Summary
Proporcionamos un protocolo para in vitro ensayos de autoorganización de la mente y la mía en una bicapa lipídica apoyado en una cámara abierta. Además, se describe cómo adjuntar el ensayo en lípido-clad PDMS microcompartments imitar en vivo condiciones de confinamiento de la reacción.
Abstract
Muchos aspectos de la organización espacio-temporal fundamental de las células se rigen por sistemas de reacción-difusión. In vitro de la reconstitución de estos sistemas permite estudios detallados de sus mecanismos subyacentes que no sería factibles en vivo. Presentamos un protocolo para la reconstitución en vitro del sistema MinCDE de Escherichia coli, lo que posiciona el tabique de división celular en el centro de la célula. El ensayo está diseñado para suministrar sólo los componentes necesarios para auto-organizarse, es decir, una membrana, las dos proteínas mente y minas y energía en forma de ATP. Por lo tanto fabricamos una cámara de reacción abiertos en un cubreobjetos, en el cual se forma una bicapa lipídica compatibles. El diseño abierto de la cámara permite una óptima preparación de la bicapa lipídica y manipulación controlada de los contenidos a granel. Las dos proteínas, mente y mina, así como ATP, entonces se añade en el volumen del bulto por encima de la membrana. La proyección de imagen es posible por muchos Microscopías ópticas, como los soportes de diseño confocales, amplio campo y microscopía TIRF por igual. En una variación del Protocolo, la bicapa lipídica está formada sobre un soporte de modelado, en microestructuras PDMS en forma de células, en lugar de vidrio. La solución a granel en el borde de estos compartimentos incluye la reacción en un compartimento más pequeño y proporciona límites que mímico el de en vivo el comportamiento oscilatorio. Tomados en conjunto, se describen los protocolos para reconstituir el sistema de MinCDE con y sin confinamiento espacial, permitiendo a los investigadores controlar con precisión todos los aspectos que influyen en la formación de patrones, tales como concentración y además de otros factores o proteínas y aumentar sistemáticamente la complejidad del sistema en una configuración experimental relativamente simple.
Introduction
Patrones espacio-temporales son esenciales en la naturaleza, regulación de tareas complejas a nivel celular y pluricelular, de morfogénesis a división celular regulada1,2. Reacción-difusión sistemas juegan un papel importante en el establecimiento de estos patrones, pero son todavía no bien entendidos. Un ejemplo de un sistema de reacción-difusión y el mejor sistema biológico caracterizado hasta ahora es la Escherichia coli MinCDE sistema3,4,5,6,7. El sistema MinCDE oscila entre polos de la célula al polo de la célula de e. coli para determinar el centro de la célula como el sitio de la futura división. Este sistema se basa en la mente de la ATPasa, la ATPasa proteína activadora, mina y la membrana como una matriz espacial de reacción de8. MinC no es parte del mecanismo de formación de patrón, pero es el real agente funcional: un inhibidor de la proteína FtsZ5,6del divisome principal. MinC se une a la mente y por lo tanto sigue las oscilaciones, lo que resulta en un gradiente de concentración de proteína promedio de tiempo que es máxima en los polos celulares y mínima en el centro de la célula, permitiendo sólo FtsZ polimerizar en midcell9,10 . El sistema de MinCDE es parte de la familia más grande de Walker A ATPases que son claves para la organización espacio-temporal en bacterias2, para la colocación y transporte de proteínas complejos plásmidos de11 y12 y para la regulación de la célula División13 y cromosoma segregación14. Por lo tanto, el sistema de reacción-difusión de MinCDE no sólo representa un sistema reacción-difusión arquetipo, sino que también ha atraído la atención debido a su importancia para la organización espacio-temporal en las bacterias.
Detallados estudios funcionales de la MinCDE sistema en vivo son complicados, como manipulación de eliminación de proteínas y genes típicamente resultan en defectos de la división celular. Además, es muy difícil cambiar la composición de la membrana o las propiedades de cytosol en vivo 15,16. Los cambios en el sistema y que influyen en factores son difíciles de interpretar en el ambiente complejo de la célula, más aún si se disturba en una función tan esencial como la división celular. Nosotros y otros hemos convertido, por tanto, a un enfoque de reconstitución en vitro , reducir el sistema a sus componentes: mente, mina, ATP como fuente de energía y la bicapa lipídica compatibles como una reacción matriz6,17, 18. este enfoque bottom-up permite investigar el mecanismo de la uno mismo-organización en detalle sin la complejidad de una célula viva. La forma de las proteínas viajando superficie ondas6 y otras clases de patrones17,19 bajo estas condiciones, aunque con una longitud de onda que está generalmente sobre una magnitud más grande que en vivo. El uso de una cámara abierta facilita un control preciso sobre todos los aspectos que influyen en la formación de patrones: las concentraciones de proteína6, proteína propiedades20, membrana composición10, tampón composición y concentración de ATP 6, así como la adición de otros factores como la aglomeración de agentes21 y otros de proteínas de divisome22. En comparación, en vitro la reconstitución del sistema MinCDE en una celda de flujo18,19,23 puede utilizarse para probar la influencia de flujo17,23, proteína limitación de las condiciones19, membrana composición19 y confinamiento 3D18 patrones de proteína, pero representa un control exacto de la concentración de proteína o componente y además componente secuencial mucho más complicado.
Usando esta cámara abierta, también modelado el apoyo de las bicapas de lípidos planar por que uno puede probar cómo geométrica límites influencia patrón formación21, un fenómeno que recientemente ha sido también investigado en vivo utilizando bacterias moldeado en microestructuras7. También se empleó este ensayo para investigar cómo definidas mutaciones en mina afecta formación de patrones del sistema20. Además, el mismo formato básico del ensayo se ha empleado para investigar cómo la formación puede ser controlada por luz, introducir un péptido de mina azobenzene-reticulado en el análisis y proyección de imagen de microscopía TIRF24.
Encontramos que, con el fin de replicar el modelo MinDE observa formación en vivo en un confinamiento de sistema, en vitro fue clave. Permite el uso de bastoncillos microcompartments, con dimensiones de ajustar la longitud de onda mayor de MinDE en vitro (10 x 30 μm), revestido de una bicapa lipídica compatibles la reconstitución de MinDE oscilaciones de polo a Polo y la formación de gradiente de la proteína 10,25. En este ensayo, las bicapas lipídicas soportadas son depositados sobre un substrato PDMS modelado que contiene varios cientos réplicas de microcompartments barra-formado que permanecen abiertas en la parte superior. Por esto, la reacción se puede configurar en una cámara abierta, y posteriormente el tampón se baja hasta el borde de la microcompartments, confinando así la reacción a un pequeño volumen. A pesar de estos compartimientos tienen una interfaz de aire-buffer en un lado y por lo tanto no representan un confinamiento completamente en 3D por la membrana, la dinámica de la proteína mímico en vivo oscilaciones10,25. En comparación con el confinamiento completamente en 3D, que muestra muy similar resultados18, el análisis de microestructuras abierto es relativamente simple y fácil de manejar y pueden ser realizadas por laboratorios que no cuentan con equipo especializado de la microfluídica y instalaciones de sala limpia.
Aquí, presentamos un protocolo experimental para reconstituir MinCDE formación en apoyo lípidos bicapas en vitro usando una cámara abierta que permite controlar todos los componentes y fácil acceso por microscopía óptica y, con menor modificaciones, es también adaptable para técnicas de sonda de superficie de26. Al lado de bicapas lipídicas planares, mostramos también como aislamiento de proteína puede ser obtenida usando bicapas lipídicas con motivos simples de microestructuras en forma de PDMS. Estos ensayos, aunque optimizado para el sistema MinCDE, pueden también transferirse a otros sistemas de proteínas que interactúan en una manera similar con la membrana, como FtsZ27 o una corteza actina mínimo del28.
Protocol
1. producción de proteínas
- Expresión de la proteína
- Transformar e. coli BL21 (DE3) pLysS con el plásmido respectivo para la expresión de la mente6, EGFP-mente29, mRuby3-mente24, mina6 o MinC30. Mapas de plásmidos, consulte la información complementaria.
- Sembrar una cultura de la noche a la mañana en medio LB con una sola Colonia con los antibióticos respectivos (por ejemplo,100 μg/mL ampicilina o 50 μg/mL de kanamicina) e incubar a 37 ° C durante 14-16 h agitando.
- Inocular 500 mL de medio TB con los antibióticos respectivos con la cultura durante la noche (dilución 1: 200) e incubar el cultivo a 37 º C agitando a 180 rpm.
- Inducen la expresión de proteínas mediante la adición de 0,5 mM de IPTG cuando la cultura llega a una densidad óptica a 600 nm de 0.5-0.7. En caso de EGFP-mente o mRuby3-mente, pasar las células a una incubadora con 16 ° C y crecen las células para 14-16 h y en caso de MinC, mente o mina, cultivar células de 3-4 h a 37 ° C después de la inducción.
Nota: Inducción de MinC, mente o mina expresión es tóxico para las células, como resultado de sobreexpresión en defectos de la división celular; por lo tanto, es importante que el tiempo de incubación a 37 ° C se mantiene por debajo de 4 h. Si se necesitan más proteínas, aumentar la cantidad de cultura, pero no el tiempo de incubación. - Después de tiempo de incubación respectiva cosecha las células por centrifugación a 4000 x g por 10 min y guardar el precipitado de células a-80 ° C hasta seguir utilizándolo.
- Purificación de proteínas
Nota: Las proteínas pueden ser purificadas utilizando columnas de Ni-NTA preenvasados en un sistema de purificación de proteínas automatizado o con perlas de Ni-NTA para la purificación del Banco del flujo de gravedad.- Para la purificación de preenvasados Ni-NTA columnas en almacenador intermediario automatizado proteína purificación sistemas uso A1 (50 mM fosfato de sodio pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazol de 10 mM), buffer B1 (50 mM de fosfato de sodio pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazol 20 mM) y buffer C1 (sodio 50 mM fosfato pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazol de 250 mM). Para la purificación de banco de flujo por gravedad usando Ni-NTA granos usan tampón A2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM de NaCl, imidazol de 10 mM), tampón B2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM de NaCl, imidazol 20 mM) y C2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM de NaCl, imidazol de 250 mM) de búfer. Complementar todas las memorias intermedias de 10 mM ß-mercaptoetanol o 0,4 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) como agente de reducción justo antes del uso.
- Resuspender las células en 20-30 mL de tampón A1 o A2 complementan con EDTA libre inhibidor de la proteasa, 100 μg/mL lisozima, ~ 250 U/mL DNasa y 0,2 mM Mg2 +- ADP (Mg2 +ADP - en el caso de purificación de la mente o EGFP-mente, de un 100 mM ADP stock en 100 mM MgCl 2 con pH ajustado a 7.5).
- Lyse las células utilizando un sonicador de punta (amplitud de 30%, 2,5 min, pulso 30 de s, 30 s off) manteniendo el frasco que contiene las células en un baño de hielo.
- Eliminar restos celulares por centrifugación la célula lisada de 45 min a 25.000 x g a 4 ° C.
- Incubar el sobrenadante en la columna de Ni-NTA o granos Ni-NTA.
- Para columnas de Ni-NTA preenvasados, carga la muestra en la columna usando la bomba de la muestra de un sistema de purificación de proteínas automatizado.
- Para la purificación de la banco-tapa, incubar la muestra con los granos Ni-NTA en un tubo de reacción de 50 mL en un agitador rotatorio a 4 ° C durante 1 hora. Para los pasos posteriores, transferencia de los granos de Ni-NTA en una columna vacía con una pipeta de 25 mL.
- Lave con al menos 5 volúmenes de columna de búfer A1 o A2.
- Lave con al menos 5 volúmenes de columna de búfer B1 o B2.
- Eluir la proteína con tampón de C1 o C2.
- Evaluar la pureza de proteínas por SDS-PAGE.
- Opcional: Además purificar proteínas aplicando a una columna de gel filtración equilibrada en buffer de almacenaje (50 mM HEPES KOH, pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glicerol, 0.1 mM EDTA, TCEP, de 0,4 mM (0,2 mM Mg2 +- ADP en caso mente)).
Nota: Filtración de Gel se recomienda para que la mente eliminar la fracción de la proteína agregada. - Si no se emplea gel filtración, intercambio de tampón de elución de Ni-NTA para búfer de almacenamiento (50 mM HEPES KOH, pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glicerol, 0.1 mM EDTA, TCEP, (0,2 mM Mg-ADP en caso de mente) de 0,4 mM) utilizando una gravedad flujo de columna desalación (véase Tabla de materiales).
- Choque-congelación de proteínas en alícuotas en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C hasta su uso posterior.
- Medir concentración stock de proteínas usando análisis de Bradford y determinar la actividad de la proteína con una ATPasa análisis20.
Nota: No evaluar la concentración de proteína usando absorción a 280 nm. La presencia de nucleótidos durante la purificación de la mente y la falta de tryptophans en mina distorsionar un mediciones de concentración de280 . Uso Bradford o BCA ensayos para medir las concentraciones de proteína en lugar de otro.
- Proteína de etiquetado
Nota: La fusión de una proteína fluorescente a la proteína pequeña mina induce importantes cambios en sus propiedades difusas y función; por lo tanto, el etiquetado químico de la proteína (cisteína en la posición 51) se prefiere sobre fusión a proteínas fluorescentes.- Disolver 0,125 mg de maleimida-colorante conjugado en 5-10 μl de DMSO (dimetil sulfóxido) y agregar con agitación a 0,5 mL mina alícuota en buffer de almacenaje a pH 7.2, preparado como se detalla arriba.
- Incubar durante 2 horas hasta toda la noche a 4 ° C o 2 h a temperatura ambiente bajo suave agitando o revolviendo.
- Colorante separado y proteínas utilizando un flujo de gravedad columna equilibrada con el tampón para almacenamiento (50 mM HEPES KOH, pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glicerol, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP) la desalación.
- Para quitar más lejos cualquier tinte, dializan la proteína contra un exceso de buffer de almacenamiento.
- Comprobar etiquetado éxito mediante la medición de la extinción el máximo para el tinte respectivo y calcule la eficiencia estimada de etiquetado. Por favor, consulte las instrucciones del fabricante de la tintura para un protocolo detallado en estimar el grado de etiquetado. Analizar con el SDS-PAGE y determinar total masa por espectrometría de masas más útil información sobre etiquetado éxito y homogeneidad de la muestra.
2. pequeña vesícula unilaminar (SUV) preparación
- Generación de vesículas multilamellar
- Calcular la cantidad de lipid(s) en cloroformo para su mezcla deseada y el volumen final del SUV. La concentración debe ser de 4 mg/mL de lípidos en Min tampón (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM de MgCl2). Para un ensayo de Min estándar se recomienda una mezcla de 7:3 DOPC:DOPG (% mol). Cuando usando lípido polar de e. coli extracto, uso tampón SLB (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl) para todos los pasos de preparación.
Nota: No se recomienda para que el primer tiempo a los usuarios utilizar Extracto de lípido polar de e. coli como la generación de SLBs homogéneos con esta mezcla es mucho más difícil. - Con una pipeta de desplazamiento positivo con las puntas de vidrio, mezclar los lípidos de cloroformo en un frasco de vidrio de 1,5 mL.
- Los lípidos bajo un chorro de nitrógeno ligero en seco mientras gira lentamente el frasco. Coloque los lípidos con un fuerte chorro de nitrógeno de 10 a 20 minutos. Coloque el frasco que contiene la película lipídica secada en un desecador de vacío y aplique vacío durante al menos 1 h.
- Rehidratar los lípidos en Min buffer con un vórtex a temperatura ambiente hasta que la mezcla homogéneamente opaca.
Nota: Para la generación de vesículas pequeñas propiedades de vesículas multilamellar, lípidos pueden o bien sacar como se describe en 2.2. o sonicación como se describe en 2.3. En general, extrusión produce una distribución de tamaño estrecha que puede ayudar con la formación de bicapas lipídicas soportadas.
- Calcular la cantidad de lipid(s) en cloroformo para su mezcla deseada y el volumen final del SUV. La concentración debe ser de 4 mg/mL de lípidos en Min tampón (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM de MgCl2). Para un ensayo de Min estándar se recomienda una mezcla de 7:3 DOPC:DOPG (% mol). Cuando usando lípido polar de e. coli extracto, uso tampón SLB (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl) para todos los pasos de preparación.
- Preparación de SUV por extrusión
- Rompen lípidos agregados y estructuras multilamellar y además solubilizan lípidos por hielo-deshielo ciclos de 7 a 10.
- Preparar un vaso de precipitados con agua a 70° C a 99° C en un plato caliente y un recipiente con nitrógeno líquido.
- Sostenga el frasco en nitrógeno líquido con grandes pinzas hasta el nitrógeno hierve. Luego transferir el frasco para agua caliente hasta que la solución está completamente descongelada. Repita estos pasos hasta que la mezcla de lípidos aparece clara a la vista, dependiendo de la mezcla.
- Montar un estirador de lípidos y enjuague el sistema con tampón de Min. Sacar la mezcla de lípidos entre 35 y 41 veces a través de una membrana de tamaño de poro de 50 nm. Asegúrese de terminar en un número impar de pasos para evitar agregados que nunca atravesaron la membrana.
- Rompen lípidos agregados y estructuras multilamellar y además solubilizan lípidos por hielo-deshielo ciclos de 7 a 10.
- Preparación de SUV por sonicación
- Para mejor disolver los lípidos en el búfer, poner el frasco de cristal que contiene la solución en un bloque de calor situado a 37 ° C y agitar cada 20 minutos durante 1 minuto. Incubar en total por cerca de 1 h.
- Sumerja el fondo del frasco en un baño sonicador (en este trabajo 1,91 L, 80 W) colocando el frasco en un soporte de abrazadera a la altura deseada.
- Ajustar la altura de agua en el baño sonicador para que la solución que rodea el frasco se agita cuidadosamente por los impulsos y someter a ultrasonidos la mezcla de lípidos durante unos 20 minutos. Compruebe la sonicación exitosa mediante la evaluación de la claridad de los lípidos.
- SUV puede ser almacenado a 4 ° C por hasta una semana o congelado a-20 ° C en alícuotas pequeñas (~ 20 μl) y almacenada por varias semanas. Descongelar los frascos o tubos a temperatura ambiente y someter a ultrasonidos otra vez como se describe en 2.2.3 o 5.3 hasta que la solución es clara antes de usar camionetas para preparación de bicapas de lipidos (SLBs). Por favor tenga en cuenta que la distribución de tamaño estrecha de SUVs obtenida por extrusión se pierde después de congelación y posterior descongelación y sonicación.
3. limpieza de vidrio cubreobjetos
Nota: Limpieza y hydrophilization de cubreobjetos de vidrio es un factor importante para bicapas lipídicas homogénea y fluida. Cubreobjetos de vidrio pueden limpiarse con una solución de piraña, hizo una relación de 7:2 el ácido sulfúrico o peróxido de hidrógeno 50% (3.1) con un plasma de oxígeno en un limpiador de plasma (3.2). Ambos métodos producen resultados similares.
- Piraña limpieza de cubreobjetos
- Aplique solución de piraña
- Distribuir el cubreobjetos de cristal sobre un plato de Petri de cristal invertida u otra superficie inerte. Con una pipeta de vidrio, agregar 7 gotas de ácido sulfúrico concentrado (98%) en el centro de cada cubreobjetos.
PRECAUCIÓN: el ácido sulfúrico es fuertemente ácido y corrosivo. Trabajar en una vitrina y con equipo de protección adecuado sólo. - Añadir dos gotas de peróxido de hidrógeno 50% a la media de las gotas de ácido.
PRECAUCIÓN: el peróxido de hidrógeno es corrosivo a los ojos y la piel. - Cubra la reacción e incube durante al menos 45 minutos.
Nota: El tiempo máximo de espera aquí no es crítico para el resultado del experimento y puede extenderse hasta varios días.
- Distribuir el cubreobjetos de cristal sobre un plato de Petri de cristal invertida u otra superficie inerte. Con una pipeta de vidrio, agregar 7 gotas de ácido sulfúrico concentrado (98%) en el centro de cada cubreobjetos.
- Piraña de lavado limpia cubreobjetos.
- Recoger el cubreobjetos individualmente con unas pinzas y enjuague ácido con agua ultrapura. Coloque el cubreobjetos lavado en los titulares no se pegue o dispositivo similar de transporte.
- Cada cubreobjetos con agua ultrapura y seque la superficie con gas a presión (nitrógeno, aire solo si sin aceite). Marque el lado limpio del cubreobjetos con marcador permanente.
- Aplique solución de piraña
- Plasma limpieza de cubreobjetos
- Enjuague el cubreobjetos con exceso etanol y luego con exceso de agua ultrapuro. Cubreobjetos con gas a presión en seco. Montar la cámara como se describe en 4.
- Después del montaje de la cámara como se describe en 4 tomar el cubreobjetos con cámara adjunta y colóquela en el plasma con oxígeno como gas de proceso. Limpiar el cubreobjetos con plasma (en este trabajo 30% poder, utilizaron 0,3 mbar presión de oxígeno durante 1 minuto). Hacer la limpieza justo antes de la formación SLB como se describe en 5, como el efecto hydrophilizing de plasma de limpieza se desgasta con el tiempo.
Nota: Tiempo y energía de plasma de limpieza deben optimizarse mediante membranas fluorescencia etiquetadas, como demasiado poco o limpieza excesiva plasma tanto puede conducir a las membranas inmóviles o membranas con agujeros.
4. montaje de la cámara
- Con unas tijeras afiladas, corte y deseche la tapa y la parte cónica de un tubo de ensayo 0,5 mL. Aplique el pegamento Ultravioleta hasta el borde superior del tubo y se distribuya mediante el uso de una punta de pipeta.
- Pegue el tubo boca abajo el cubreobjetos previamente limpiado. En el caso de piraña limpieza Asegúrese de pegamento en el lado limpio del cristal. Curar el pegamento Ultravioleta mediante la colocación de múltiples cámaras debajo de una 360 nm lámpara o LED de 5 a 15 minutos.
5. lipídicas bicapa (SLB) formación
- Calentar previamente el bloque de calor a 37 ° C e incubar tubos de reacción de 2 mL con tampón de Min o SLB, 1 tubo por cámara.
- Nitrógeno de golpe en las cámaras montadas y curadas para quitar cualquier polvo u otras partículas que pueden haber colocado durante el curado UV y la Asamblea. Plasma Limpie como se describe en 3.2 Si no han limpiado su cubreobjetos con solución Piraña (3.1). Colocar cámaras en el bloque de calor.
- Diluir una alícuota de 20 μl de lípidos claro (en 4 mg/mL) con 130 μl de tampón de Min o SLB buffer en el caso de e. coli Extracto de lípidos polares, produciendo una concentración de trabajo de 0,53 mg/mL. En caso de que los lípidos se congelaron, someter a ultrasonidos primero sosteniendo el tubo en un sonicador de baño antes de agregar el buffer y luego someter a ultrasonidos nuevo con tampón.
- Añadir 75 μl de mezcla de lípidos para cada cámara y establecer un temporizador de 3 minutos (para mezclas de DOPC/DOPG; incubación más largo puede ser necesario para otras mezclas de lípidos). En el caso de e. coli Extracto de lípidos polares, pipetear CaCl2 de un stock de 100 mM en la cámara a una concentración final de 3 mM. Durante el tiempo de incubación, las vesículas estallan sobre la superficie hidrofílica y fusionan para formar un SLB coherente.
- Después de 60 segundos, agregar 150 μL de tampón de Min a cada cámara.
- Lavar las cámaras: después de otros 120 segundos (3 minutos en total) lavado cada cámara por agregar 200 μL de tampón de Min o SLB, Pipetear cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces, eliminar y agregar otro 200 μl.
- Después de que cada cámara ha sido lavada una vez, proceder a lavar a fondo la primera cámara hasta los 2 mL de buffer son. Lavado de SLBs necesita algo de experiencia a la medida de los movimientos de la cámara y la intensidad de lavado correcto.
Nota: Nunca retire todo el líquido de la cámara para evitar la sequedad de la SLB.
Nota: En la parte superior lavado, propiedades de la membrana varía dependiendo de muchos factores adicionales: tipo de lípidos y sus concentraciones relativas en mezclas de lípidos, método de preparación de todoterrenos, superficie de tratamiento y previa limpieza del soporte.
- Después de que cada cámara ha sido lavada una vez, proceder a lavar a fondo la primera cámara hasta los 2 mL de buffer son. Lavado de SLBs necesita algo de experiencia a la medida de los movimientos de la cámara y la intensidad de lavado correcto.
6. auto organización ensayo
- Ajustar volumen de buffer de la cámara a 200 μL de tampón de Min menos la cantidad de proteínas y la solución de ATP, a continuación, añadir cuenta, marcada mente, la mía y, si lo desea, MinC. Suavemente mezcle componentes mediante pipeteo. Ejemplo las concentraciones son 1 μm mente (dopado con 30% EGFP-mente), 1 μm mina (dopado con 10% químicamente etiquetado mina) y 0.05 μm MinC, pero patrones de forman en un rango de concentraciones6,10,20,30 .
- Añadir 2,5 mM ATP (de la acción de ATP de 100 mM en 100 mM MgCl2, pH 7.5) para iniciar la auto organización de MinDE.
Nota: El orden de la adición del componente (mente, mina y ATP) puede ser variado y no influirá en el patrón final resultado4. - Observar MinDE autoorganización en el microscopio de fluorescencia (véase Tabla de materiales). MinDE autoorganización también se pueden observar mediante microscopía TIRF. Para eGFP-mente la proyección de imagen, utilice un láser de argón de 488 nm láser de diodo comparables (por ejemplo, 490 nm). Para la proyección de imagen mRuby3-mente, es mejor emplear un láser de diodo 561 nm.
Nota: Evitar un alto nivel de excitación por más tiempo como nosotros y otros17 han observado fototoxicidad en el sistema de MinDE, conducen a la polimerización irreversible de la proteína en la membrana.
7. microestructuras PDMS
Nota: PDMS (polidimetilsiloxano) es un polímero que puede ser utilizado para la producción de microestructuras y dispositivos microfluídicos. Una oblea de silicio con motivos sirve como molde para la fundición de las estructuras PDMS. Las estructuras PDMS sirven como soporte para la formación del SLB y configuración del análisis.
- O bien producir la oblea de silicio con microcompartments mediante Fotolitografía (véase Zieske y Schwille para un protocolo detallado31 o Gruenberger et para un protocolo video32) o la oblea de silicio deseada de una fundición . El patrón de la oblea en este documento consulte en información complementaria.
- Producción de microestructuras PDMS de obleas de silicio con dibujos.
- Utilizar un vaso de plástico para pesar 10 g de base PDMS y 1 g de crosslinker PDMS. O bien, utilizar un dispositivo de mezcla para mezclar y desgasificar la mezcla PDMS o mezclar manualmente los PDMS y luego desgasificación bajo vacío.
- Utilice una pipeta para una pequeña cantidad de PDMS directamente sobre la estructura en la oblea de silicio.
Nota: Tenga cuidado de no rayar la oblea de silicio. - Inmediatamente Coloque el cubreobjetos sobre la gota PDMS #1 y tomar el extremo superior de una pipeta limpia para presionar suavemente el cubreobjetos sobre la oblea de silicio. El PDMS debe separarse fino entre el cubreobjetos y la oblea de silicio.
- Colocar la oblea con el cubreobjetos en un horno y curar el PDMS para 3-4 horas o toda la noche a 75 ° C. Sacar la oblea del horno y dejar enfriar a temperatura ambiente. Con una cuchilla de afeitar, retire con cuidado el cubreobjetos con el PDMS adjunto de obleas de SI.
Nota: Para impedir que la oblea de silicio se consigue sucio o dañado, siempre cubra las microestructuras con PDMS y un cubreobjetos. Sin embargo, edad PDMS, dando lugar a grietas en las microestructuras, por lo tanto no utilizar estructuras PDMS que son mayores de dos a tres semanas.
8. uno mismo-organización en microestructuras PDMS
- Uso cubreobjetos con microestructuras PDMS para conectar una cámara como describen bajo 4.
- Limpiar y hydrophilize la superficie en un plasma de oxígeno limpio como se indica en 3.2.2. No no sustratos PDMS limpiamos piraña.
- Configuración de un análisis de la propia organización de MinDE como se describe debajo de 6.
- Después de configurar el ensayo, busque regular formación MinDE y microestructuras formadas correctamente en el microscopio de fluorescencia.
- Cuando patrones regulares de MinDE han formado (10-30 min), pipetee suavemente arriba y abajo dos veces para mezclar los componentes y después quitar el tampón paso a paso mediante pipeteo. Quite el bulto grande de búfer mediante pipeta 100 μl y luego retire con cuidado el resto usando una pipeta de 10 μl.
Nota: Este paso puede ser que necesite algo de práctica. Si se saca demasiado búfer o tarda demasiado el proceso, las microestructuras se secar Si demasiado poco es tomado, las proteínas no se limita en las microestructuras, pero siguen constituyendo superficie ondas viajeras. - Cierre inmediatamente la cámara con una tapa para evitar el secado del buffer residual en las microestructuras.
- Para permitir mayor tiempo de proyección de imagen, conecte un trozo húmedo de esponja dentro de la cámara y cerrarla con la tapa. Asegúrese de que la esponja no tenga contacto con la superficie del cubreobjetos.
- Antes de la proyección de imagen del cheque de microestructuras en la superficie que el búfer se redujo bastante, por lo que en la superficie por encima de la formación de microestructuras MinDE patrón ha detenido. Imagen de MinDE oscilaciones en microestructuras. Compruebe que las microestructuras no desecados o se sequen durante proyección de imagen.
Nota: Deseche el cubreobjetos con microcompartments después de cada uso, como grietas en forma PDMS.
9. Análisis de la formación de patrones de MinDE
- Cuantificar la longitud de onda, velocidad de las ondas y perfiles de onda de la autoorganización MinDE en bicapas lipídicas planares. FIJI con el conjunto estándar de plugins paquete es suficiente para análisis básicos33.
- Analizar las oscilaciones de polo a Polo en microcompartments mediante la obtención de perfiles de concentración de proteína promedio de tiempo y kymographs. Kymographs básicas pueden obtenerse por corte vuelve a una serie de tiempo a lo largo de una selección de línea en FIJI.
Representative Results
Siguiendo nuestro protocolo de purificación de proteínas debe producir proteínas Min de pureza adecuada. Como referencia, figura 1 proporciona una imagen de SDS-PAGE de la mente, fluorescencia etiquetada mente mía y MinC. Cada paso del procedimiento para realizar un análisis de la propia organización de MinDE en bicapas lipídicas con motivos no se describe en la figura 2. Mediante este protocolo, se observan MinDE regular superficie ondas viajeras a lo largo de la cámara (figura 3). La longitud de onda puede variar levemente dentro de la cámara, pero en general parecen patrones. Los bordes de la cámara no puede usarse para comparaciones cuantitativas, como las membranas que se forman en el pegamento Ultravioleta parece tener diferentes propiedades que en el cristal de la superficie (ver figura 3). Las ondas superficiales viajan pueden analizarse mediante la representación de la intensidad a lo largo de la dirección de propagación (figura 3B). Mientras que presente fluorescencia mesetas bastante rápido de la vanguardia de la ola y luego disminuye abruptamente en el borde de fuga, mina la fluorescencia aumenta casi linealmente desde el comienzo de la onda de la mente y alcanza su máximo después de la mente en el borde de fuga, donde se cae marcadamente6.
Junto a la calidad de la proteína, la calidad de las bicapas lipídicas soportadas es más crítica para una auto organización regular de MinCDE. Por un lado si la membrana se lava demasiado excesivamente o la superficie subyacente ha sido limpiada y así carga demasiado fuertemente, pueden formar agujeros en la membrana (figura 6A, parte superior). Por otro lado si la membrana no se lava correctamente o la superficie subyacente no es limpiado/hydrophilized, la vesículas se adhieren a la membrana o se verá afectada la fluidez de la membrana (figura 6A, parte inferior). Aunque no son tan evidentes al observar la membrana directamente a través de lípidos marcados, estos problemas también pueden ser detectados desde la señal de fluorescencia de la mente, como los patrones no son regulares y la fluorescencia en la maxima no es homogénea sino que contiene "huecos" o puntos brillantes como se muestra en el panel central de la figura 6A.
Para la autoorganización MinDE en microestructuras PDMS en forma el procedimiento se resume en la figura 4. Varios pasos del Protocolo no necesita ser repetido, como las proteínas y los lípidos pueden ser reutilizados. Como en los substratos no-patrón, el sustrato se limpia y hydrophilized (por limpieza de plasma), se forma una bicapa lipídica apoyado en el PDMS y el análisis de uno mismo-organización se configura en un volumen de 200 μl. Para comprobar que se ha formado una membrana apropiada y MinDE uno mismo-organiza en la membrana, son imágenes de las cámaras. Cuando una membrana apropiada se ha formado, MinDE formas regular superficie ondas viajeras en la superficie de los PDMS entre las microestructuras individuales y también uno mismo-organiza en la parte inferior de las microestructuras como las ondas pueden libremente mover en toda la superficie de membrana (figura 5A). Después del retiro de búfer, la superficie entre los compartimientos no debe presentar cualquier propagación patrones MinDE (figura 5B), debe estar completamente seco. Si sigue moviendo MinDE patrones, más buffer debe ser extirpado. Las proteínas se limitan ahora en el microcompartments barra-formado por el PDMS revestido de membrana y por el aire en la interfaz superior (figura 5), en el que se auto-organizarse. Bajo estas condiciones las dos proteínas pueden realizar oscilaciones de poste a poste como se muestra en la figura 5. Como una fracción de la mente y la mía siempre unida a la membrana, también durante la extracción del buffer, las concentraciones después de retiro del tampón no son comparables con las concentraciones de entrada. Debido a este efecto las concentraciones también varían entre microestructuras individuales sobre el mismo cubreobjetos como dependen de la posición de los patrones antes de la eliminación de búfer. Producción de la oblea de silicio o moldeado de PDMS de la oblea de silicio resulta en microestructuras incompletas que no pueden utilizarse para el análisis (Figura 6B). Además, debido al búfer de microestructuras de retiro podrían secarse durante el proceso y por lo tanto, deben excluirse del análisis (Figura 6B). Como resultado sólo una fracción de las microestructuras en una cámara de muestra las oscilaciones deseadas de polo a Polo. Para analizar la dinámica de la proteína en las microestructuras, puede obtenerse una kymograph dibujar una selección sobre toda la estructura (figura 5E). Cuando MinCDE oscilan de polo a Polo, MinC y mente mostrará un gradiente de concentración promedio de tiempo de concentración máxima en los polos del compartimiento y la concentración mínima en el compartimiento (figura 5F).
Figura 1: muestra los productos finales de purificaciones de proteínas SDS-PAGE. Su mente (33,3 kDa), su-eGFP-mente (60,1 kDa), su-mRuby3-mente (59,9 kDa), su mina (13,9 kDa) y su-MinC (28,3 kDa) se muestran en orden. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo del proceso mostrando cada paso y momento de protocolo para un auto-organizarse en bicapas lipídicas con motivos no soportadas (pasos 1-6). Cajas punteadas indican que una de estas dos opciones puede utilizar para la limpieza. Las flechas marcadas por círculos indican donde el protocolo puede ser pausado y reanudado más tarde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: proyección de imagen de MinDE análisis mediante microscopía confocal. A) espiral Min Regular, de que velocidad de la propagación de la onda, trama de la intensidad y la velocidad pueden obtenerse mediciones. Concentraciones utilizadas: 0,6 μm mente (eGFP-mente del 30%), 1,8 μm su mina (30% su-mina-Alexa647) B) parcela de intensidad normalizada de ejemplo para la región marcada en A. C) Resumen de la cámara de ensayo completo (barra de escala: 1 m m, la misma concentración de proteína como arriba). Espirales o sentido de giro, así como se pueden observar patrones de blanco. La región ampliada muestra cómo los patrones de onda difieren sobre el pegamento Ultravioleta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diagrama de flujo del proceso mostrando cada paso y momento del protocolo para la uno mismo-organización en microestructuras en forma de bastoncillos (pasos 1-5, 7, 8). Cajas gris indican pasos donde los productos pueden ser reutilizados del protocolo en bicapas lipídicas no modelado. Las flechas marcadas por círculos indican donde el protocolo puede ser pausado y reanudado más tarde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: resultados representativos para MinDE formación en microcompartments PDMS barra-formado del patrón. A) MinDE auto-organizarse en la superficie de PDMS formando la superficie ondas viajeras (mente de 1 μm (30% EGFP-mente), 2 μm mina y mM 2,5 ATP). B) después de que el búfer se baja a la altura de las microestructuras, la autoorganización de la proteína se detiene en la superficie plana entre el microcompartments. C) esquemático de un microcompartment en forma de barra. D) imágenes representativas de MinDE oscilaciones de polo a Polo después del retiro de búfer. E) Kymograph de las oscilaciones a lo largo de la línea resaltada se muestra en D). F) imagen y Perfil de la intensidad de fluorescencia media de la serie de tiempo se muestra en D) que claramente muestra el gradiente de la proteína que es máxima en microcompartment polos y mínima en el medio del compartimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: ejemplos de resultados experimentales negativos. A) membranas demasiado lavadas acumulan los agujeros, mientras que preparaciones vesícula subóptima y composiciones de lípidos llevan a pegarse las vesículas. Los paneles del dos centro muestran una combinación de problemas y cómo llegan a ser visibles al observar oscilaciones de Min. Las membranas fueron etiquetadas con 0.05% Atto655-droga. (barras de escala: 50 μm) B) panel superior: secado microcompartments puede ser causado por demasiada extracción tampón o cuando el buffer se evapora con el tiempo. Panel inferior: compartimientos incompletos pueden ser formados durante la producción de la oblea o moldeado de PDMS. (barras de escala: 30 μm) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo adicional 1: Mapa de plásmido para su mente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo adicional 2: Mapa de plásmido para su-EGFP-mente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 3: Mapa de plásmido para la su-mRuby3-mente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo adicional 4: Mapa de plásmido para su mina. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 5: Mapa de plásmido para su MinC. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 6: Archivo CAD de la oblea de silicio de microcompartments barra-formado. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Hemos descrito un protocolo para la reconstitución en vitro de MinCDE uno mismo-organización en planar bicapas de lipidos y en lípidos bicapa cubiertas estructuras 3D, utilizando el ejemplo de microestructuras en forma de PDMS. Para obtener valiosos datos de estos ensayos, los factores más importantes a controlar son proteínas y membrana de calidad.
Para garantizar la calidad de proteína, proteína de masa debe confirmarse mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas. Además, debe verificarse que las proteínas son solubles y no agregados, mediante filtración de gel analítica o dispersión de luz dinámica. Filtración de gel puede utilizarse para quitar cualquier fracción de agregados de proteínas. Ajuste del pH cuidado y calidad de agregado nucleótidos es crítica, como la adición de nucleótidos parcialmente degradadas o no ajustados a la proteína de stocks o ensayos de auto-organización es suficiente para eliminar la actividad de la proteína, por lo tanto, supresión uno mismo-organización.
Junto a la calidad de la proteína, membrana de calidad es más crítica y formación inadecuada de la membrana suele ser la causa de la defectuosa organización autónoma y el origen de estructuras superficiales artefactuales.
Cuando se realiza el Protocolo por primera vez, es útil etiquetar las bicapas lipídicas soportadas mediante la inclusión de lípidos etiquetados como Atto-655-droga o DiI en bajos porcentajes molares (0.05%). Así las propiedades y la calidad de la membrana pueden medirse directamente. Con el FRAP, la fluidez de la membrana puede ser evaluada. Además, directamente uno puede evaluar la calidad de lavado de la SLB, como habrá o bien ser muchas vesículas, no hay membrana fluida o sin membrana, si ha sido lavada. El enfoque de la cámara abierto permite lavar rigurosamente la membrana y por lo tanto, también para eliminar las vesículas que se están pegando en la superficie de la SLB. Los factores más importantes para la obtención homogénea lipídicas bicapas son la limpieza y la hidrofilia de la superficie de apoyo y el correcto tamaño y homogeneidad de SUfrente puede ser útil comprobar tamaño SUV y el uso de distribución de tamaño dispersión ligera dinámica. Distribuciones de tamaño estrechas, se recomienda sacar las vesículas en lugar de les sonicando. Otros métodos de limpieza cubreobjetos, por ejemplo, tratamientos con bases fuertes, detergentes base o utilizando cubre-objetos directamente tras el enjuague con agua, pueden producir buenos resultados, dependiendo de la mezcla de aplicación y de los lípidos.
La primera mitad del protocolo presentado aquí, en vitro de la reconstitución en bicapas lipídicas planares en cámaras abiertas, tiene la ventaja de representar la superficie accesible de Microscopías ópticas, como TIRF microscopia30, FRAP Análisis6, solo-partícula seguimiento34, así como técnicas de sonda de superficie como de microscopía de fuerza atómica26. La gran superficie homogénea permite mejores estadísticas a concentraciones definidas. Además el enfoque de cámara abierta permite para controlar con precisión la concentración de proteína y una rápida y simple adición de otros componentes, permitiendo por lo tanto, para valorar la concentración de proteína en un solo compartimiento20. El ensayo también puede ser ampliado por la adición de otros componentes de la divisome bacteriana FtsZ22,35, ZipA22 o la proteína quimérica FtsZ-YFP-MTS10,35.
Otros grupos han adoptado un enfoque similar a reconstituir el Min sistema en vitro, pero uso una celda de flujo en lugar de un compartimiento abierto17,18,19. Células de flujo tienen ciertas ventajas, en particular cuando un entorno 3D totalmente cerrado es necesario18, la influencia de flujo17,19,23 o membrana composición23 patrones de MinCDE investigado, o si los patrones de proteína deben ser observadas bajo limitación de condiciones19de proteína. Sin embargo, el control local de la concentración molecular es más difícil. Componentes de proteína, especial mente, se unen fuertemente a la membrana se encuentra primero con18,19. En nuestra experiencia, las proteínas exhiben con frecuencia la Unión no específica a la tubería, entradas, jeringas y otras partes de microfluidos. Por lo tanto, las concentraciones de proteína local difieren de las concentraciones de entrada18 y también varían a lo largo de la célula de flujo, resultando en una variedad de patrones diferentes de proteínas en la membrana entre entrada y salida, según lo observado por otros19.
La segunda mitad del protocolo presentado aquí, la reconstitución en vitro en volver a utilizar el enfoque de la cámara abierto sobre un soporte con motivos cubierto por lípidos de microestructuras en forma bicapas permite un simple imitador en vivo el comportamiento de la proteína Aunque un control preciso sobre las concentraciones de la proteína se pierde debido a retiro de búfer. Tenga en cuenta que debido a la longitud de onda de MinDE es aproximadamente un orden de magnitud mayor en vitro que in vivo las microcompartments en forma son también sobre un orden de magnitud más grande (10 x 30 μm) que una en forma de e. coli de la célula.
En general, este protocolo permite el control preciso de todas las condiciones incluyendo la concentración de proteína, tampón composición y propiedades de la membrana. El uso de soportes estructurados 3D permite la reacción a estudiar bajo confinamiento espacial, imitando el comportamiento en vivo sin necesidad de equipos complejos de microfluídica.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Michael Heymann y Frank Siedler para la producción de silicio obleas, Core instalación MPI-B ayuda en la purificación de la proteína y Simon Kretschmer y Leon Harrington para comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| DOPG | Avanti Polar Lipids | 840475 | |
| E.coli polar lipid extract | Avanti Polar Lipids | 100600 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate | Roche | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma | A5285-1G | |
| Sodium chloride | VWR | 27810.295 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| Tris-base | Sigma Aldrich | T1503-1kg | |
| Hydrochloric acid | Roth | 9277.1 | |
| TCEP-HCl | Termo Fisher Scientific | 20491 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetate | Merck Millipore | 1.08418.1000 | |
| Sulfuric Acid 98% | Applichem | 173163.1611 | |
| Hydrogen Peroxide 50% | Applichem | 147064.1211 | |
| HEPES | Biomol | 05288.1 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 102950 | Uvasol |
| Glycerol 86% | Roth | 4043.1 | |
| TB medium | |||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roth | 2316.x | |
| Atto-655-DOPE | Atto Tec | AD 655-161 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| PDMS base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| PDMS crosslinker | Dow Corning Corporation | ||
| Materials | |||
| UV Glue | Norland Products | 6801 | #68 and #63 both work well |
| Coverslips #1.5 24x24 mm | Menzel Gläser | ||
| Coverslips #1 24x24 mm | Menzel Gläser | used only for PDMS microstructures | |
| 0.5 ml reaction tube | Eppendorf | 0030123301 | |
| culture flask 2L | Corning | e.g. 734-1905 | |
| His-Trap HP | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column | Biorad | 7322010 | |
| dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL | Termo Fisher Scientific | 66333 or 66330 | |
| razor blade | |||
| Instruments | |||
| ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems | Merck | ||
| automated protein purification system: Äkta Pure | GE Healthcare Life Sciences | ||
| bath sonicator | Branson | e.g. Model 1510 | |
| ARE-250 mixer | Thinky Corporation | ||
| Plasma cleaner Zepto | Diener electronic | use oxygen as process gas | |
| positive displacement pipettes | Brand | Transferpettor models with glass tips | |
| LSM780 confocal laser scanning microscope | Zeiss | Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective | |
| Plasmids | |||
| pET28a-His-MinD_MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield | |
| pET28a-His-MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinE | |
| pET28a-His-EGFP-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-EGFP-MinD | |
| pET28a-His-mRuby3-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-mRuby3-MinD | |
| pET28a-His- MinC | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinC |
References
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