروتوكول المعروضة هنا، في المختبر إعادة تشكيل على بليرس مستو الدهن المعتمدة في الدوائر المفتوحة، يتميز بتقديم السطح موجوداً ميكروسكوبيس البصرية، مثل TIRF المجهري30، فراب تحليل6، واحد-الجسيمات تتبع34، فضلا عن تقنيات التحقيق السطحي مثل مجهر القوة الذرية26. منطقة متجانسة كبيرة تسمح لإحصاءات أفضل بتركيزات محددة. وعلاوة على ذلك يسمح نهج الدائرة المفتوحة التحكم بدقة في تركيز البروتين وسريعة وبسيطة بإضافة المزيد من المكونات، ومن ثم السماح لتركيز البروتين في دائرة واحدة20تيتراتي. ويمكن أيضا توسيع المقايسة قبل إضافة المكونات الأخرى ديفيسومي البكتيرية مثل فتسز22،35، زيبا22 أو10،فتسز-يفب-MTS البروتين تشيميريك35.

مجموعات أخرى قد اتخذت نهجاً مماثلاً لإعادة تشكيل دقيقة النظام في المختبر، لكن استخدام تدفق خلية بدلاً من18،17،دائرة مفتوحة19. تدفق الخلايا لها مزايا معينة، لا سيما عندما بيئة 3D مغلقة تماما هو المطلوب18، تأثير تدفق17،،من1923 أو تكوين غشاء23 في أنماط مينكدي التحقيق، أو إذا كانت أنماط البروتين التي يتعين مراعاتها تحت بروتين يحد من الظروف19. ومع ذلك، السيطرة المحلية على تركيزات الجزيئي أكثر صعوبة. مكونات البروتين، لا سيما العقل، بشدة ربط الغشاء أنها أول لقاء18،19. في تجربتنا، يحمل البروتينات غالباً غير محددة ملزمة للأنابيب ومداخل والمحاقن وسائر أجزاء موائع جزيئية. ومن ثم، تركيزات البروتين المحلية تختلف عن تركيزات الإدخال18 وتختلف أيضا على طول التدفق الخلية، أسفرت عن مجموعة متنوعة من أنماط مختلفة من البروتين في الغشاء بين مدخل ومخرج، كما لاحظ آخرون19.

الثاني نصف من البروتوكول المعروضة هنا، إعادة تشكيل في المختبر في المجهرية على شكل قضيب إعادة استخدام نهج الدائرة المفتوحة على دعم منقوشة مشمولة بالمادة الدهنية بليرس يسمح تقليد بسيط من السلوك في فيفو البروتين حتى ولو دقة السيطرة على تركيزات البروتين فقدت بسبب إزالة المخزن المؤقت. لاحظ أن لأن الطول الموجي ل MinDE أمر واحد تقريبا من حجم أكبر في المختبر من فيفو ميكروكومبارتمينتس على شكل قضيب أيضا حول واحد حجمه أكبر (10 × 30 ميكرومتر) من على شكل قضيب كولاي الخلية.

وعموما، يسمح هذا البروتوكول لمراقبة دقيقة لجميع الظروف بما في ذلك تركيز البروتين وتكوين المخزن المؤقت وخصائص الغشاء. يتيح استخدام 3D يدعم تنظيماً رد فعل على دراستها تحت الحبس المكانية، محاكاة السلوك في فيفو دون الحاجة إلى معدات معقدة ميكروفلويديكس.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر مايكل هايمان وفرانك زيدلر لإنتاج السليكون قوفرات، الأساسية مرفق MPI-ب للمساعدة في تنقية البروتين وكريتشمير سيمون وهارينغتون ليون للتعليقات على المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
DOPG Avanti Polar Lipids 840475
E.coli polar lipid extract Avanti Polar Lipids 100600
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate Roche
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma A5285-1G
Sodium chloride VWR 27810.295
Potassium chloride Roth 6781.1
Tris-base Sigma Aldrich T1503-1kg
Hydrochloric acid Roth 9277.1
TCEP-HCl Termo Fisher Scientific 20491
Ethylene Diamine Tetraacetate Merck Millipore 1.08418.1000
Sulfuric Acid 98% Applichem 173163.1611
Hydrogen Peroxide 50% Applichem 147064.1211
HEPES Biomol 05288.1
dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 102950 Uvasol
Glycerol 86% Roth 4043.1
TB medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roth 2316.x
Atto-655-DOPE Atto Tec AD 655-161
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
PDMS base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
PDMS crosslinker Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue Norland Products 6801 #68 and #63 both work well
Coverslips #1.5 24x24 mm Menzel Gläser
Coverslips #1 24x24 mm Menzel Gläser used only for PDMS microstructures
0.5 ml reaction tube Eppendorf  0030123301
culture flask 2L Corning e.g. 734-1905
His-Trap HP GE Healthcare Life Sciences
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column Biorad 7322010
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL Termo Fisher Scientific 66333 or 66330
razor blade
Instruments
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Merck
automated protein purification system: Äkta Pure GE Healthcare Life Sciences
bath sonicator Branson e.g. Model 1510
ARE-250 mixer Thinky Corporation
Plasma cleaner Zepto Diener electronic use oxygen as process gas
positive displacement pipettes Brand Transferpettor models with glass tips
LSM780 confocal laser scanning microscope Zeiss Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield
pET28a-His-MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
  2. Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
  3. Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
  4. Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
  5. Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
  7. Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
  8. Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
  9. Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
  10. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949 (2014).
  11. Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
  12. Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
  13. Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  14. Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758 (2014).
  15. Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
  16. Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
  17. Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
  18. Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271 (2016).
  19. Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
  20. Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).
  21. Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
  22. Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
  23. Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
  24. Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
  25. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
  26. Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
  27. Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).
  28. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116 (2013).
  29. Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
  30. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
  31. Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
  32. Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560 (2013).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
  35. Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 137، وإعادة تشكيل في المختبر، العقل، الألغام، بلير الدهن معتمدة، وتشكيل نمط، المجهرية، التنظيم الذاتي
<em>في المختبر</em> إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P.… More

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P. In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (137), e58139, doi:10.3791/58139 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter