Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Published: July 28, 2018 doi: 10.3791/58139
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

Vi tilbyr en protokoll for i vitro Self-Organization analyser og MinE på en støttet lipid bilayer i en åpen kammer. I tillegg beskriver vi hvordan du setter analysen i lipid-kledd PDMS microcompartments å etterligne i vivo forhold av reaksjon confinement.

Abstract

Mange aspekter av grunnleggende spatiotemporal organiseringen av celler er underlagt reaksjon-diffusjon type systemer. In vitro rekonstituering av slike systemer gir detaljerte studier av deres underliggende mekanismene som ikke ville være mulig i vivo. Her gir vi en protokoll for i vitro rekonstituering av MinCDE systemet Escherichia colisom plasserer den celledeling septum midt cellen. Analysen er utformet for å levere bare de nødvendige komponentene for selvstendig organisasjon, nemlig en membran, to proteiner sinn og gruve og energi i form av ATP. Vi har derfor dikte en åpen reaksjon kammer på en dekkglassvæske, som en støttet lipid bilayer er dannet. Den åpne konstruksjonen av kammeret gir optimal utarbeidelse av lipid bilayer og kontrollert manipulering av bulk innholdet. To proteiner, sinn og MinE, samt ATP, legges deretter i bulk volum over membranen. Tenkelig er mulig med mange optisk microscopies, design støtter AC confocal, wide-field og TIRF mikroskopi alike. I en variasjon av protokollen, er lipid bilayer dannet på en mønstret støtte, på celle-formet PDMS microstructures, i stedet for glass. Senke bulk løsningen på kanten av seksjonene omslutter reaksjonen i et mindre rom og gir grenser at mimicking i vivo oscillasjon atferd. Sammen beskrive vi for å gjeninnføre MinCDE systemet både med og uten romlige confinement, slik at forskere til nettopp styre alle aspekter påvirke mønster formasjonen, som konsentrasjon områder og tillegg av andre faktorer eller proteiner, og systematisk øke systemet kompleksiteten i en relativt enkel eksperimentelle oppsett.

Introduction

Spatiotemporal mønstre er avgjørende i naturen, regulere komplekse oppgaver både på flercellede og mobilnettet nivå, fra morphogenesis til regulert celledeling1,2. Reaksjon-diffusjon systemer spiller en viktig rolle i å etablere disse mønstrene, men er fortsatt ikke godt forstått. Et godt eksempel på en reaksjon-diffusjon system og de beste preget biologiske system er så langt Escherichia coli MinCDE system3,4,5,6,7. MinCDE systemet svinger fra cellen pole til celle pole E. coli å bestemme midten av cellen som fremtidig deling. Dette systemet er basert på ATPase sinnet, ATPase aktivere protein MinE, og membranen som en romlig reaksjon matrix8. MinC er ikke del av mønster formasjonen mekanisme, men er faktisk funksjonelle agent: en inhibitor av viktigste divisome protein FtsZ5,6. MinC binder til hjernen og derfor følger svingninger, noe som resulterer i en gjennomsnittlige protein konsentrasjon gradient maksimal ved celle polene og minimal cellen midt, kun tillater FtsZ å danner midcell9,10 . MinCDE systemet er en del av den større familien av Walker A ATPases som er nøkkelen til spatiotemporal organisasjonen i bakterier2, plassere og transportere protein komplekser11 og plasmider12 og regulerer celle divisjon13 og kromosom segregering14. Derfor MinCDE reaksjon-diffusjon systemet ikke bare representerer et arketypisk reaksjon-diffusjon system, men har også fått oppmerksomhet på grunn av dens relevans for spatiotemporal organisasjonen i bakterier.

Detaljert funksjonelle studier av MinCDE systemet i vivo er komplisert, manipulering av proteiner og gene sletting vanligvis føre celledeling defekter. Videre endre membran sammensetning eller egenskapene av stoffer i vivo er svært utfordrende15,16. Endringer i systemet og påvirke faktorer er vanskelig å tolke i komplekse miljøet i cellen, enda mer hvis det er forstyrret i en viktig funksjon som celledeling. Vi og andre har derfor slått til en i vitro rekonstituering tilnærming, redusere systemet til dens kjernekomponentene: Husk meg, ATP som energikilde og støttede lipid bilayer som en reaksjon matrix6,17, 18. dette bottom-up tilnærming kan undersøke mekanisme selvstendig organisasjon i detalj uten kompleksiteten av en levende celle. Skjemaet proteiner reise overflaten bølger6 og andre typer mønstre17,19 under disse forholdene, men med en bølgelengde det er vanligvis om en størrelsesorden større enn i vivo. Bruk av en åpen kammer muliggjør nøyaktig kontroll over alle aspekter påvirke mønster formasjon: protein konsentrasjoner6, protein egenskaper20, membran komposisjon10, buffer komposisjon og ATP konsentrasjon 6, samt tillegg av andre faktorer som trengsel agenter21 og andre divisome proteiner22. Sammenligning kan i vitro rekonstituering av MinCDE system i en flyt-cellen18,19,23 brukes å undersøke påvirkning av flyt17,23, protein begrense forhold19, membran komposisjon19 og full 3D confinement18 på protein mønstre, men gjengir en nøyaktig kontroll proteinkomponenter/konsentrasjon og sekvensiell komponent tillegg mye mer komplisert.

Bruker denne åpne kammer, vi også mønstret støtte fra planar lipid bilayers som man kan undersøke hvordan geometriske grenser innflytelse mønster formasjon21, et fenomen som har nylig også vært undersøkt i vivo bruker bakterier støpt inn microstructures7. Vi har også ansatt denne analysen til å undersøke hvordan definerte mutasjoner i min påvirker mønster dannelsen av systemet20. Videre har samme grunnleggende analysen format vært ansatt å undersøke hvordan mønster formasjon styres av lys, presenterer en azobenzene-krysskoblet MinE peptid i analysen, og tenkelig med TIRF mikroskopi24.

Vi fant at, for at MinDE mønsteret formasjon observert i vivo i en i vitro system, confinement var nøkkelen. Bruke stav-formet microcompartments, med dimensjoner justert til større bølgelengden til MinDE i vitro (10 x 30 µm), kledd med en støttet lipid bilayer tillatt rekonstituering MinDE Pol-til-Pol svingninger og protein gradient formasjon 10,25. I denne analysen, er støttede lipid bilayers avsatt på et mønstret PDMS substrat som inneholder flere hundre kopier av stav-formet microcompartments som forblir åpne på toppen. Med det reaksjonen kan settes opp i en åpen kammer, og senere bufferen er senket til kanten av microcompartments, og dermed avgrense reaksjonen til små. Selv om disse avdelingene har en luft-buffer-grensesnitt på den ene siden og dermed ikke representerer en full 3D confinement av membran, etterlignet protein dynamikken i vivo svingninger10,25. Sammenlignet med full 3D confinement, som viser svært like resultater18, åpen microstructures analysen er relativt enkel og lett å håndtere og kan også utføres av laboratorier som ikke er utstyrt med spesialiserte microfluidics utstyr og rent-rom fasiliteter.

Her presenterer vi en eksperimentell protokoll for gjenoppbygge MinCDE mønster formasjon på støttes lipid bilayers i vitro bruker en åpen kammer som gir kontroll over alle komponenter og enkel tilgang av optisk mikroskopi og, med mindre endringer, er også tilpasses overflaten-sonden teknikker26. Ved planar støttes lipid bilayers, vi også vise hvordan protein confinement kan være får enkel mønstret støttes lipid bilayers på stav-formet PDMS microstructures. Disse analyser, kan selv om optimalisert for MinCDE systemet, også overføres til andre protein-systemer som kommuniserer på en lignende måte med membran, som FtsZ27 eller en minimal begrepsordbok cortex28.

Protocol

1. protein produksjon

  1. Protein uttrykk
    1. Transformere E. coli BL21 (DE3) pLysS med de respektive plasmider for uttrykk for sinnet6, EGFP-sinn29, mRuby3-sinn24, min6 eller MinC30. For plasmider kart, se tilleggsinformasjon.
    2. Vaksinere en overnatting kultur i LB medium med en enkelt koloni med respektive antibiotika (f.eks,100 µg/mL Ampicillin eller 50 µg/mL Kanamycin) og ruge på 37 ° C 14-16 h mens risting.
    3. Vaksinere 500 mL TB medium som inneholder det respektive antibiotikaet med overnatting kultur (1:200 fortynning) og ruge kultur på 37 ° C mens riste på 180 rpm.
    4. Indusere protein uttrykk ved å legge til 0,5 mM IPTG når kulturen når en optisk densitet ved 600 nm i 0,5-0,7. Ved EGFP-sinn eller mRuby3-sinn, Flytt celler til en inkubator med 16 ° C og vokse celler for 14-16 h, og i tilfelle MinC, sinn eller min, vokse celler for 3-4 h på 37 ° C etter innledningen.
      Merk: Induksjon MinC, sinn eller MinE uttrykk er giftig for cellene, som overuttrykte resulterer i celledeling feil; Derfor er det viktig at inkubasjon tid på 37 ° C holdes under 4 h. Hvis trenger mer protein, øke mengden av kultur, men ikke inkubasjon tid.
    5. Etter respektive inkubasjonstiden høste celler med sentrifugering 4000 x g i 10 min og oppbevare celle pellet ved-80 ° C til å bruke.
  2. Protein rensing
    Merk: Proteiner kan bli renset bruker ferdigpakkede Ni-NTA kolonner på en automatisert protein rensing system eller bruker Ni-NTA perler for gravitasjon-flow benk rensing.
    1. For rensing med ferdigpakkede Ni-NTA kolonner på automatiserte protein rensing systemer bruk buffer A1 (50 mM natrium fosfat pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole), buffer B1 (50 mM natrium fosfat pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole) og buffer C1 (50 mM natrium fosfat pH 8.0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole). For gravitasjon-flow benk rensing med Ni-NTA perler bruke buffer A2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole), buffer B2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole) og buffer C2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole). Supplere alle buffere med 10 mM ß-mercaptoethanol eller 0.4 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) som reduksjonsmiddel rett før bruk.
    2. Resuspend celler i 20-30 mL buffer A1 eller A2 supplert med EDTA protease inhibitor, 100 µg/mL lysozyme, ~ 250 U/mL DNase og 0.2 mM Mg2 +- ADP (Mg2 +- ADP ved sinnet eller EGFP-sinn rensing, fra en 100 mM ADP lager i 100 mM MgCl 2 med pH justert til 7.5).
    3. Lyse celler ved hjelp av en tips sonicator (30% amplitude, 2,5 min, 30 s puls, 30 s av) samtidig ampullen inneholder cellene i en isbadet.
    4. Fjerne celle rusk ved sentrifugering cellen lysate for 45 min 25.000 x g og 4 ° C.
    5. Inkuber nedbryting på Ni-NTA kolonne eller Ni-NTA perler.
      1. For ferdigpakkede Ni-NTA kolonner, lastes eksemplet på kolonnen bruker eksempel pumpen av et automatisert protein rensing system.
      2. For benk toppen rensing, ruge prøven med Ni-NTA perler i et 50 mL reaksjon rør på en roterende shaker på 4 ° C 1t. Etterfølgende trinnene, overføre Ni-NTA perler i en tom kolonne med en 25 mL pipette.
    6. Vask med minst 5 kolonnen mengder buffer A1 eller A2.
    7. Vask med minst 5 kolonnen mengder buffer B1 eller B2.
    8. Elute protein med buffer C1 eller C2.
    9. Vurdere protein renhet via SDS-siden.
    10. Valgfritt: Ytterligere rense protein ved å bruke det på en gel filtrering kolonne equilibrated lagring buffer (50 mM HEPES/KOH pH 7.2, 150 mM KCl, 10% glyserol, 0,1 mM EDTA, 0.4 mM TCEP, (0.2 mM Mg2 +- ADP ved sinn)).
      Merk: Gel filtrering anbefales for å fjerne oppsamlet protein fraksjon.
    11. Hvis ingen gel-filtrering er ansatt, utveksle Ni-NTA elueringsbufferen til lagring bufferen (50 mM HEPES/KOH pH 7.2, 150 mM KCl, 10% glyserol, 0,1 mM EDTA, 0.4 mM TCEP, (0.2 mM Mg-ADP ved sinn)) bruker en tyngdekraft flyte avsalting kolonne (se Tabell for materiale).
    12. Sjokk-Frys proteiner i dele i flytende nitrogen og store-80 ° c til videre bruk.
    13. Mål protein lager konsentrasjon bruke Bradford analysen, og bestemme protein aktivitet med en ATPase analysen20.
      Merk: Gjør ikke vurdere protein konsentrasjon med absorpsjon på 280 nm. Tilstedeværelsen av nukleotid under sinn rensing og mangel på tryptophans i min forvrenge et280 konsentrasjon målinger. Bruk Bradford eller BCA søk for å måle protein konsentrasjoner i stedet.
  3. Protein merking
    Merk: Fusjon av et fluorescerende protein til små protein MinE induserer hovedendringer diffusive egenskaper og funksjon; Derfor er kjemiske merking av protein (cystein posisjonen 51) foretrukket over fusion fluorescerende proteiner.
    1. Oppløse 0.125 mg maleimide-dye konjugert i 5-10 µL av DMSO (dimethyl sulfoxide) og legge under risting til en 0,5 mL MinE aliquot i lagring buffer ved pH 7.2, forberedt som beskrevet ovenfor.
    2. Inkuber for 2t overnight på 4 ° C eller 2 h på RT under mild riste eller rør.
    3. Separat fargestoff og protein bruke en gravitasjon flow avsalte kolonnen equilibrated med lagring buffer (50 mM HEPES/KOH pH 7.2, 150 mM KCl, 10% glyserol, 0,1 mM EDTA, 0.4 mM TCEP).
    4. For å ytterligere fjerne noen ledige fargestoff, dialyze protein mot et overskudd av lagring buffer.
    5. Kontroller vellykket merking ved å måle utryddelse nådd for den respektive fargestoffet og beregne den anslåtte merking effektiviteten. Se fargestoff produsentens instruksjoner for en detaljert protokoll på estimere graden av merking. Analysere SDS-side og se totale masse av massespektrometri mer nyttig informasjon om eksempel homogenitet og merking suksess.

2. liten Unilamellar Vesicle (SUV) forberedelse

  1. Generasjon av multilamellar blemmer
    1. Beregne hvor mye lipid(s) i kloroform for ønsket blanding og endelige SUV volum. Konsentrasjonen bør være 4 mg/mL av lipider i Min buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5 150 mM KCl, 5 mM MgCl2). En blanding av 7:3 DOPC:DOPG (mol prosent) anbefales for en standard Min analysen. Når bruker E. coli polar lipid ekstrakt, bruke SLB buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5 150 mM KCl) for alle forberedelsene.
      Merk: Det er ikke anbefalt for førstegangsbrukere bruke E. coli polar lipid ekstrakt som generering av homogene SLBs med denne blandingen er mye mer utfordrende.
    2. Bruker en positiv forskyvning pipette glass tips, bland lipider i kloroform i en 1,5 mL hetteglass.
      1. Tørr lipider under en liten nitrogen strøm mens sakte snu ampullen. Plass lipider under en sterkere nitrogen strøm i 10 til 20 minutter. Plasser ampullen inneholder tørket lipid filmen i et vakuum desiccator og bruke vakuum minst 1t.
    3. Rehydrate lipider i Min buffer av vortexing ved romtemperatur til blandingen er homogent ugjennomsiktig.
      Merk: For generering av små unilamellar blemmer fra multilamellar blemmer, lipider kan enten ekstrudert som beskrevet i 2.2. eller sonicated som beskrevet i 2.3. Generelt gir ekstrudering et smalere størrelsesDistribusjon som kan hjelpe med dannelse av støttede lipid bilayers.
  2. SUV forberedelse ved ekstrudering
    1. Bryte lipid aggregater og multilamellar strukturer og ytterligere solubilize lipider av fryse-tining for 7 til 10 sykluser.
      1. Forbered et beaker med vann på 70° C til 99° C på en kokeplate og en beholder med flytende nitrogen.
      2. Hold ampullen i flytende nitrogen med store pinsett til nitrogen stopper koking. Deretter overføre ampullen til hot vann til løsningen er helt tint. Gjenta disse trinnene til lipid blandingen synes klart for øyet, avhengig av blandingen.
    2. Sett sammen en lipid extruder og pre-skylling systemet med Min buffer. Extrude lipid blandingen mellom 35 og 41 kamper gjennom en membran av 50 nm porestørrelse. Pass på å ende på et ulikt antall passerer å unngå aggregater som aldri krysset membranen.
  3. SUV forberedelse av sonication
    1. Å bedre oppløse satt lipider i buffer, sette hetteglass som inneholder løsningen i en varme blokk til 37 ° C og vortex hver 20 minutter i 1 minutt. Inkuber totalt i ca 1 time.
    2. Senk bunnen av ampullen i en sonicator bad (i dette arbeidet 1,91 L, 80 W) ved ampullen til en klemme stå IDen ønskede høyden.
    3. Angi vannstanden i sonicator badet slik at løsningen rundt ampullen er grundig glade pulser og sonicate lipid blandingen i ca 20 minutter. Sjekk for vellykket sonication ved å vurdere klarheten av lipider.
  4. SUV kan lagres ved 4 ° C i opptil en uke eller frosset ved 20 ° C i små dele (~ 20 µL) og lagret i flere uker. Tine ampuller eller rør ved romtemperatur og sonicate som beskrevet under 2.2.3 eller 5.3 til løsningen er klart før bruk av SUV for forberedelse av støttede lipid bilayers (SLBs). Vennligst går Merk at smale størrelsesDistribusjon av SUV oppnås ved ekstrudering tapt etter frysing og påfølgende tining og sonication.

3. rengjøring Glass Coverslips

Merk: Rengjøring og hydrophilization av glass coverslips er en viktig faktor for homogent og væske støttes lipid bilayers. Glass coverslips kan rengjøres med en piranha løsning, laget av en ratio på 7:2 svovelsyre til 50% hydrogen peroxide (3.1), eller med en oksygen plasma i en plasma renere (3,2). Begge metodene gir lignende resultater.

  1. Piranha rengjøring av coverslips
    1. Bruke piranha løsning
      1. Distribuere glass coverslips på en invertert glass Petriskål eller andre inerte overflate. Med en glass pipette, kan du legge 7 dråper av konsentrert svovelsyre (98%) til midten av hver dekkglassvæske.
        FORSIKTIG: svovelsyre er sterkt syreholdig og etsende. Arbeide med en røyk skap og egnet verneutstyr bare.
      2. Legge til to dråper 50% Hydrogenperoksid i midten av syre dråper.
        FORSIKTIG: Hydrogenperoksid er skadelig for øynene og huden.
      3. Dekke reaksjonen og ruge i minst 45 minutter.
        Merk: Maksimal ventetiden her er ikke avgjørende for utfallet av eksperimentet og kan utvides til flere dager.
    2. Vask piranha renset coverslips.
      1. Plukk opp coverslips individuelt ved hjelp av pinsett og skyll av syre med ultrapure vann. Plass det vasket coverslips teflonbelagt holdere eller liknende transport.
      2. Skyll hver dekkglassvæske mye med ultrapure vann og tørk overflaten med trykksatt gass (nitrogen, luft bare hvis oljefri). Merke den rensede siden av dekkglassvæske med permanent markør.
  2. Plasma rengjøring av coverslips
    1. Skyll coverslips overflødig etanol og etterpå med overflødig ultrapure vann. Tørr coverslips med trykksatt gass. Samle kammer som beskrevet i 4.
    2. Etter kammer forsamling som beskrevet i 4 ta coverslips med tilknyttede kammer og plassere i plasma renere med oksygen som prosessen gass. Rengjør coverslips med plasma (i dette arbeidet 30% makt, 0,3 mbar oksygen press for 1 min ble brukt). Gjør rengjøringen rett før SLB formasjon som beskrevet i 5 som hydrophilizing effekten av plasma renhold avtar over tid.
      Merk: Timing og kraft av plasma rengjøring skal optimaliseres ved hjelp fluorescently merket membraner, som for litt eller overdreven plasma renhold kan både føre til immobile membraner eller membraner med hull.

4. kammer forsamling

  1. Med skarp saks, kuttet og kast lokk og den koniske delen av en 0,5 mL reaksjon rør. Bruke UV-lim på den øvre kanten av røret og distribuere jevnt ved hjelp av en pipette tips.
  2. Fest røret opp ned til den tidligere renset dekkglassvæske. Kontroller at lim den renset siden av glasset ved piranha rengjøring. Kurere UV-limet ved å plassere flere kamre under en 360 nm lampe eller LED i 5 til 15 minutter.

5. støtter Lipid Bilayer (SLB) dannelse

  1. Forvarm varme blokk til 37 ° C og ruge 2 mL reaksjon rør med Min eller SLB buffer, 1 t per kammer.
  2. Blåse nitrogen i de monterte og kurert kamrene fjerne støv eller andre partikler som kan utlignet under UV herding og montering. Plasma ren som beskrevet i 3.2 Hvis du ikke har renset din coverslips med Piranha løsning (3.1). Plasser chambers på varme blokk.
  3. Fortynne en 20 µL aliquot av klart lipider (på 4 mg/mL) med 130 µL av Min buffer eller SLB buffer ved E. coli polar lipid ekstrakt, gir en arbeider konsentrasjon av 0,53 mg/mL. I tilfelle lipider var frosset, sonicate første ved å holde tuben til et bad sonicator før du legger til buffer og sonicate igjen med buffer.
  4. Legge til 75 µL av lipid blanding hvert kammer og sette en tidtaker til 3 minutter (for DOPC/DOPG blandinger; lengre inkubasjon kan være nødvendig for andre lipid blandinger). Pipetter CaCl2 fra en 100 mM lager ved E. coli polar lipid ekstrakt, inn i kammeret til en siste konsentrasjon på 3 mM. Imens inkubering, blemmer sprakk på den hydrofile glassoverflaten og sikring for å danne en sammenhengende SLB.
  5. Etter 60 sekunder, legge til 150 µL av Min buffer hvert kammer.
  6. Vask chambers: etter en annen 120 sekunder (3 minutter totalt) vaske hvert kammer av tilføyer 200 µL av Min eller SLB buffer, nøye pipettering opp og ned et par ganger, fjerne og legge til en annen 200 µL.
    1. Etter hvert kammer har blitt vasket når, fortsette å vaske det første kammeret grundig før det 2 mL bufferen er oppbrukt. Vask av SLBs trenger litt erfaring perfekt omfanget av bevegelser i kammeret og finne riktig vask intensiteten.
      Merk: Ikke Fjern all væsken fra kammeret å unngå tørking av SLB.
      Merk: Over vask, membran egenskaper vil variere avhengig av mange flere faktorer: Type lipider og deres relative konsentrasjoner i lipid blandinger, forberedelse metode for SUVer, overflate behandling og før rengjøring av støtte.

6. Self-Organization analysen

  1. Lydstyrke for bufferen i kammeret til 200 µL Min bufferen minus beløpet av protein og ATP løsning, og deretter legge til sinn, merket sinn, min, og, hvis ønskelig, MinC. Bland forsiktig komponenter av pipettering. Eksempel konsentrasjoner er 1 µM sinn (dopet med 30% EGFP-sinn), 1 µM MinE (dopet med 10% kjemisk merket meg) og 0,05 µM MinC, men mønstre danne over en rekke konsentrasjoner6,10,20,30 .
  2. Legge til 2,5 ATP (fra 100 mM ATP aksjer i 100 mM MgCl2, pH 7.5) for å starte selv-organisering av MinDE.
    Merk: Rekkefølgen av komponenten tillegg (Husk, MinE og ATP) kan varieres og vil ikke påvirke den endelige mønster utfall4.
  3. Observere MinDE selvstendig organisasjon på fluorescens mikroskopet (se Tabell for materiale). MinDE selvstendig organisasjon kan også observeres med TIRF mikroskopi. For bildebehandling eGFP-sinn, kan du bruke en 488 nm Argon laser eller sammenlignbare diode (f.eks 490 nm). Tenkelig mRuby3-sinn er det best å ansette en 561 nm diode laser.
    Merk: Unngå høye nivåer av eksitasjon over lengre tid som vi og andre17 har observert Phototoksisitet i MinDE systemet, fører til irreversible protein polymerisasjon på membranen.

7. PDMS microstructures

Merk: PDMS (polydimethylsiloxane) er en polymer som kan brukes til produksjon av microstructures og microfluidic enheter. En mønstret silisium wafer fungerer som en støpeform for casting PDMS strukturer. PDMS strukturer så fungere som en støtte for SLB dannelse og analysen oppsett.

  1. Begge føre silisium wafer med microcompartments selv med klima og jordsmonn (se Zieske og Schwille for detaljert protokollen31 eller Gruenberger et al. en video protokollen32) eller Bestill din ønskede silisium wafer fra et støperi . Se tilleggsinformasjon på mønsteret av kjeks brukes her.
  2. Produksjon av PDMS microstructures fra mønstret silisiumskiver.
    1. Bruk en plastkopp for å veie 10 g PDMS base og 1 g PDMS crosslinker. Enten bruke en blanding enhet å blande og degas PDMS blandingen eller manuelt blanding av PDMS og deretter degas under vakuum.
    2. Bruke en pipette tips for å slippe en liten mengde PDMS direkte på strukturen på silisium kjeks.
      Merk: Vær forsiktig med å klø silisium kjeks.
    3. Umiddelbart plassere en #1 dekkglassvæske på PDMS drop og ta den øvre enden av ren pipette tipset til trykk forsiktig dekkglassvæske bort på kjeks silisium. PDMS bør være å spre tynt mellom dekkglassvæske og silisium kjeks.
    4. Plasser kjeks med coverslips i en ovn og kurere PDMS i 3-4 timer eller over natten på 75 ° C. Fjern kjeks fra ovnen og la den avkjøles til romtemperatur. Med et barberblad, nøye fjerne dekkglassvæske med det vedlagte PDMS fra SI wafer.
      Merk: For å forhindre silisium kjeks å bli skitten eller skadet, dekk alltid microstructures med PDMS og en dekkglassvæske. Men bruker PDMS aldre, noe som resulterer i sprekker i microstructures, derfor ikke PDMS strukturer som er eldre enn to til tre uker.

8. Self-Organization in PDMS Microstructures

  1. Bruk coverslips med PDMS microstructures å feste et kammer som beskrevet under 4.
  2. Rengjør og hydrophilize overflaten i en oksygen plasma renere som beskrevet under 3.2.2. Gjør ikke piranha ren PDMS underlag.
  3. Oppsett en MinDE Self-Organization analysen som beskrevet under 6.
  4. Etter innstilling opp analysen, se etter vanlige MinDE mønster formasjon og riktig formet microstructures på fluorescens mikroskopet.
  5. Når vanlige MinDE mønstre har dannet (10-30 min), forsiktig Pipetter opp og ned to ganger for å blande komponenter og deretter fjerner bufferen trinnvis ved pipettering. Fjerne hoveddelen av buffer ved hjelp en 100 µL Pipetter forsiktig ta resten bruker en 10 µL pipette.
    Merk: Dette trinnet kanskje trenger litt øvelse. Hvis for mye buffer er tatt ut eller prosessen tar for lang tid, vil microstructures tørkes ut; Hvis også lite er tatt, proteiner vil ikke bli begrenset i microstructures, men fortsette å danne reiser overflatebølger.
  6. Umiddelbart lukke kammeret med lokk for å unngå tørking av gjenværende bufferen i microstructures.
  7. For å tillate lengre tenkelig ganger, koble en fuktet stykke svamp inne i kammeret og Lukk med lokk. Kontroller at svampen ikke får kontakt med overflaten av dekkglassvæske.
  8. Før avbildning av microstructures se på overflaten at bufferen ble senket nok, slik at i overflaten microstructures MinDE mønster dannelsen har stoppet. Bildet MinDE svingninger i microstructures. Kontroller at microstructures ikke er tørket eller er tørke ut under bildebehandling.
    Merk: Forkaste coverslips med microcompartments etter hver bruk, en sprekk i skjemaet PDMS.

9. analyse av MinDE mønster formasjon

  1. Kvantifisere bølgelengde, bølge hastighet og bølge profiler av MinDE selv-organisering på planar støttes lipid bilayers. FIJI med settet med pakket plugins er tilstrekkelig for grunnleggende analyse33.
  2. Analysere Pol-til-Pol svingninger i microcompartments ved kymographs og gjennomsnittlige protein konsentrasjon profiler. Grunnleggende kymographs kan fås ved kutting re en tidsserier langs et linjevalg i FIJI.

Representative Results

Protein rensing etter våre Protokoll skal gi Min proteiner tilstrekkelig renhet. Som henvisning gir figur 1 et SDS-side bilde av sinn, fluorescently merket sinn, MinE og MinC. De individuelle trinnene av fremgangsmåten for å utføre en MinDE Self-Organization analysen på ikke-mønstret støttes lipid bilayers er beskrevet i figur 2. Bruker denne protokollen, kan vanlig MinDE reiser overflatebølger observeres gjennom kammeret (Figur 3). Bølgelengden kan variere noe innenfor kammeret, men generelt mønstre ligne. Kantene av kammeret bør ikke brukes for kvantitative sammenligninger, som membraner at skjemaet på UV limet synes å ha andre egenskaper enn på glasset overflaten (se Figur 3 c). Reiser overflatebølger kan analyseres ved å plotte intensiteten forplantning retning (figur 3B). Mens sinn fluorescens flyer ganske fort fra forkanten av bølgen og reduseres deretter kraftig på den etterfølgende kanten, MinE fluorescens øker nesten lineært fra starten av MinD wave og når sitt maksimum etter sinn på etterfølgende kanten, der det faller kraftig6.

Ved siden av protein kvalitet er kvaliteten på støttede lipid bilayers mest avgjørende for en vanlig selv-organisering av MinCDE. På den ene siden hvis membranen vasket for overdrevet eller underliggende overflaten er renset og dermed belastet for sterkt, hull kan danne i membranen (figur 6A, topp). På den annen side hvis membranen ikke er vasket skikkelig ikke eller underliggende overflaten rengjort/hydrophilized, blemmer vil holde seg til membranen eller membran flyt blir kompromittert (figur 6A, bunnen). Selv om ikke så tydelig som når observere membranen direkte via merket lipider, disse problemene kan også bli oppdaget fra sinn fluorescens signalet, som mønstre er ikke vanlige og fluorescens i maxima er ikke homogen, men inneholder "hull" eller lyspunkter som vist i midtre panelet i figur 6A.

For MinDE selv organisasjonen i stav-formet PDMS microstructures summeres prosedyren i Figur 4. Flere protokollen trinn trenger ikke gjentas, som proteiner og lipider kan gjenbrukes. Som ikke-mønstret underlag, underlaget er renset og hydrophilized (av plasma-rengjøring), en støttet lipid bilayer er dannet på PDMS og Self-Organization analysen er satt opp i et volum på 200 µL. For å kontrollere at en skikkelig membran har dannet og MinDE selv organiserer på membranen, er kamrene fotografert. Når en riktig membran har blitt dannet, MinDE skjemaer vanlig reise overflaten bølger på overflaten av PDMS mellom de individuelle microstructures og selv organiserer også nederst på microstructures bølger kan fritt flytte over hele membranen dekkes overflate (figur 5A). Etter buffer fjerning, bør overflaten mellom seksjonene ikke vise noen spre MinDE mønstre (figur 5B), som det skal være helt tørr. Hvis MinDE mønstre er fortsatt, må mer bufferen fjernes. Proteiner er nå begrenset i stav-formet microcompartments membran-kledd PDMS og luft i øvre grensesnittet (figur 5C), som de selv organiserer. Under disse forholdene kan to proteinene utføre Pol-til-Pol svingninger som vist i figur 5 d. Som en brøkdel og min er alltid membran-bundet, også er under buffer fjerning, konsentrasjonen etter buffer fjerning ikke sammenlignbare å input konsentrasjoner. På grunn av denne effekten variere konsentrasjonen også mellom individuelle microstructures på den samme dekkglassvæske som de er avhengig av plasseringen av mønstrene før bufferen fjerning. Silisium wafer produksjon eller PDMS molding fra silicon kjeks kan resultere i ufullstendige microstructures som ikke kan brukes for analyse (figur 6B). Videre, på grunn av bufferen fjerning microstructures kan tørke ut under prosessen, og derfor bør utelukkes fra videre analyse (figur 6B). Resultatet viser bare en brøkdel av microstructures i et kammer ønsket Pol-til-Pol svingninger. Analysere protein dynamikk i microstructures, kan en kymograph fås ved å tegne et utvalg over hele strukturen (figur 5E). Da MinCDE svinge fra pole-til-Pol, vil MinC og sinn vise en gjennomsnittlige konsentrasjon gradient med maksimal konsentrasjon ved kupé polene og minimal konsentrasjon i batterirommet (figur 5F).

Figure 1
Figur 1: SDS-siden viser siste produkter av protein renselser. Hans sinn (33.3 kDa), hans-eGFP-sinn (60.1 kDa), hans-mRuby3-sinn (59.9 kDa), hans-MinE (13.9 kDa) og hans-MinC (28.3 kDa) vises i rekkefølge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: prosessflyten diag viser de individuelle trinnene og timing av protokollen for et selv-organisering på ikke-mønstret støttes lipid bilayers (trinn 1-6). Stiplede bokser angir at en av disse to alternativene kan brukes for rengjøring. Pilene preget av sirkler angir hvor protokollen kan midlertidig og fortsette senere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Imaging MinDE analysen av AC confocal mikroskopi. A) vanlig Min spiral, fra hvilken bølge overføring hastighet og intensitet tomten hastighet målinger kan oppnås. Konsentrasjoner brukes: 0.6 µM sinn (30% eGFP-sinn), 1,8 µM hans-MinE (30% hans-min-Alexa647) B) eksempel normalisert intensitet tomten for regionen merket i A. C) oversikt over hele analysen kammer (skala bar: 1 mm, samme protein konsentrasjoner som over). Spiraler slå begge retninger samt målet mønstre kan observeres. Det forstørrede området viser hvordan bølgemønstre forskjellig på UV-limet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: prosessflyten diag viser de individuelle trinnene og timing av protokollen for selvstendig organisasjon i stav-formet microstructures (trinn 1-5, 7, 8). Grå bokser angir trinn der produkter kan gjenbrukes fra protokollen på ikke-mønstret støttes lipid bilayers. Pilene preget av sirkler angir hvor protokollen kan midlertidig og fortsette senere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant resultater for MinDE mønster dannelse i stav-formet PDMS microcompartments. A) MinDE selv organisere på overflaten av PDMS danner reiser overflatebølger (1 µM sinn (30% EGFP-sinn), 2 µM MinE og 2,5 ATP). B) når bufferen er senket til høyden på microstructures, protein selv-organisering stopper på planar overflaten mellom microcompartments. C) skjematisk av en stav-formet microcompartment. D) representant bilder av MinDE Pol-til-Pol svingninger etter buffer fjerning. E) Kymograph av svingninger langs den uthevede linjen vist i D). F) bildet og profil av gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av tiden-serien vist i D) tydelig viser protein graderingen maksimal på microcompartment polakkene og minimal ved kupé. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: eksempler på negative eksperimentelle resultater. A) over vasket membraner samle hull, mens suboptimal vesicle forberedelser og lipid komposisjoner føre til stikker blemmer. To center panelene viser en kombinasjon av både problemer og hvordan de blir synlige når observere Min svingninger. Membraner var merket med 0,05% Atto655-DOPE. (skala barer: 50 µm) B) toppanelet: tørket ut microcompartments kan skyldes mye buffer fjerning eller når bufferen fordamper over tid. Nedre panelet: ufullstendig avdelinger kan dannes under wafer produksjon eller PDMS molding. (skala barer: 30 µm) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende filen 1: Plasmider kart for hans sinn. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende filen 2: Plasmider kart for hans-EGFP-sinn. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende filen 3: Plasmider kart for hans-mRuby3-sinn. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende filen 4: Plasmider kart for hans-MinE. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 5: Plasmider kart for hans MinC. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende filen 6: CAD-filen for silisium wafer av stav-formet microcompartments. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Vi har beskrevet en protokoll for i vitro rekonstituering av MinCDE selv-organisering på planar støttede lipid bilayers og i lipid bilayer dekket 3D strukturer, bruker eksemplet med stav-formet PDMS microstructures. For å få verdifulle data fra disse analyser, er de viktigste faktorene å kontrollere protein og membran kvalitet.

Å sikre protein kvalitet, protein masse skal bekreftes SDS side og massespektrometri. Videre må det bekreftes at proteiner er løselig og ikke aggregerte, ved hjelp av analytiske gel filtrering eller dynamisk lysspredning. Gel filtrering kan brukes til å fjerne alle aggregerte brøkdel av proteiner. Nøye pH justering og kvaliteten på ekstra nukleotider er kritisk, som i tillegg ikke-justert eller delvis forringet nukleotid protein aksjer eller selv-organisering analyser er tilstrekkelig til å eliminere protein aktivitet, derfor avskaffe Self-Organization.

Ved siden av protein kvalitet, membranen er mest kritiske og upassende membran formasjon er ofte årsaken defekt selv-organisering og opprinnelsen til artefactual overflaten strukturer.

Når du utfører protokollen for første gang, er det nyttig å merke støttes lipid-bilayers ved å inkludere merket lipider som Atto-655-DOPE eller DiI på lav molar prosenter (0,05%). Dermed kan egenskapene og kvalitet av membranen bedømmes direkte. Bruker FRAP, kan flyt av membranen vurderes. Videre kan en direkte vurdere kvaliteten på vask av SLB, som det vil enten være for mange blemmer, ingen væske membran eller ingen membran, hvis det har blitt vasket. Åpne kammeret tilnærming tillater å grundig vaske membranen, og dermed også for å fjerne blemmer som stikker på overflaten av SLB. De mest avgjørende faktorene for å få væske og homogen støttes lipid bilayers er rengjøring og hydrophilicity støtte overflaten og riktig størrelse og homogene SUvs kan det være nyttig å sjekke SUV størrelse og størrelse distribusjon ved hjelp dynamisk lysspredning. Smale størrelse distribusjoner anbefaler vi ekstrudering blemmer i stedet for å sonicating dem. Andre metoder for rengjøring coverslips, f.eks behandlinger med sterke baser, grunnleggende vaskemidler eller bruke coverslips direkte etter skylling med vann, kan gi gode resultater, avhengig av programmet og lipid blandingen.

Første halvdel av protokollen presenteres her, i vitro rekonstituering på planar støttes lipid bilayers i åpne chambers, har fordelen av gjengivelse overflaten tilgjengelig for optisk microscopies, som TIRF mikroskopi30FRAP analyse6, enkelt-partikkel sporing34, likeledes idet overflaten sonde teknikker som atomic force mikroskopi26. Stor homogen området gir bedre statistikk på definerte konsentrasjoner. Videre kan åpne kammeret tilnærming til nettopp styre protein konsentrasjon og en rask og enkel tillegg av flere komponenter, derfor tillater for å sjarmere protein konsentrasjon i en enkelt kammer20. Analysen kan også bli utvidet med tillegg av andre bakteriell divisome komponenter som FtsZ22,35, ZipA22 eller chimeric protein FtsZ-YFP-MTS10,35.

Andre grupper har tatt en lignende tilnærming til gjenoppbygge på Min systemet i vitro, men bruk en flyt-celle i stedet for en åpen kammer17,18,19. Flyt-celler har visse fordeler, spesielt når et innelukket 3D-miljø er nødvendig18, påvirkning av flyt17,19,23 eller membran komposisjon23 på MinCDE mønstre undersøkt, eller hvis protein mønstre er å bli observert under protein begrense forhold19. Likevel, lokale kontroll av molekylære konsentrasjoner er vanskeligere. Protein komponenter, spesielt sinn, sterkt binde til membranen de første møte18,19. I vår erfaring oppfører proteiner uspesifisert binding til rør, viker, sprøyter og andre microfluidic. Derfor lokale protein konsentrasjoner er forskjellig fra input konsentrasjoner18 og også variere over lengden av flyt-cellen, som resulterer i en rekke forskjellige protein mønstre på membranen mellom innløp og utløp, som observert av andre19.

Den andre halvparten av protokollen presenteres her, i vitro rekonstituering i stav-formet microstructures å bruke åpne kammeret tilnærming på en mønstret støtte dekket av lipid bilayers gir en enkel etterligne i vivo protein atferd Selv om nøyaktig kontroll over protein konsentrasjoner er tapt på grunn av buffer fjerning. Merk at fordi Bølgelengden av MinDE er om en størrelsesorden større i vitro enn i vivo stav-formet microcompartments er også om en størrelsesorden større (10 x 30 µm) enn en stav-formet E. coli celle.

Samlet gir denne protokollen presis kontroll over alle betingelser inkludert protein konsentrasjon, buffer komposisjon og membran egenskaper. Bruk av 3D strukturert støtter kan reaksjonen til studeres under romlige confinement, etterligne vivo virkemåte uten behov for komplisert microfluidics utstyr.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Michael Heymann og Frank Siedler for produksjon av silisium wafere, Core anlegget MPI-B for hjelp i protein rensing og Simon Kretschmer og Leon Harrington for kommentarer på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
DOPG Avanti Polar Lipids 840475
E.coli polar lipid extract Avanti Polar Lipids 100600
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate Roche
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma A5285-1G
Sodium chloride VWR 27810.295
Potassium chloride Roth 6781.1
Tris-base Sigma Aldrich T1503-1kg
Hydrochloric acid Roth 9277.1
TCEP-HCl Termo Fisher Scientific 20491
Ethylene Diamine Tetraacetate Merck Millipore 1.08418.1000
Sulfuric Acid 98% Applichem 173163.1611
Hydrogen Peroxide 50% Applichem 147064.1211
HEPES Biomol 05288.1
dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 102950 Uvasol
Glycerol 86% Roth 4043.1
TB medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roth 2316.x
Atto-655-DOPE Atto Tec AD 655-161
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
PDMS base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
PDMS crosslinker Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue Norland Products 6801 #68 and #63 both work well
Coverslips #1.5 24x24 mm Menzel Gläser
Coverslips #1 24x24 mm Menzel Gläser used only for PDMS microstructures
0.5 ml reaction tube Eppendorf  0030123301
culture flask 2L Corning e.g. 734-1905
His-Trap HP GE Healthcare Life Sciences
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column Biorad 7322010
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL Termo Fisher Scientific 66333 or 66330
razor blade
Instruments
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Merck
automated protein purification system: Äkta Pure GE Healthcare Life Sciences
bath sonicator Branson e.g. Model 1510
ARE-250 mixer Thinky Corporation
Plasma cleaner Zepto Diener electronic use oxygen as process gas
positive displacement pipettes Brand Transferpettor models with glass tips
LSM780 confocal laser scanning microscope Zeiss Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield
pET28a-His-MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
  2. Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
  3. Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
  4. Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
  5. Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
  7. Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
  8. Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
  9. Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
  10. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949 (2014).
  11. Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
  12. Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
  13. Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  14. Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758 (2014).
  15. Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
  16. Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
  17. Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
  18. Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271 (2016).
  19. Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
  20. Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).
  21. Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
  22. Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
  23. Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
  24. Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
  25. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
  26. Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
  27. Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).
  28. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116 (2013).
  29. Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
  30. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
  31. Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
  32. Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560 (2013).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
  35. Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).

Tags

Biokjemi problemet 137 In vitro rekonstituering Husk meg støttede lipid bilayer mønster formasjon microstructures selvstendig organisasjon
<em>In Vitro</em> Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P.… More

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P. In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (137), e58139, doi:10.3791/58139 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter