Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

В пробирке Воссоздание самоорганизующихся структур белков на поддерживаемых липидных бислоев

Published: July 28, 2018 doi: 10.3791/58139
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

Мы предоставляем протокол в vitro самоорганизации анализов ума и шахты на поддерживаемых липидному в открытой камерой. Кроме того мы опишем, как вложить assay в липидов плакированные PDMS microcompartments для имитации условий в естественных условиях реакции заточение.

Abstract

Многие аспекты организации основных пространственно-временных клеток регулируются систем типа реакции диффузии. В vitro воссоздание таких систем позволяет для детального изучения их базовых механизмов, которые бы не удастся в vivo. Здесь мы предоставляем протокол для растворения в пробирке MinCDE системы Escherichia coli, который размещает клеточного деления перегородка в середине ячейки. Assay предназначен для питания только компоненты, необходимые для самостоятельной организации, а именно мембраны, две белки ума и шахты и энергии в виде АТФ. Поэтому мы производим камеру открытой реакции на coverslip, на которой образуется поддерживаемых липидного бислоя. Открытый дизайн камеры позволяет для оптимальной подготовки липидного бислоя и контролируемого манипулирования массового содержания. Две белки, ум и разминирования, а также АТФ, затем добавляются в основной объем над мембраной. Многие оптические microscopies, как дизайн поддерживает конфокальный, поля и TIRF микроскопии так возможна изображений. В вариант протокола липидный бислой формируется на узорной опору, на ячейку в форме PDMS микроструктур, вместо стекла. Снижение массовых решение ОПРАВЫ этих отсеков заключает реакции в меньших отсека и обеспечивает границ, которые позволяют имитация поведения в естественных условиях колебательной. Взятые вместе, мы описываем протоколы для воссоздания системы MinCDE с и без пространственной изоляции, что позволяет исследователям точно контролировать все аспекты, влияющие на формирование шаблон, например диапазоны концентраций и добавление других факторов или белки и систематически увеличивать сложность системы в относительно простой экспериментальной установки.

Introduction

Пространственно-временных структур необходимы в природе, регулирование сложных задач на многоклеточных и клеточном уровне, от морфогенеза регулируемых клеточного деления1,2. Реакции диффузии системы играют важную роль в разработке этих моделей, но до сих пор не вполне понятны. Ярким примером реакции диффузии и лучших характеризуются биологические системы пока является кишечная палочка MinCDE системы3,4,5,6,7. MinCDE система колеблется от клеток полюса к полюсу клетки в E. coli для определения середине ячейки как сайт будущего отдела. Эта система основана на ум АТФазы, активация белка, шахты и мембраны как пространственные реакции матрицы8АТФазы. MinC не является частью механизма формирования шаблона, но фактическое функциональных агент: ингибитор основных divisome белка FtsZ5,6. MinC связывается с ум и поэтому следует колебания, результате градиента концентрации белка, среднем времени, максимального на полюсах клетки и минимальным в середине ячейки, позволяя лишь FtsZ для полимеризации midcell9,10 . Система MinCDE является частью большой семьи Walker A ATPases, которые являются ключом к пространственно-временных Организации бактерии2, для позиционирования и транспортировки белковых комплексов11 и плазмид12 и для регулирования клеток Отдел13 и хромосомы сегрегации14. Следовательно система MinCDE реакции диффузии не только представляет собой систему архетипической реакции диффузии, но также привлекает внимание ввиду его значимости для Организации пространственно-временных бактерий.

Детальные функциональные исследования MinCDE системы в vivo являются сложными, как манипуляции белков и Джин удаления обычно приводит деление клеток дефектов. Кроме того, изменение состава мембраны или свойства в цитозоль в естественных условиях очень сложной15,16. Изменения в системе и воздействующие на нее факторы трудно интерпретировать в сложных условиях клетки, тем более если она нарушается в такие основные функции, как деление клеток. Мы и другие поэтому обратились к в vitro воссоздание подход, сокращения системы для ее основных компонентов: ум, шахта, АТФ в качестве источника энергии и поддерживаемых липидного бислоя как реакции матрицы6,17, 18. такой подход снизу вверх позволяет зонд механизма самоорганизации в деталях без сложность живой клетки. Белки форме путешествия поверхности волны6 и другие виды моделей,1719 в этих условиях, хотя и с длиной волны это обычно о масштабах больше, чем в естественных условиях. Использование открытой камерой облегчает точный контроль над всеми аспектами, влияющих на формирование шаблон: концентрации белка6, белков свойства20, мембраны композиция10, буфера состава и концентрации ATP 6, а также добавление других факторов, таких как давка агентов21 и другие белки divisome22. В сравнении растворения в пробирке MinCDE системы в19,поток клеток в18,23 может использоваться для зонда влияние потока17,23, белка ограничение условий19, мембраны состав19 и полное 3D камере18 моделей белков, но предоставляет точный контроль концентрации белка/компонент и последовательные компонент дополнение гораздо более сложным.

С помощью этой открытой камерой, мы также узорной поддержки Вселенский липидных бислоев, которыми можно зонда как геометрических границ влияние модель формирования21, явление, которое недавно также были исследованы в естественных условиях с использованием бактерий формованных в микроструктур7. Мы также использовали этот assay расследовать как определенные мутации в шахте влияют на модель формирования системы20. Кроме того один и тот же формат основных пробирного был нанят расследовать как модель формирования может быть проконтролирован света, введение пептида азобензол сшитый шахты в assay и изображений с TIRF микроскопии24.

Мы обнаружили, что, для того, чтобы повторить шаблон MinDE формирования наблюдаемые в естественных условиях в камере системы, в vitro был ключ. Разрешается использовать палочковидные microcompartments, с размерами скорректирована с большей волны MinDE в пробирке (10 х 30 мкм), одетый с поддерживаемыми липидному воссоздания MinDE полюса к полюсу колебаний и белка градиента формирования 10,25. В этот assay поддерживаемых липидных бислоев залегают на подложке PDMS рисунком, содержащий несколько сотен реплики палочковидные microcompartments, которые остаются открытыми на вершине. При этом реакции можно настроить в открытой камерой, и впоследствии буфер опускается на обод microcompartments, тем самым ограничивая реакция на небольшой объем. Даже несмотря на то, что эти отсеков воздуха буфера интерфейса на одной стороне и следовательно, не представляют полное 3D камере мембраной, динамики белков передразнил в естественных условиях колебания10,25. По сравнению с полном 3D камере, который показывает очень похожие результаты18, открытых микроструктур assay относительно простой и легко обрабатывать и также может быть выполнена лабораториями, которые не оснащены оборудованием специализированные микрофлюидика и Чистота-услуги.

Здесь мы представляем экспериментальный протокол для воссоздания модель формирования на поддерживаемых липидных бислоев в пробирке с использованием открытой камерой, что позволяет для контроля всех компонентов и легкий доступ по оптической микроскопии и с малой MinCDE модификации, также приспособлена для поверхности зонд методы26. Рядом с планарной поддерживаемых липидов бислоев, мы также показать, как белка родов может быть получен с помощью простых узорной поддерживаемых липидов бислоев на палочковидные PDMS микроструктур. Эти анализы, хотя оптимизирован для MinCDE системы, могут также быть переданы других белков систем, которые взаимодействуют аналогичным образом с мембраной, например FtsZ27 или минимальный актина коры28.

Protocol

1. белки производство

  1. Выражение протеина
    1. Трансформировать E. coli BL21 (DE3) pLysS с соответствующими плазмиду для выражения ум6, EGFP-ум29, mRuby3-ум24, шахта6 или MinC30. Для плазмида карты пожалуйста, смотрите дополнительную информацию.
    2. Прививок в LB среднего ночь культуры с одной колонии, с использованием соответствующих антибиотиков (например,100 мкг/мл ампициллин или 50 мкг/мл канамицин) и инкубировать при 37 ° C для 14-16 ч при встряхивании.
    3. Прививок 500 мл среды ТБ, содержащие соответствующие антибиотика с ночь культуры (разбавления 1: 200) и инкубировать культуры при 37 ° C при встряхивании в 180 об/мин.
    4. Побудить выражение протеина путем добавления 0,5 мм ИПТГ, когда культура достигает оптическая плотность 600 Нм 0.5-0.7. В случае EGFP-ум или mRuby3-ум со сдвигом в инкубаторе с 16 ° C и расти клеток для 14-16 ч, а в случае Минц, ум или мины, расти клеток для 3-4 ч при 37 ° C после индукции.
      Примечание: Индукция Минц, ум или мое выражение токсичны для клеток, как гиперэкспрессия результаты деления клеток дефекты; Следовательно важно, что время инкубации при 37 ° C хранится ниже 4 ч. Если требуется больше белка, увеличьте количество культуры, но не время инкубации.
    5. После того, как соответствующие инкубации время урожай клетки центрифугированием в 4000 x g 10 мин и хранить клетки Пелле-80 ° c до дальнейшего использования.
  2. Очистка белков
    Примечание: Белки могут быть очищены с помощью кусочки Ni-НТА столбцы на систему очистки автоматизированной белка или с помощью Ni-НТА бусы для очистки скамейке гравитации потока.
    1. Для очистки с кусочки Ni-НТА колоннами на автоматизированных белка очистки систем использования буфера A1 (50 мм натрия фосфат рН 8,0, 500 мм NaCl, 10 мм имидазола), буфер B1 (50 мм натрия фосфат рН 8,0, 500 мм NaCl, 20 мм имидазола) и буфер C1 (50 мм натрия фосфат рН 8,0, 500 мм NaCl, 250 мм имидазола). Для очистки скамейке гравитации поток с помощью Ni-НТА бусины использовать буфер A2 (50 мм трис-HCl рН 8,0, 300 мм NaCl, 10 мм имидазола), буфер B2 (50 мм трис-HCl рН 8,0, 300 мм NaCl, 20 мм имидазола) и буфера C2 (50 мм трис-HCl рН 8,0, 300 мм NaCl, 250 мм имидазола). Дополнить все буферы с 10 мм ß меркаптоэтанол или 0,4 мм TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) как восстанавливающего агента прямо перед использованием.
    2. Ресуспензируйте клетки в 20-30 мл буфера А1 или А2 дополнена ЭДТА бесплатно ингибитор протеазы, 100 мкг/мл лизоцима, ~ 250 ед/мл DNase и 0,2 мм Mg2 +- ADP (мг2 +- ADP в случае очистки ума или EGFP-ум только, от 100 мм ADP складе в 100 мм MgCl 2 с pH скорректирована до 7.5).
    3. Лизировать клетки используя кончик sonicator (30% амплитуды, 2,5 мин, 30 s пульс, 30 s выкл) при сохранении флакон, содержащий ячейки в ледяной бане.
    4. Удалите мусор клетки центрифугированием в ячейку lysate 45 мин на 25000 х g и 4 ° C.
    5. Инкубируйте супернатант на столбец Ni-НТА или Ni-НТА бусины.
      1. Для упакованных Ni-НТА столбцов загрузите образец на столбец с помощью образца насоса системы очистки автоматизированной белка.
      2. Для очистки настольное инкубации образца с бисером Ni-НТА в 50 мл трубки реакции на вращающейся шейкер на 4 ° C на 1 ч. Для последующих шагов передача Ni-НТА бусины в пустой столбец с помощью пипетки 25 мл.
    6. Вымойте с по крайней мере 5 томов столбца буфера А1 или А2.
    7. Вымойте с по крайней мере 5 томов столбца буфера B1 или B2.
    8. Элюировать белка с буфером C1 или C2.
    9. Оцените чистоту белка через SDS-PAGE.
    10. Дополнительно: Далее очистки белков, применяя его к столбцу фильтрации геля, достижение равновесного уровня в буфер хранения (50 мм HEPES/Кох рН 7,2, 150 мм KCl, 10% глицерина, 0,1 мм ЭДТА, 0,4 мм TCEP, (0,2 мм Mg2 +- ADP в случае ум)).
      Примечание: Фильтрации геля рекомендуется для ума удалить агрегированных белковых фракций.
    11. Если используется не гель фильтрация, Обмен Ni-НТА Элюирующий буфер для хранения буфера (50 мм HEPES/Кох рН 7,2, 150 мм KCl, 10% глицерина, ЭДТА 0,1 мм, 0,4 мм TCEP, (0,2 мм Mg-ADP в случае ум)) с помощью гравитации потока опреснительной столбец (см. Таблицу материалы).
    12. Шок замораживание белков в аликвоты в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C до дальнейшего использования.
    13. Оценки запасов концентрацию протеина используя Assay Брадфорд и определить активность белка с Пробирной АТФазы20.
      Примечание: Не оценить концентрацию протеина используя поглощения в 280 Нм. Присутствие нуклеотида во время очищения ума и отсутствие tryptophans в шахте исказить измерения концентрации280 . Использование Брэдфорд или BCA assays для измерения концентрации белка вместо.
  3. Белка маркировки
    Примечание: Сплавливание флуоресцентный белок для небольшой белок, шахта вызывает серьезные изменения его диффузионные свойства и функции; Следовательно химический маркировки белка (цистеина в позиции 51) предпочтительнее fusion для флуоресцентных белков.
    1. Распустить 0,125 мг maleimide краска конъюгата в 5-10 мкл ДМСО (диметилсульфоксид) и добавить под тряски до 0,5 мл шахта аликвота в буфер хранения при рН 7,2, подготовленных как описано выше.
    2. Проинкубируйте 2 h на ночь при 4 ° C или 2 h на RT под мягкий сотрясение или перемешивания.
    3. Отдельный красителя и протеина используя самотечный поток обессоливания столбец достижение равновесного уровня с буфером хранения (50 мм HEPES/Кох рН 7,2, 150 мм KCl, 10% глицерина, ЭДТА 0,1 мм, 0,4 мм TCEP).
    4. Для дальнейшего удаления любых неприсоединенной краситель, dialyze белка против избыточного хранения буфера.
    5. Проверка успешной маркировки, измеряя вымирания на максимум для соответствующих краска и рассчитать оценкам эффективности маркировки. Пожалуйста, обратитесь к инструкциям производителя краситель для подробного протокола по оценке степени маркировки. Проанализировать с SDS-PAGE и определения общей массы по масс-спектрометрии для дополнительную полезную информацию о образец однородности и маркировки успех.

2. Малый однослойных везикул (Внедорожник) подготовка

  1. Поколение multilamellar пузырьки
    1. Рассчитайте количество lipid(s) в хлороформе для вашего желаемого смеси и окончательный объем внедорожник. Концентрация должна быть 4 мг/мл липидов в буфере (рН 25 мм трис-HCl 7.5, 150 мм KCl, 5 MgCl2) мин. Для стандартного анализа мин рекомендуется смесь 7:3 DOPC:DOPG (мол %). При использовании полярных липидов E. coli экстракт, используйте SLB буфере (рН 25 мм трис-HCl 7.5, 150 мм KCl) для всех подготовительных шагов.
      Примечание: Не рекомендуется для впервые пользователям использовать экстракт полярных липидов E. coli , как поколение однородных совершила с этой смесью является гораздо более сложным.
    2. С помощью пипетки нагнетательным с стекла советы, смесь липидов в хлороформе в 1,5 мл флаконе стекла.
      1. Сухие липидов под струей небольшой азота медленно поворачивая флакона. Место липидов под сильный поток азота для 10-20 минут. Место флакон, содержащий фильм сушеные липидов в вакуумный сушильный шкаф и применить вакуум для по крайней мере 1 час.
    3. Увлажняет липидов в буфере мин по vortexing при комнатной температуре до тех пор, пока смесь не однородно непрозрачный.
      Примечание: Для поколения мелких однослойных везикул от multilamellar везикулы, липиды может либо быть экструдированный как описано в 2.2. или sonicated, как описано в разделе 2.3. В общем экструзии дает более узкий гранулометрический, который может помочь с формированием поддерживаемых липидных бислоев.
  2. Подготовка внедорожник методом экструзии
    1. Разорвать липидов агрегатов и multilamellar структур и далее солюбилизировать последнего липиды путем замораживания оттаивания для 7-10 циклов.
      1. Подготовьте стакан с водой при 70° C до 99° C на горячей плите и контейнер с жидким азотом.
      2. Держите флакон в жидком азоте с большими пинцет зафиксировалась кипения азота. Затем перенесите флакон для горячей воды до тех пор, пока решение полностью разморожен. Повторите эти шаги до тех пор, пока смесь липидов появляется ясно, глаза, в зависимости от смеси.
    2. Соберите экструдер липидов и предварительной промывки системы с буфером мин. Выдавливание липидов смесь между 35 и 41 раз через мембрану размера пор 50 Нм. Убедитесь, что конец на нечетное количество проходов, чтобы избежать агрегатов, которые никогда не пройденный мембраны.
  3. Подготовка внедорожник sonication
    1. Лучше растворяются липидов в буфере, поставьте стекло флакон, содержащий решение в блоке тепла, равным 37 ° C и вихревой каждые 20 минут на 1 минуту. Инкубируйте в общей сложности около 1 часа.
    2. Погружайте в нижней части флакона в ванне с sonicator (в этой работе 1.91 L, 80 Вт), прикрепив флакона на зажим стенда на требуемой высоте.
    3. Установите высоту воды в ванне sonicator, так что решение, окружающих флакона тщательно взволнованный импульсы и sonicate смеси липидов около 20 минут. Проверка успешной sonication путем оценки ясности липидов.
  4. Внедорожники можно хранить при 4 ° C для до недели или заморожены при-20 ° C в небольших аликвоты (~ 20 мкл) и сохраняются в течение нескольких недель. Оттепель ампул или трубы при комнатной температуре и sonicate снова, как описано в разделе 2.2.3 или 5.3 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, перед использованием внедорожники для подготовки поддерживает липидных бислоев (совершила). Пожалуйста обратите внимание, что узкий гранулометрический внедорожников полученной экструзией теряется после замораживания и последующего оттаивания и sonication.

3. Очистка стекла Coverslips

Примечание: Очистка и Гидрофилизации стекла coverslips является важным фактором для однородных и жидкости поддерживаемых липидов бислоев. Coverslips стекла могут быть очищены с помощью решения пираньи, сделанные из в соотношении 7:2 серной кислоты 50% пероксида водорода (3.1), или с кислородной плазмы в плазме более чистых (3.2). Оба метода дают аналогичные результаты.

  1. Пиранья очистка coverslips
    1. Применение раствора Пиранья
      1. Распространение coverslips стекла на перевернутый стакан Петри или другой инертный поверхности. С стеклянной пипетки добавьте в центр каждого coverslip 7 капель концентрированной серной кислоты (98%).
        Предупреждение: серная кислота сильно кислотных и агрессивных. Работа в вытяжной шкаф и с только надлежащего защитного оборудования.
      2. Добавьте две капли 50% перекиси водорода в середине кислотные капли.
        Предупреждение: Перекись водорода для глаз и кожи.
      3. Обложка реакции и инкубировать в течение 45 минут.
        Примечание: Максимальное время ожидания здесь не имеет решающее значение для результатов эксперимента и может быть расширена до нескольких дней.
    2. Пиранья мыть чистить coverslips.
      1. Подобрать coverslips индивидуально с помощью пинцета и смойте кислоты с ультрачистая вода. Место промывают coverslips в non втыкать носителей или аналогичные транспортные устройства.
      2. Каждый coverslip широко с ультрачистая вода промыть и насухо поверхности с давлением газа (азот, воздуха, только если нефть бесплатно). Марк уборка стороне coverslip с постоянным маркером.
  2. Плазменной очистки coverslips
    1. Промывайте coverslips с избыточной этанола и потом избыток ультрачистая вода. Сухой coverslips с давлением газа. Соберите камеру, как описано в 4.
    2. После палата Ассамблеи как описано в разделе 4 взять coverslips с прилагаемой камеры и место в плазме более чистых с кислородом как технологического газа. Чистый coverslips с плазмой (в этой работе 30% мощности, использовался 0.3 мбар давление кислорода 1 мин). Право, прежде чем SLB формирования как описано в 5, как hydrophilizing эффект очистки плазмы, стирается со временем делаете уборку.
      Примечание: Время и сила плазменной очистки должны быть оптимизированы с помощью дневно обозначенные мембраны, как слишком мало или чрезмерного плазменная очистка может так, привести к неподвижной мембраны и мембраны с отверстиями.

4. палата Ассамблеи

  1. Острыми ножницами cut off и отбросить крышку и конической частью 0,5 мл реакции. УФ клей наносится на верхнюю кромку трубки и равномерно с помощью кончика пипетки.
  2. Клей трубу вниз к ранее уборка coverslip. В случае очистки Пиранья убедитесь, приклейте ее к стороне очищенного стекла. Вылечить УФ клей, поместив несколько камер под 360 Нм лампу или LED 5 до 15 минут.

5. поддерживает формирование липидного бислоя (БВУ)

  1. Предварительно нагрейте блок тепла до 37 ° C и проинкубируйте 2 мл реакции трубы с мин или SLB буфера, 1 тюбик на камеру.
  2. Удар азота в собранном виде и вылечить камеры удалить пыль и другие частицы, которые могут поселились в УФ отверждении и Ассамблеи. Плазмы чистой, как описано в 3.2, если вы не очистить ваш coverslips раствором Пиранья (3.1). Место камер на блоке тепла.
  3. Разбавьте 20 мкл Алиготе ясно липидов (на 4 мг/мл) с 130 мкл буфера мин или SLB буфера в случае экстракт полярных липидов E. coli , уступая рабочие концентрации 0.53 мг/мл. В случае, если были заморожены липиды, сначала sonicate, удерживая трубу в sonicator ванна перед добавлением буфера, а затем снова sonicate с буфером.
  4. 75 мкл смеси липидов в каждой камере и установите таймер на 3 минуты (DOPC/DOPG смесей; длительный инкубационный может быть необходимым для других липидов смесей). В случае экстракт полярных липидов E. coli Пипетка CaCl2 из 100 мм запаса в камеру до конечной концентрации 3 мм. Во время инкубации пузырьки взрыв на поверхности гидрофильных стекла и предохранитель для формирования согласованной SLB.
  5. После 60 секунд добавьте 150 мкл буфера мин в каждой камере.
  6. Мойки камеры: после того, как еще 120 секунд (всего 3 минуты) мыть каждой камеры путем добавления 200 мкл буфера мин или SLB, тщательно закупорить вверх и вниз несколько раз, удаление и добавление другой 200 мкл.
    1. После каждой камеры омыл раз, перейдите к тщательно мыть в первой камере до тех пор, пока используются 2 мл буфера. Стиральная совершила требуется некоторый опыт идеальный объем движений в камере и найти правильный Стиральная интенсивности.
      Примечание: Никогда не снимайте все жидкости из камеры, чтобы избежать высыхания ЦГЯ.
      Примечание: На вершине стирки, мембраны свойства будут варьироваться в зависимости от многих дополнительных факторов: тип липидов и их относительной концентрации в липидной смеси, метод подготовки для внедорожников, поверхности, обращения и предварительной очистки поддержки.

6. самоорганизация Assay

  1. Настроить объем буфера в камере 200 мкл мин буфер минус количество белков и АТФ решение, а затем добавить ум, ум, с надписью шахты и, при желании, Минц. Осторожно Смешайте компоненты, закупорить. Пример концентрации являются 1 мкм ум (легированные с 30% EGFP-ум), 1 мкм шахты (легированные с 10% химически помечены шахта) и 0,05 мкм Минц, но шаблоны формы в диапазоне концентраций6,10,20,30 .
  2. Добавьте 2.5 мм АТФ (от 100 мм СПС акций в 100 мм MgCl2, рН 7,5) начать самоорганизации MinDE.
    Примечание: Порядок добавления компонента (ум, шахты и СПС) может быть изменено и не будет влиять на окончательный шаблон результат4.
  3. Соблюдать MinDE самоорганизации на флуоресцентным микроскопом (см. Таблицу материалы). MinDE самоорганизации может также наблюдаться с помощью микроскопии TIRF. Для визуализации eGFP ум, используйте 488 нм Аргонового лазера или сопоставимые диодный лазер (например, 490 Нм). Для изображений mRuby3-ум то лучше использовать 561 Нм Лазер диода.
    Примечание: Избегайте высокий уровень возбуждения для больше времени, как мы и другие17 наблюдали Фототоксичность в системе MinDE, приводит к полимеризации необратимым белка на мембране.

7. PDMS микроструктур

Примечание: PDMS (полидиметилсилоксан) представляет собой полимер, который может использоваться для производства микроструктур и microfluidic приборы. Узорные кремниевой пластины служит пресс-форма для литья PDMS структур. PDMS структуры затем служить в качестве поддержки для формирования SLB и пробирного установки.

  1. Либо производят кремниевой пластины с microcompartments себя с помощью фотолитографии (см. Zieske и Schwille для подробного протокола31 или et al. Gruenberger для видео-протокол32) или заказать ваш желаемый кремниевой пластины из литейного производства . Шаблон пластины, используемые в настоящем документе приведена дополнительная информация.
  2. Производство PDMS микроструктуры с узорными кремниевых пластин.
    1. Используйте пластиковый стаканчик для взвешивания 10 g PDMS базы и 1 g PDMS сшивателя. Либо использовать устройство смешивания смешивать и Дега PDMS смесь или смесь вручную PDMS и затем Дега под вакуумом.
    2. Позволяет удалить небольшое количество PDMS непосредственно на конструкцию на кремниевой пластины наконечник пипетки.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не поцарапать кремниевой пластины.
    3. Сразу же место #1 coverslip на падение PDMS и верхний конец чистой пипеткой кончик аккуратно нажать coverslip на кремниевой пластины. PDMS следует распыления между coverslip и кремниевой пластины.
    4. Поместите пластины с coverslips в духовке и вылечить PDMS для 3-4 часов или на ночь на 75 ° C. Выньте пластины из духовки и дайте ему остыть до комнатной температуры. С лезвием бритвы осторожно удалите coverslip с PDMS прилагаемой от SI пластин.
      Примечание: Чтобы предотвратить кремниевой пластины попадание загрязнен или поврежден, всегда накрывайте микроструктуры с PDMS и coverslip. Однако PDMS возрастов, что приводит к щели в микроструктур, поэтому не используйте PDMS структур, которые старше двух-трех недель.

8. самоорганизация в PDMS микроструктур

  1. Использование coverslips с PDMS микроструктур прикрепить камеру как описано до 4 лет.
  2. Чистота и hydrophilize поверхности в плазме кислород чище, как описано в разделе 3.2.2. Сделать не Пиранья чистой PDMS субстратов.
  3. Установка пробирного самоорганизации MinDE как описано до 6 лет.
  4. После настройки assay, проверьте регулярные MinDE модель формирования и должным образом сформированных микроструктур на флуоресцентным микроскопом.
  5. При регулярных MinDE модели сформировали (10-30 мин), аккуратно Пипетка вверх и вниз дважды, чтобы смешать компоненты и затем удалить буфер шаг за шагом, закупорить. Удаление большого объема с помощью пипетки 100 мкл буфера и затем осторожно удалите остальные с помощью пипетки 10 мкл.
    Примечание: Этот шаг может понадобиться некоторое практике. Если слишком много буфера вынимается или процесс занимает слишком много времени, будет высохли микроструктур; Если слишком мало берется, белки не будет ограничиваться в микроструктур, но продолжать форме путешествия поверхности волны.
  6. Сразу же закройте камеру с крышкой, чтобы избежать высыхания остаточного буфера в микроструктур.
  7. Чтобы разрешить для больше изображений раз, подключите смоченный кусок губки внутри камеры и затем закройте крышкой. Убедитесь, что губки не контактируют поверхность coverslip.
  8. До изображений микроструктур проверки на поверхности, что буфер был снижен достаточно, таким образом, чтобы на поверхности выше шаблона формирования микроструктуры MinDE остановил. Изображения MinDE колебания в микроструктур. Убедитесь, что микроструктур не засохшими или высыхания во время визуализации.
    Примечание: Отбросить coverslips с microcompartments после каждого использования, как трещины в форме PDMS.

9. анализ формирования MinDE шаблон

  1. Количественного определения длины волны, волны и волны профили MinDE самоорганизации на Вселенский поддерживаемых липидов бислоев. Фиджи с стандартным набором упакованных плагинов является достаточным для базового анализа33.
  2. Анализировать полюса к полюсу колебания в microcompartments, получение kymographs и среднем времени белка концентрацию профили. Основные kymographs можно получить путем повторной нарезки временных рядов вдоль линии отбора в Фиджи.

Representative Results

Очищение протеина после нашего протокол должен принести мин белки надлежащей чистоты. Как ссылка Рисунок 1 обеспечивает изображение SDS-PAGE разума, дневно помечены разума, шахты и Минц. Отдельные шаги процедуры для выполнения пробирного самоорганизации MinDE-узорные поддерживаемых липидов бислоев описаны на рисунке 2. Используя этот протокол, можно наблюдать регулярные MinDE путешествия поверхностных волн по всей камере (рис. 3). Волны могут незначительно отличаться в камере, но в целом узоры похожи. Края камеры не должны использоваться для количественных сопоставлениях, как мембраны, что формы на УФ клеем, как представляется, имеют различные свойства, чем на стекле поверхности (см. рис. 3 c). Бегущей волны поверхности могут быть проанализированы путем построения интенсивность вдоль направления распространения (рис. 3B). Во время ум флуоресценции плато довольно быстро от переднего края волны и затем резко уменьшается на задней кромке, шахта флуоресценции почти линейно увеличивается от начала волны разума и достигает максимума через ум на задней кромки, где он падает заметно6.

Рядом с качества протеина качество поддерживаемых липидных бислоев является наиболее важным для регулярной самостоятельной организации MinCDE. С одной стороны если мембрана омывается слишком чрезмерно или подстилающей поверхности были очищены и таким образом взимается слишком сильно, отверстия могут образовывать в мембране (рис. 6A, сверху). С другой стороны если мембрана не правильно мыть или подстилающей поверхности не очищены/hydrophilized, пузырьки будут придерживаться мембраны или будут скомпрометированы текучесть мембран (рис. 6A, внизу). Хотя не столь очевидным, как при наблюдении мембраны непосредственно через обозначенные липиды, эти проблемы может быть также обнаружен от сигнала флуоресценции разума, как шаблоны не являются регулярными и флуоресценции в Максима не является однородной, но содержит «дыр» или яркие пятна, как показано в средней панели Рисунок 6A.

Для MinDE самоорганизации в палочковидные PDMS микроструктур процедура приводится на рисунке 4. Несколько шагов протокол не нужно повторять, как белки и липиды могут быть повторно использованы. Как на не узорные субстратов, субстрат очищается и hydrophilized (путем очистки плазмы), поддерживаемых липидному формируется на PDMS и самоорганизации assay настроен в объеме 200 мкл. Чтобы проверить, что надлежащего мембраны сформировала и MinDE самостоятельно организует на мембране, отражаются камеры. При надлежащей мембрана была сформирована, MinDE форм регулярные поездки поверхностных волн на поверхности PDMS между отдельными микроструктуры и самостоятельно организует также в нижней части микроструктур как волны могут свободно двигаться по всей покрытых мембраной поверхности (рис. 5A). После удаления буфера поверхность между отсеками не должно отображать любое распространение MinDE шаблонов (Рисунок 5B), как это должно быть совершенно сухим. Если шаблоны MinDE еще движется, больше буфер должен быть удален. Белки в настоящее время ограничены в палочковидные microcompartments по PDMS мембраны плакированные и по воздуху на верхнем интерфейс (рис. 5 c), в котором они будут самостоятельно организовать. В этих условиях двух белков можно выполнить полюса к полюсу колебаний, как показано на рисунке 5 d. Как часть разума и шахта всегда мембраны граница, также во время удаления буфера, концентрации после удаления буфера не сопоставимы с входной концентрации. Вследствие этого эффекта концентрации также различаются между отдельными микроструктур на том же coverslip, как они зависят от позиции моделей до удаления буфера. Пластины кремния или PDMS литья из кремниевой пластины может привести к неполной микроструктур, которые не могут использоваться для анализа (Рисунок 6B). Кроме того благодаря буфере удаления микроструктур может высохнуть во время процесса и следовательно, должны быть исключены из дальнейшего анализа (Рисунок 6B). В результате лишь незначительную долю микроструктуры в одной камере показывает желаемого колебания полюса до полюса. Для анализа динамики белков в микроструктур, кимограф можно получить путем рисования выбор над всей структуры (Рисунок 5E). Когда MinCDE колеблются от полюса до полюса, MinC и виду покажет время в среднем градиента концентрации с максимальной концентрации на полюсах отсека и минимальной концентрации в середине отсека (Рисунок 5F).

Figure 1
Рисунок 1: SDS-PAGE показаны конечной продукции белка очищения. Его ум (33,3 кДа), его eGFP ум (60.1 кДа), его mRuby3-ум (59.9 кДа), его-MinE (13,9 кДа) и его-MinC (28.3 кДа) отображаются в порядке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: поток процесса диаграмма показаны отдельные шаги и сроки протокола для самоорганизации на бислоев-узорные поддерживаемых липидов (шаги 1-6). Пунктирные прямоугольники указывают, что один из этих двух вариантов может использоваться для очистки. Стрелки, отмечен круги показывают, где протокол можно приостановлено и возобновлено позже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Визуализация MinDE пробирного на confocal микроскопии. A) спираль регулярные мин, от которых скорость распространения волны, сюжет интенсивности и скорость измерений могут быть получены. Концентрации используется: 0,6 мкм ум (30% eGFP разум), 1.8 мкм его-MinE (30% его-шахта-Alexa647) B) пример нормализованных интенсивности сюжет для региона отмечены в A. C) обзор всей Пробирной палаты (шкалы бар: 1 мм, же концентрации белка как выше). Спирали, так как целевой модели могут наблюдаться поворота в любом направлении. Увеличенное региона показывает, как волны узоров отличаются на УФ клей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: поток процесса диаграмма показаны отдельные шаги и сроки протокола для самоорганизации в палочковидные микроструктур (шаги 1-5, 7, 8). Серые клеточки указывают шаги, где товары могут быть повторно использованы от протокола на-узорные поддерживаемых липидов бислоев. Стрелки, отмечен круги показывают, где протокол можно приостановлено и возобновлено позже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: представитель результаты MinDE модель формирования в палочковидные PDMS microcompartments. A) MinDE самостоятельно организовать на поверхности PDMS, образуя путешествия поверхностных волн (разум 1 микрон (30% EGFP-ум), 2 мкм шахты и 2,5 мм АТФ). B) после того, как буфер опускается на высоту микроструктур, самоорганизация белка останавливается на плоской поверхности между microcompartments. C) схема одного палочковидные microcompartment. D) представитель изображений MinDE полюса к полюсу колебаний после удаления буфера. E) кимограф колебаний вдоль выделенной линии, изображенной D). F) изображения и профиль интенсивность средняя флуоресценции время-серии показано в D) ясно показывают градиент белка, максимальная в microcompartment поляков и минимальным в середине отсека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Примеры негативных результатов экспериментальных. A) чрезмерно промывают мембраны накапливать отверстия, в то время как препараты субоптимальные везикул и липидной композиции приводят к прилипание пузырьков. Два центра панели показывают сочетание проблем и как они становятся видимыми при наблюдении мин колебания. Мембраны были названы с 0,05% Atto655-ДОПИНГ. (масштаб бары: 50 мкм) B) верхняя панель: высохли microcompartments может быть вызвано слишком много удаления буфера или когда буфер испаряется с течением времени. Нижняя панель: неполное отсеков может быть сформирован во время производства пластин или PDMS литья. (масштаб бары: 30 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: Плазмиды карта для его ума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Плазмиды карта для его-EGFP-ум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Плазмиды карта для его mRuby3-ум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Плазмиды карта для его шахты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5: Плазмиды карта для его Минц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 6: САПР файл кремниевой пластины палочковидные microcompartments. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Мы описали протокол растворения в пробирке MinCDE самоорганизации на Вселенский поддерживаемые липидных бислоев и в липидного бислоя покрыты 3D структуры, с помощью примера палочковидные PDMS микроструктур. Для того чтобы получить ценные данные от этих анализов, наиболее важными факторами для управления являются качество белка и мембраны.

Для обеспечения качества белка, белка массы должны быть подтверждены с помощью SDS-PAGE и масс-спектрометрии. Кроме того следует проверить, что белки растворяется и не агрегированных, используя аналитический гель фильтрации или динамического рассеяния света. Гель для фильтрации может использоваться для удаления любых агрегированных фракция белков. Важно тщательно рН перестройки и качество добавлен нуклеотидов, как дополнение-скорректирована или частично деградировавших нуклеотида к белку запасов или самоорганизации анализов является достаточным для устранения активность белка, поэтому отмены самоорганизация.

Рядом с качества протеина мембраны качество является наиболее важным, и формирования неправильного мембраны чаще всего является причиной для дефектных самоорганизации и происхождение артефакта поверхностных структур.

При выполнении протокола для в первый раз, это полезно для обозначения поддерживаемых липидных бислоев, включив помечены липидов на низкой молярная доля таких Атто-655-ДОПИНГ или DiI (0,05%). Таким образом свойства и качество мембраны можно судить напрямую. С помощью FRAP, можно оценить текучесть мембран. Кроме того можно непосредственно оценить качество стирки ЦГЯ, как там будет либо слишком много пузырьков, без жидкости мембраны или не мембраны на всех, если она смывается. Открытый камеры подход позволяет тщательно промойте мембрану и таким образом также для удаления пузырьков, которые прилипания на поверхности ЦГЯ. Наиболее важных факторов для получения жидкости и однородной поддерживаемых липидов, которые являются бислоев очистка и гидрофильность поверхности поддержки и правильного размера и однородности Супротив это может быть полезно проверить размер внедорожник и размер распределения с помощью Динамическое рассеяние света. Для узких размер дистрибутивов мы рекомендуем выдавливания везикулы, вместо того, чтобы sonicating их. Другие методы очистки coverslips, например, лечение с сильным баз, основные моющие средства или с помощью coverslips непосредственно после ополаскивания водой, может принести хорошие результаты, в зависимости от приложения и липидов смесь.

В первой половине протокола, представленные здесь, в пробирке растворения на бислоев Вселенский поддерживаемых липидов в открытых камер, имеет преимущество визуализации поверхности доступны для оптических microscopies, таких как TIRF микроскопии30, FRAP анализ6, сингл частица отслеживания34, а также поверхности зонда методы, такие как атомно-силовой микроскопии26. Большой однородной области позволяет лучше статистики при определенных концентрациях. Кроме того открытой камерой подход позволяет точно контролировать концентрацию белка и быстрым и простым добавлением дальнейших компонентов, следовательно, позволяет к Титруйте концентрацию белка в одиночной камере20. Assay также может быть расширена путем добавления других бактериальная divisome компонентов, таких как FtsZ22,35, ZipA22 или химерных белка FtsZ-рекламы ЯФП-МТС10,35.

Другие группы приняли аналогичный подход для воссоздания мин системы в пробирке, но использование потока элементная вместо открытой камерой17,18,19. Поток клетки имеют определенные преимущества, в частности, при полностью закрытых 3D окружающей среды является необходимой18, влияние потока17,,1923 или мембраны состав23 на MinCDE шаблоны расследование, или если белка шаблоны должны наблюдаться под ограничения условий19белка. Тем не менее местные управления молекулярная концентрация является более сложным. Белковых компонентов, особенно ум, сильно связывают мембраны они впервые сталкиваются18,19. По нашему опыту белки часто демонстрируют неспецифической привязки для труб, заливов, шприцев и других частей microfluidic. Следовательно местные белка концентрации отличаются от входной концентрации18 и также различаются по длине потока клеток, что приводит к различных моделей различных белка на мембране между входным и выходным, как было отмечено другими19.

Вторая половина протокола представлены здесь, в пробирке воссоздания в палочковидные микроструктур, повторно с использованием подхода открытой камерой на узорной поддержку охватываемых липидов бислоев позволяет для простой мнемосхемы поведения в естественных условиях белка Хотя точный контроль над концентрации белка теряется из-за удаления буфера. Обратите внимание, что потому что волны MinDE около один порядок величины больше в vitro чем в vivo палочковидные microcompartments являются также о один порядок больше (10 х 30 мкм) чем палочковидные E. coli ячеек.

В целом этот протокол позволяет для точного контроля всех условий, включая концентрацию белка, буфер состав и свойства мембраны. Использование 3D структурированных поддерживает позволяет реакция изучаться под пространственной изоляции, имитируя поведение в естественных условиях без необходимости использования сложных микрофлюидика оборудования.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Майкла Хейманн, и Фрэнк Siedler для производства кремния вафель, основной объект MPI-B для помощи в очищение протеина и Симон Кречмер и Леон Харрингтон для комментариев на рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
DOPG Avanti Polar Lipids 840475
E.coli polar lipid extract Avanti Polar Lipids 100600
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate Roche
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma A5285-1G
Sodium chloride VWR 27810.295
Potassium chloride Roth 6781.1
Tris-base Sigma Aldrich T1503-1kg
Hydrochloric acid Roth 9277.1
TCEP-HCl Termo Fisher Scientific 20491
Ethylene Diamine Tetraacetate Merck Millipore 1.08418.1000
Sulfuric Acid 98% Applichem 173163.1611
Hydrogen Peroxide 50% Applichem 147064.1211
HEPES Biomol 05288.1
dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 102950 Uvasol
Glycerol 86% Roth 4043.1
TB medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roth 2316.x
Atto-655-DOPE Atto Tec AD 655-161
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
PDMS base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
PDMS crosslinker Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue Norland Products 6801 #68 and #63 both work well
Coverslips #1.5 24x24 mm Menzel Gläser
Coverslips #1 24x24 mm Menzel Gläser used only for PDMS microstructures
0.5 ml reaction tube Eppendorf  0030123301
culture flask 2L Corning e.g. 734-1905
His-Trap HP GE Healthcare Life Sciences
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column Biorad 7322010
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL Termo Fisher Scientific 66333 or 66330
razor blade
Instruments
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Merck
automated protein purification system: Äkta Pure GE Healthcare Life Sciences
bath sonicator Branson e.g. Model 1510
ARE-250 mixer Thinky Corporation
Plasma cleaner Zepto Diener electronic use oxygen as process gas
positive displacement pipettes Brand Transferpettor models with glass tips
LSM780 confocal laser scanning microscope Zeiss Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield
pET28a-His-MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
  2. Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
  3. Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
  4. Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
  5. Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
  7. Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
  8. Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
  9. Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
  10. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949 (2014).
  11. Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
  12. Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
  13. Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  14. Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758 (2014).
  15. Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
  16. Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
  17. Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
  18. Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271 (2016).
  19. Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
  20. Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).
  21. Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
  22. Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
  23. Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
  24. Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
  25. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
  26. Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
  27. Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).
  28. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116 (2013).
  29. Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
  30. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
  31. Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
  32. Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560 (2013).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
  35. Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).

Tags

Биохимия выпуск 137 In vitro растворения ум шахты поддерживаемых липидный бислой модель формирования микроструктуры самоорганизация
<em>В пробирке</em> Воссоздание самоорганизующихся структур белков на поддерживаемых липидных бислоев
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P.… More

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P. In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (137), e58139, doi:10.3791/58139 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter