Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In Vitro Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager

Published: July 28, 2018 doi: 10.3791/58139
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

Vi tillhandahåller ett protokoll för in vitro självorganisering analyser av sinne och min på en stöds lipid lipidens i en öppen kammare. Dessutom beskrivs hur man bifoga analysen i lipid-klädda PDMS microcompartments att efterlikna i vivo villkor av reaktion inneslutning.

Abstract

Många aspekter av grundläggande spatiotemporal organisationen av celler är styrda av reaktion-diffusion typ system. In vitro beredning av sådana system möjliggör detaljerade studier av deras underliggande mekanismer som inte skulle vara genomförbar invivo. Här ger vi ett protokoll för in vitro- beredning av MinCDE systemet av Escherichia coli, som placerar celldelning septum i cell mitten. Analysen är utformad för att leverera endast komponenterna som behövs för självorganisering, nämligen ett membran, de två proteinerna sinne och mitt och energi i form av ATP. Vi fabricera därför en öppen reaktionskammaren på ett täckglas, som en stöds lipid lipidens bildas. Den öppna konstruktionen av kammaren tillåter optimal förberedelse av den lipid lipidens och kontrollerade manipulation av bulk innehållet. De två proteinerna, sinne och MinE, samt ATP, läggs sedan in i bulk volymen över membranet. Bildbehandling är möjligt genom många optiska microscopies, som design stöder confocal, wide-fältet och Frida mikroskopi likadana. I en variant av protokollet bildas den lipid lipidens på en mönstrad stöd, på cell-formade PDMS mikrostrukturer, i stället för glas. Sänka bulk lösningen på kanten av dessa avdelningar omsluter reaktionen i ett mindre utrymme och ger gränser som gör att härma i vivo oscillerande beteende. Sammantaget beskriver vi protokoll för att rekonstituera MinCDE systemet både med och utan fysisk inneslutning, så att forskare att exakt styra alla aspekter påverkar bildandet av mönster, såsom koncentrationsintervall och tillägg av andra faktorer eller proteiner, och att systematiskt öka system komplexitet i en relativt enkla experiment.

Introduction

Spatiotemporal mönster är viktiga i naturen, reglera komplexa uppgifter både på flercelliga och cellulär nivå, från morfogenes till reglerade celldelning1,2. Reaktion-diffusion system spelar en viktig roll i upprättandet av dessa mönster, men är fortfarande inte förstått. Ett utmärkt exempel på en reaktion-diffusion system och bäst kännetecknas biologiska system är hittills Escherichia coli MinCDE system3,4,5,6,7. MinCDE systemet svänger från cell pole till cell pole i E. coli att avgöra mitten av cellen som den framtida avdelning platsen. Detta system bygger på ATPas sinnet, den ATPas aktiverande protein MinE, och membranet som en fysisk reaktion matris8. MinC är inte del av mekanismen för bildandet av mönster, men är den faktiska funktionella agenten: en hämmare av proteinet huvudsakliga divisome FtsZ5,6. MinC binder till sinne och därför följer svängningarna, vilket resulterar i en tid-genomsnitt protein koncentration gradient som är maximal vid cell polerna och minimal cell på mitten, endast tillåta FtsZ att polymerisera vid midcell9,10 . Systemets MinCDE är en del av den större familjen Walker A ATPases som är nyckeln till spatiotemporal organisationen i bakterier2, för positionering och transport protein komplex11 och plasmider12 och för att reglera cellen Division13 och kromosom segregation14. Därför MinCDE reaktion-diffusion systemet inte bara representerar en arketypisk reaktion-diffusion system, men har också uppmärksammats på grund av dess relevans för spatiotemporal organisationen i bakterier.

Detaljerade funktionella studier av det MinCDE systemet i vivo är komplicerade, eftersom manipulation av proteiner och genterapi radering oftast resultera i celldelning defekter. Dessutom det är utmanande att ändra membran sammansättning eller egenskaper i cytosolen i vivo 15,16. Ändringar i systemet och påverkande faktorer är svårt att tolka i komplexa miljön av cellen, ännu mer så om det är störd i en sådan viktig funktion som celldelning. Vi och andra har därför vänt sig till en in vitro beredning-metod, att minska systemet till dess huvudkomponenter: sinne, gruvan, ATP som energikälla, och stöds lipid lipidens som en reaktion matrix6,17, 18. denna bottom-up-strategi tillåter sond mekanismen av självorganisering i detalj utan komplexiteten av en levande cell. Formuläret proteiner resor ytan vågor6 och andra sorters mönster17,19 under dessa förhållanden, om än med en våglängd som handlar oftast om en magnitud större än i vivo. Underlättar exakt kontroll över alla aspekter påverkar mönster bildandet av en öppen kammare: protein koncentrationer6, protein boenden20, membran sammansättning10, buffert sammansättning och ATP koncentrationen 6, samt tillägg av andra faktorer såsom trängsel agenter21 och andra divisome proteiner22. I jämförelse, kan in vitro- beredning av MinCDE systemet i ett flöde cell18,19,23 användas för att undersöka påverkan av flöde17,23, protein begränsande villkor19, membran sammansättning19 och full 3D instängdhet18 på protein mönster, men gör en exakt kontroll av protein komponent koncentration och sekventiell komponent tillägg mycket mer komplicerat.

Använder denna öppna kammare, vi också mönstrad stöd av de planar lipid-lipidmonolager som kan en sond hur geometriska gränser inflytande mönster bildandet21, ett fenomen som har nyligen också varit undersökta i vivo med bakterier gjutna i mikrostrukturer7. Vi har också anställd denna analys att undersöka hur definierade mutationer i min påverkar mönster bildandet av system20. Samma grundläggande assay format har dessutom varit anställd att undersöka hur mönster bildandet kan styras av ljus, att införa en azobenzene-tvärbunden gruvan peptid i analysen och imaging med Frida mikroskopi24.

Vi hittade att bildning för att replikera den MinDE mönstret observerats i vivo i en in vitro- system, fångenskap var nyckeln. Tillåtet att använda stavformade microcompartments, med måtten anpassas till den större våglängd av MinDE i vitro (10 x 30 µm), med en stöds lipid lipidens plätering rekonstitution av MinDE pol-till-pol svängningar och protein gradient bildas 10,25. I denna analys sätts stöds lipid-lipidmonolager på en mönstrad PDMS substrat som innehåller flera hundra repliker av stavformade microcompartments som förblir öppna på toppen. Reaktionen kan ställas in i en öppen kammare av detta, och därefter bufferten sänks till kanten av den microcompartments, därmed begränsar reaktionen till en liten volym. Även om dessa avdelningar har ett luft-buffert gränssnitt på ena sidan och därmed representerar inte en full 3D nedkomsten av membran, härmade protein dynamiken i vivo svängningar10,25. Jämfört med full 3D instängdhet, som visar mycket liknande resultat18, öppna mikrostrukturer analysen är relativt enkel och lätt att hantera och kan även utföras av laboratorier som inte är utrustade med specialiserade mikrofluidik utrustning och renrum faciliteter.

Här presenterar vi ett experimentellt protokoll för beredning av MinCDE mönster bildas på stöds lipid lipidmonolager in vitro- med en öppen kammare som möjliggör kontroll av alla komponenter och enkel tillgång av optisk mikroskopi och, med mindre ändringar, är också anpassningsbar för surface-probe tekniker26. Bredvid planar stöds lipid lipidmonolager, vi visar också hur protein förlossningen kan vara erhållits med enkla mönstrade stöds lipid lipidmonolager på stavformade PDMS mikrostrukturer. Dessa analyser, kan även om optimerad för MinCDE-systemet, även överföras till andra protein system som samverkar på ett liknande sätt med membranet, såsom FtsZ27 eller en minimal aktin cortex28.

Protocol

1. proteinproduktion

  1. Proteinuttryck
    1. Omvandla E. coli BL21 (DE3) pLysS med respektive plasmiden uttryck för sinne6, andra-MinD29, mRuby3-MinD24, gruvan6 eller MinC30. För plasmid kartor, se tilläggsinformation.
    2. Inokulera en övernattning kultur i LB medium med en enda koloni med respektive antibiotika (t.ex.100 µg/mL Ampicillin eller 50 µg/mL Kanamycin) och inkubera vid 37 ° C för 14-16 h under omskakning.
    3. Inokulera 500 mL TB medium som innehåller respektive antibiotika med övernattning kulturen (spädning 1: 200) och inkubera kultur vid 37 ° C under omskakning vid 180 rpm.
    4. Inducera proteinuttryck genom att lägga till 0,5 mM IPTG när kulturen når en optisk densitet på 600 0,5-0,7 nm. Vid andra-sinne eller mRuby3-MinD, skifta celler till en inkubator med 16 ° C och odla cellerna för 14-16 h, och om MinC, sinne eller MinE, odla cellerna under 3-4 timmar vid 37 ° C efter induktion.
      Obs: Induktion MinC, sinnestillstånd eller MinE uttryck är giftiga för cellerna, som överuttryck resulterar i defekter i celldelning. Därför är det viktigt att inkubationstiden vid 37 ° C hålls under 4 h. Om det behövs mer protein, öka mängden kultur, men inte inkubationstiden.
    5. Efter respektive inkubationstiden skörda celler genom centrifugering vid 4000 x g i 10 min och lagra cellpelleten vid-80 ° C tills vidare användning.
  2. Protein rening
    Obs: Proteiner kan renas med färdigförpackade Ni-NTA kolumner på en automatiserad protein reningssystem eller använda Ni-NTA pärlor för gravitation-flow bänk rening.
    1. För rening med färdigförpackade Ni-NTA kolumner på automatiserade protein rening system användning buffert A1 (50 mM natriumfosfat pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol), buffert B1 (50 mM natriumfosfat pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol) och buffert C1 (50 mM natrium fosfatbuffert pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol). För gravitation-flow bänk rening med Ni-NTA pärlor använda buffert A2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol), buffert B2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) och buffert C2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol). Komplettera alla buffertar med 10 mM ß-merkaptoetanol eller 0,4 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) som reduktionsmedel precis före användning.
    2. Återsuspendera cellerna i 20-30 mL buffert A1 eller A2 kompletteras med EDTA-fria proteashämmare, 100 µg/mL lysozym, ~ 250 U/mL DNAS och 0,2 mM Mg2 +- ADP (Mg2 +- ADP vid sinne eller andra-MinD rening endast från en 100 mM ADP lagerför i 100 mM MgCl 2 med pH justerat till 7,5).
    3. Lysera celler med en tip någon sonikator (30% amplitud, 2,5 min, 30 s puls, 30 s off) medan du håller injektionsflaskan med cellerna i ett isbad.
    4. Ta bort cellfragment genom centrifugering cellen lysate för 45 min vid 25 000 x g och 4 ° C.
    5. Inkubera supernatanten på Ni-NTA kolumn eller Ni-NTA pärlor.
      1. För färdigförpackade Ni-NTA kolumner, Ladda provet till kolonnen med hjälp av provtagningspumpen av en automatiserad protein reningssystem.
      2. För bänk rening, inkubera provet med Ni-NTA pärlor i en 50 mL reaktionsröret på en roterande skakapparat vid 4 ° C för 1 h. För de efterföljande stegen, över Ni-NTA pärlorna till en tom kolumn med 25 mL pipett.
    6. Tvätta med minst 5 kolumn volymer av buffert A1 eller A2.
    7. Tvätta med minst 5 kolumn volymer av buffert B1 eller B2.
    8. Eluera protein med buffert C1 eller C2.
    9. Bedöma protein renhet via SDS-PAGE.
    10. Valfritt: Rena ytterligare protein genom att tillämpa det på en gel filtrering kolumn jämviktas i lagring buffert (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glycerol, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0,2 mM Mg2 +- ADP vid sinne)).
      Obs: Gelfiltrering rekommenderas för sinne ta bort aggregerade proteinfraktion.
    11. Om ingen gel-filtrering är anställd, utbyta Ni-NTA eluering buffert lagring buffert (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glycerol, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0,2 mM Mg-ADP vid sinne)) använder en gravitation flöde avsaltning kolumn (se Tabell för material).
    12. Chock-frysa proteiner i alikvoter i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C tills vidare användning.
    13. Mät lager proteinkoncentration med Bradford-analys, och bestämma protein aktivitet med en ATPas assay20.
      Obs: Bedömer inte proteinkoncentration med absorption vid 280 nm. Förekomsten av nukleotid under sinne reningen och bristen på tryptophans i min snedvrider en280 koncentration mätningar. Användning Bradford eller BCA-analyser för att mäta protein koncentrationer istället.
  3. Protein märkning
    Obs: Fusion av ett fluorescerande protein till små proteinet MinE inducerar större förändringar till dess diffus egenskaper och funktion; Därför är kemisk märkning av proteinet (cystein vid position 51) att föredra framför fusion till fluorescerande proteiner.
    1. Lös 0,125 mg av maleimide-dye-konjugat i 5-10 µL av DMSO (dimetyl sulfoxid) och tillsätt under skakar till en 0,5 mL MinE alikvotens i lagring buffert vid pH 7,2, beredd enligt beskrivningen ovan.
    2. Inkubera i 2 h till övernattning vid 4 ° C eller 2 h på RT under milda skakningar eller omrörning.
    3. Separat färgämne och protein med hjälp av en gravitation flöde avsaltning kolumn jämviktas med lagring buffert (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glycerol, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP).
    4. För att ytterligare ta bort all lös färg, dialyze proteinet mot ett överskott av lagring buffert.
    5. Verifiera lyckad märkning genom att mäta utrotning vid maximal för respektive färgämnet och beräkna uppskattade märkning effektivitet. Hänvisas till färgämne tillverkarens instruktioner för en detaljerad protokollet om uppskatta graden av märkning. Analysera med SDS-PAGE och fastställa totala massan av mass spectrometry för ytterligare användbar information om provets homogenitet och märkning framgång.

2. små Unilamellar vesikler (SUV) förberedelse

  1. Generation av multilamellar blåsor
    1. Beräkna mängden lipid(s) i kloroform för din önskad blandning och slutliga SUV volym. Koncentrationen bör vara 4 mg/mL av lipider i Min buffert (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2). För en standard Min analys rekommenderas en blandning av 7:3 DOPC:DOPG (mol procent). När med hjälp av E. coli polar lipid extrakt, använda SLB buffert (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl) för alla förberedelser.
      Obs: Det rekommenderas inte för första gången användare att använda E. coli polar lipid extrakt som generationen av homogen SLBs med denna blandning är mycket mer utmanande.
    2. Med positiv förskjutning pipett med glas tips, blanda lipider i kloroform i en 1,5 mL injektionsflaska av glas.
      1. Torka av lipider under en liten kväve ström medan långsamt vrida injektionsflaskan. Placera lipider under en starkare kväve-ström i 10 till 20 minuter. Placera injektionsflaskan med torkade lipid filmen i vakuum exsickator och tillämpa vakuum för minst 1 h.
    3. Rehydrera i lipider i Min buffert genom vortexa i rumstemperatur tills blandningen är homogent ogenomskinlig.
      Obs: För generationen av små unilamellar blåsor från multilamellar blåsor, lipider kan antingen vara pressad som beskrivs i 2.2. eller sonicated som beskrivs i punkt 2.3. I allmänhet, ger extrudering en smalare storlek distribution som kan hjälpa till med bildandet av stöds lipid lipidmonolager.
  2. SUV förberedelse av extrudering
    1. Bryta lipid aggregat och multilamellar strukturer och ytterligare solubilize lipider av freeze-upptining för 7-10 cykler.
      1. Förbered en bägare med vatten vid 70° C till 99° C på en värmeplatta och en behållare med flytande kväve.
      2. Håll injektionsflaskan i flytande kväve med stor pincett tills kvävet stannar kokningen. Överför sedan injektionsflaskan så att varmvatten tills lösningen är helt tinat. Upprepa dessa steg tills lipid blandningen visas tydligt i ögat, beroende på blandningen.
    2. Montera en lipid extruder och före skölj systemet med Min buffert. Extrudera lipid blandningen mellan 35 och 41 gånger genom ett membran med 50 nm porstorlek. Se till att avsluta på ett udda antal passerar att undvika aggregat som aldrig passeras membranet.
  3. SUV förberedelse av ultraljudsbehandling
    1. Att bättre lösa in lipider i bufferten, sätta i injektionsflaska av glas innehållande lösningen i ett värme block 37 ° C och vortex varje 20 minuter i 1 minut. Inkubera totalt för ca 1 h.
    2. Doppa botten av injektionsflaskan i en någon sonikator bad (i detta arbete 1,91 L, 80 W) genom att fästa injektionsflaskan först på en klämma monter på önskad höjd.
    3. Ställa in vatten höjd i någon sonikator badet så att lösningen kring injektionsflaskan är ordentligt upprörd av pulserna och Sonikera lipid blandningen i ca 20 minuter. Kontrollera om framgångsrika ultraljudsbehandling genom bedömning av klarheten av lipider.
  4. Stadsjeepar kan lagras vid 4 ° C i upp till en vecka eller fryst vid-20 ° C i små portioner (~ 20 µL) och lagras i flera veckor. Tina injektionsflaskor eller rör vid rumstemperatur och Sonikera igen som beskrivs enligt 2.2.3 eller 5.3 tills lösningen är klar innan stöd för att använda stadsjeepar för beredning av lipid lipidmonolager (SLBs). Observera att smala storleksfördelning av stadsjeepar framställda genom extrudering är förlorade efter frysning och efterföljande upptining och ultraljudsbehandling.

3. rengöring glas Coverslips

Obs: Rengöring och hydrofilisering av glas coverslips är en viktig faktor för homogen och vätska stöds lipid lipidmonolager. Glas coverslips kan rengöras med en lösning för piranha, görs från ett förhållande på 7:2 svavelsyra 50% väteperoxid (3.1), eller med en syre plasma i plasma renare (3.2). Båda metoderna ger liknande resultat.

  1. Piranha rengöring av coverslips
    1. Tillämpa piranha lösning
      1. Distribuera glas coverslips på en inverterad glas petriskål eller annan inert yta. Med glas pipett, lägga till 7 droppar koncentrerad svavelsyra (98%) i mitten av varje täckglas.
        Varning: svavelsyra är starkt sura och frätande. Arbeta i dragskåp och med lämplig skyddsutrustning och endast.
      2. Tillsätt två droppar 50% väteperoxid till mitten av den sura droppar.
        Varning: väteperoxid är frätande på ögon och hud.
      3. Täcka reaktionen och inkubera i minst 45 minuter.
        Obs: Den maximala väntetiden här är inte avgörande för resultatet av experimentet och kan förlängas upp till flera dagar.
    2. Tvätta piranha rengöras coverslips.
      1. Plocka upp den coverslips individuellt med pincett och skölj av syra med ultrarent vatten. Placera den tvättade coverslips i icke-stick innehavare eller liknande transport enhet.
      2. Skölj varje täckglas i stor utsträckning med ultrarent vatten och torka av ytan med trycksatt gas (kväve, luft endast om oljefri). Markera den rengjorda sidan av täckglaset med permanenta märkpenna.
  2. Plasma rengöring av coverslips
    1. Skölj coverslips med överskott etanol, och därefter med överflödigt ultrarent vatten. Torra coverslips med trycksatt gas. Montera kammare enligt 4.
    2. Efter avdelningen montering enligt 4 ta coverslips med bifogade kammare och placera i plasma renare med syre som processgas. Rengöra coverslips med plasma (i detta arbete 30% makt, 0.3 mbar syre trycket i 1 min användes). Göra rengöring just innan SLB bildandet som beskrivs i 5, eftersom den hydrophilizing effekten av plasma rengöring som avtar med tiden.
      Obs: Timing och kraften i plasma rengöring bör optimeras med fluorescently märkta membran, som alltför lite eller överdriven plasma rengöring kan både leda till orörliga membran eller membran med hål.

4. kammare församling

  1. Med vass sax, klipp av och kassera locket och den koniska delen av en 0,5 mL reaktionsröret. Använda UV-lim på den övre kanten av röret och fördela jämnt genom att använda en pipettspetsen.
  2. Limma röret upp och ner till det tidigare rengjorda täckglaset. Vid rengöring av piranha se till att limma den mot den rena sidan av glaset. Bota UV-limmet genom att placera flera kammare under en 360 nm lampa eller LED 5-15 minuter.

5. stöds Lipid lipidens (SLB) bildandet

  1. Pre-värme värme block till 37 ° C och inkubera 2 mL reaktionsrören med Min eller SLB buffert, 1 tub per kammare.
  2. Blåsa kväve in i sammansatta och botade kamrarna att ta bort damm eller andra partiklar som kanske bosatte sig under UV härdning och montering. Plasma rengör som beskrivs i 3.2 om du inte har tvättat din coverslips med Piranha-lösning (3.1). Placera chambers på värme block.
  3. Späd en 20 µL alikvot av tydliga lipider (på 4 mg/mL) med 130 µL Min buffert eller SLB buffert vid E. coli polar lipid extrakt, vilket ger en arbetande koncentration på 0.53 mg/mL. Om lipider frystes, Sonikera först genom att hålla röret i ett bad någon sonikator innan du lägger till buffert och sedan Sonikera igen med buffert.
  4. Tillsätt 75 µL av lipid blandning i varje kammare och ställa in en timer till 3 minuter (för DOPC/DOPG blandningar; längre inkubation kan vara nödvändigt för andra lipid blandningar). Händelse av E. coli polar lipid extrakt, Pipettera CaCl2 en 100 mM lagervara i kammaren till en slutlig koncentration på 3 mM. Under inkubationstiden, blåsor brast på hydrofila glasytan och säkring för att bilda en sammanhängande SLB.
  5. Efter 60 sekunder, tillsätt 150 µL Min buffert i varje kammare.
  6. Tvätta avdelningar: efter ytterligare 120 sekunder (3 minuter totalt) tvätta varje kammare genom att lägga till 200 µL av Min eller SLB buffert, noggrant pipettering upp och ner några gånger, ta bort och lägga till en annan 200 µL.
    1. När varje kammare har tvättats en gång, vidare till första kammaren tvätta tills de 2 mL buffert används upp. Tvättning av SLBs behöver lite erfarenhet att perfekt omfattningen av rörelser i kammaren och hitta rätt tvätt intensiteten.
      Obs: Ta aldrig bort all vätska från kammaren för att undvika uttorkning av SLB.
      Obs: Ovanpå tvätt, membran egenskaper varierar beroende på många faktorer: typen av lipider och deras relativa koncentrationer i lipid blandningar, förberedelse metod för stadsjeepar, ytbehandling och föregående rengöring av stöd.

6. självorganisering Assay

  1. Justera buffert volym i kammaren till 200 µL Min buffert minus mängden protein och ATP lösning och sedan lägga till sinnet, märkt sinne, min, och om så önskas, MinC. Blanda försiktigt komponenter av pipettering. Exempel koncentrationer är 1 µM sinne (dopade med 30% andra-MinD), 1 µM gruva (dopade med 10% kemiskt märkt MinE) och 0,05 µM MinC, men mönster bildar över en rad koncentrationer6,10,20,30 .
  2. Lägga till 2,5 mM ATP (från 100 mM ATP lager i 100 mM MgCl2, pH 7.5) start självorganisering av MinDE.
    Obs: Ordningen på komponent tillägg (sinne, MinE och ATP) kan varieras och kommer inte att påverka den slutliga mönster resultat4.
  3. Iaktta MinDE självorganisering på mikroskopet fluorescens (se Tabell för material). MinDE självorganisering kan också observeras med hjälp av Frida mikroskopi. För imaging andra-MinD, Använd en 488 nm Argon laser eller jämförbara diodlaser (t.ex. 490 nm). För imaging mRuby3-sinne är det bäst att anställa en 561 nm diode laser.
    Obs: Undvik höga nivåer av excitation för längre tider som vi och andra17 har observerat fototoxicitet i MinDE systemet, leder till oåterkalleliga protein polymerisation på membranet.

7. PDMS mikrostrukturer

Obs: PDMS (Polydimetylsiloxan) är en polymer som kan användas för produktion av mikrostrukturer och mikroflödessystem enheter. En mönstrad kisel wafer fungerar som en form för gjutning PDMS strukturer. PDMS strukturer då fungera som ett stöd för SLB bildandet och assay setup.

  1. Antingen producera kisel wafer med microcompartments själv med hjälp av photolithographyen (se Zieske och Schwille för en detaljerad protokoll31 eller Gruenberger et al. för en video protokoll32) eller Beställ din önskad kisel wafer från ett gjuteri . För mönstret av rånet används häri Se kompletterande information.
  2. Produktion av PDMS mikrostrukturer från mönstrade kiselskivor.
    1. Använd en plastmugg för att väg 10 g av PDMS base och 1 g av PDMS crosslinker. Antingen använda en blandningsanordningen att blanda och degas PDMS blandningen eller manuellt blanda PDMS och då Avlufta under vakuum.
    2. Använd en pipettspetsen för att släppa en liten mängd av PDMS direkt på strukturen på kisel rånet.
      Obs: Var noga med att inte repa kisel rånet.
    3. Omedelbart placera ett #1 täckglas på PDMS drop och ta den övre änden av en ren pipettspetsen försiktigt trycka täckglaset på kisel rånet. PDMS bör sprida sig glest mellan täckglaset och kisel rånet.
    4. Placera rånet med coverslips i ugn och bota PDMS 3-4 timmar eller över natten i 75 ° C. Ta bort rånet från ugnen och låt den svalna ner till rumstemperatur. Med ett rakblad, ta försiktigt bort täckglaset med den bifogade PDMS från SI wafer.
      Obs: För att förhindra kisel rånet från att bli smutsig eller skadad, alltid täcka mikrostrukturer med PDMS och ett täckglas. Dock använda PDMS åldrar, vilket resulterar i sprickor i mikrostrukturer, därmed inte PDMS strukturer som är äldre än två till tre veckor.

8. självorganisering i PDMS mikrostrukturer

  1. Användning coverslips med PDMS mikrostrukturer bifoga en kammare som beskrivs under 4.
  2. Rengör och hydrophilize yta i en syre plasma renare som beskrivs under avsnittet 3.2.2. Gör inte piranha ren PDMS substrat.
  3. Setup en MinDE självorganisering-analysen som beskrivs under 6.
  4. Efter inställning av analysen, kontrollera om regelbunden MinDE mönster bildandet och korrekt bildade mikrostrukturer på mikroskopet fluorescens.
  5. När regelbundna MinDE mönster har bildat (10-30 min), Pipettera försiktigt upp och ner två gånger för att blanda komponenterna och ta sedan bort bufferten steg för steg genom pipettering. Ta bort den stora huvuddelen av buffert med 100 µL pipett och sedan försiktigt resten med 10 µL pipett.
    Obs: Detta steg kan behöva lite träning. Om för mycket buffert tas ut eller tar processen för lång, kommer att mikrostrukturer torkas ut; om alltför lite tas, proteinerna kommer inte att begränsas i mikrostrukturer, men fortsätta att bilda resor yt vågor.
  6. Omedelbart stänga kammaren med ett lock för att undvika uttorkning av det kvarvarande buffert i mikrostrukturer.
  7. För att möjliggöra längre imaging gånger, Anslut en fuktig bit svamp inne i kammaren och stäng sedan med lock. Kontrollera att svampen inte kontakta ytan av täckglaset.
  8. Innan avbildning av mikrostrukturer checken på ytan att bufferten sänktes nog, så att i ytan ovanför mikrostrukturer MinDE mönster bildandet har stannat. Bild MinDE svängningar i mikrostrukturer. Kontrollera att mikrostrukturer inte är torkat ut eller torkar under imaging.
    Obs: Kassera coverslips med microcompartments efter varje användning, som sprickor i formuläret PDMS.

9. analys av MinDE mönster bildas

  1. Kvantifiera våglängd, våg hastighet och våg profiler av MinDE självorganisering på planar stöds lipid lipidmonolager. FIJI med den vanliga uppsättningen av förpackade plugins räcker för grundläggande analys33.
  2. Analysera pol-till-pol svängningar i microcompartments genom att erhålla kymographs och tid-genomsnitt protein koncentration profiler. Grundläggande kymographs kan erhållas genom åter skivning en tidsserie längs en linjeval i FIJI.

Representative Results

Protein rening efter våra protokoll bör ge Min proteiner av tillräcklig renhet. Som referens innehåller figur 1 en SDS-PAGE bild av sinne, fluorescently märkt sinne, MinE och MinC. De enskilda stegen i förfarandet för att utföra en MinDE självorganisering analysen på icke-mönstrad stöds lipid lipidmonolager beskrivs i figur 2. Användning av detta protokoll, kan regelbundna MinDE resor yt vågor observeras i hela kammaren (figur 3). Våglängden kan variera något i kammaren, men i allmänhet mönster ser liknande. Kanterna på kammaren bör inte användas för kvantitativa jämförelser, eftersom membranen att formuläret på UV lim verkar ha olika egenskaper än på glas ytan (se figur 3 c). De resande yt-vågorna kan analyseras genom att plotta intensiteten längs förökning riktning (figur 3B). Samtidigt sinne fluorescens platåer ganska snabbt från framkanten av vågen och då kraftigt minskar på biskäret, MinE fluorescens ökar nästan linjärt från början av sinne vågen och når sitt maximum efter sinne på biskäret, där det faller utanför markant6.

Bredvid proteinkvalitet är kvaliteten på stöds lipid-lipidmonolager mest kritiska för en regelbunden självorganisering av MinCDE. Dels om membranet tvättas alltför överdrivet eller den underliggande ytan har rengjorts och därmed debiteras för starkt, hål kan bildas i membranet (figur 6A, överst). Å andra sidan om membranet inte tvättas ordentligt eller den underliggande ytan är inte rengöras/hydrophilized, blåsor kommer hålla sig till membranet eller den membran fluiditeten kommer att äventyras (figur 6A, botten). Även om inte lika uppenbara som när observerande membranet direkt via märkt lipider, dessa problem också kan upptäckas från signalen sinne fluorescens, som mönster är inte regelbundna och fluorescensen i maxima är inte homogen utan innehåller ”hål” eller ljusa fläckar som visas på panelen mellersta i figur 6A.

För MinDE självorganisering i stavformade PDMS mikrostrukturer sammanfattas förfarandet i figur 4. Flera protokoll steg behöver inte upprepas, som proteiner och lipider kan återanvändas. Som på icke-mönstrad substrat, underlaget rengörs och hydrophilized (av plasma-rengöring), en stöds lipid lipidens bildas på PDMS och självorganisering analysen är inställd i en volym på 200 µL. För att kontrollera att en ordentlig membran har bildats och MinDE själv organiserar på membranet, är kamrarna avbildade. När ett korrekt membran har bildats, MinDE bildar regelbundna resor yt vågor på ytan av PDMS mellan de enskilda mikrostrukturer och själv organiserar också längst ned på mikrostrukturer som vågorna kan fritt flytta över hela membran-täckt yta (bild 5A). Efter borttagning av buffert, bör ytan mellan facken inte visa några förökningsmaterial MinDE mönster (figur 5B), som det ska vara helt torr. Om MinDE mönster är fortfarande rörliga, måste mer buffert tas bort. Proteinerna är nu begränsade det stavformade microcompartments den membran-klädda PDMS och i luften på övre gränssnittet (figur 5 c), där de kommer att organisera sig själva. Under dessa förhållanden kan de två proteinerna utför pol-till-pol svängningar som visas i figur 5 d. En bråkdel av sinne och gruvan är alltid membran-bundna, även är under buffert borttagning, koncentrationerna efter buffert avlägsnande inte jämförbara med ingång koncentrationer. På grund av denna effekt varierar koncentrationerna också mellan enskilda mikrostrukturer på det samma täckglaset eftersom de beror på positionen av mönsterna innan buffert borttagning. Silicon wafer produktion eller PDMS molding från silicon rånet kan resultera i ofullständiga mikrostrukturer som inte kan användas för analys (figur 6B). Dessutom på grund av bufferten borttagning mikrostrukturer kan torka ut under processen, och därför bör undantas från ytterligare analys (figur 6B). Som ett resultat visar endast en bråkdel av mikrostrukturer i den ena kammaren önskad pol-till-pol svängningarna. För att analysera protein dynamik i mikrostrukturer, kan en kymograph erhållas genom att dra ett urval över hela strukturen (figur 5E). När MinCDE pendlar från pol-till-pol, visar MinC och sinne en tid-genomsnitt koncentrationsgradient med högst koncentration vid fack polerna och minimal koncentration i mitten facket (figur 5F).

Figure 1
Figur 1: SDS-PAGE visar de slutliga produkterna av protein reningar. Hans-MinD (33,3 kDa), hans-andra-MinD (60,1 kDa), hans-mRuby3-MinD (59,9 kDa), hans-MinE (13,9 kDa) och hans-MinC (28,3 kDa) visas i ordning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: processflödet diagram visar de enskilda stegen och tidpunkten för protokollet för en självorganisering på icke-mönstrad stöds lipid lipidmonolager (steg 1-6). Streckad rutor anger att ett av dessa två alternativ kan användas för rengöring. Pilar markerade med cirklar visar där protokollet kan pausas och återupptas senare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Imaging MinDE analys av konfokalmikroskopi. A) regelbundna Min spiral, som vinkar förökning hastighet, intensitet tomt och hastighet mätningar kan erhållas. Koncentrationer används: 0,6 µM sinne (30% andra-MinD), 1,8 µM hans-MinE (30% hans-MinE-Alexa647) B) exempel normaliserade intensitet tomt för regionen märkt i A. C) översikt över hela analysen kammare (skalstapeln: 1 mm, samma protein koncentrationer som ovan). Spiraler svarvning endera riktning liksom target mönster kan observeras. Förstorade området visar hur våg mönster skiljer sig på UV-lim. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: processflödet diagram visar de enskilda stegen och tidpunkten för protokollet för självorganisering i stavformade mikrostrukturer (steg 1-5, 7, 8). Grå rutorna ange åtgärder där produkter kan återanvändas från protokollet på icke-mönstrad stöds lipid lipidmonolager. Pilar markerade med cirklar visar där protokollet kan pausas och återupptas senare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: representativa resultat för MinDE mönster bildas i stavformade PDMS microcompartments. (A) MinDE själv ordna på ytan av den PDMS bildar resor yt-vågor (1 µM sinne (30% andra-MinD), 2 µM MinE och 2,5 mM ATP). B) efter bufferten är sänkt till höjden av mikrostrukturer, protein självorganisering stannar på den plana ytan mellan microcompartments. C) Schematisk av en stavformad microcompartment. D) representativa bilder av MinDE pol-till-pol svängningar efter buffert borttagning. E) Kymograph av svängningarna längs den markerade raden visas i D). F) Image och profil genomsnittliga fluorescensintensiteten hos tid-serien visas i D) tydligt visar protein toningen som är maximal vid microcompartment stolpar och minimal fack i mitten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: exempel på negativa experimentella resultat. A) över tvättade membran ackumuleras hål, medan suboptimala vesikler preparat och lipid kompositioner leda till sticker blåsor. Två center panelerna visar en kombination av både problem och hur de blir synliga när observerar Min svängningar. Membran har märkts med 0,05% Atto655-knark. (skala barer: 50 µm) B) övre panelen: torkat ut microcompartments kan orsakas av för mycket buffert borttagning eller när bufferten avdunstar med tiden. Nedre panelen: ofullständig fack kan bildas under wafer produktion eller PDMS gjutning. (skala barer: 30 µm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1: Plasmid karta för hans sinne. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 2: Plasmid karta för hans-andra-MinD. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 3: Plasmid karta för hans-mRuby3-MinD. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 4: Plasmid karta för hans-MinE. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 5: Plasmid karta för hans-MinC. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 6: CAD-filen för kisel wafer av stavformade microcompartments. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Vi har beskrivit ett protokoll för in vitro- beredning av MinCDE självorganisering på planar stöds lipid lipidmonolager och i lipid lipidens omfattas 3D-strukturer, i exemplet med stavformade PDMS mikrostrukturer. För att få värdefulla data från dessa analyser, är de viktigaste faktorerna att styra protein och membran kvalitet.

Att säkerställa proteinkvalitet, protein massan bör bekräftas med hjälp av SDS-PAGE och masspektrometri. Dessutom bör det kontrolleras att proteiner är lösliga och inte aggregerade, med hjälp av analytisk gelfiltrering eller dynamisk ljusspridning. Gelfiltrering kan användas för att ta bort eventuella aggregerade bråkdel av proteiner. Noggrann pH-justering och kvalitet extra nukleotider är kritisk, som tillägg av icke-justerade eller delvis försämrad nukleotid till protein bestånd eller självorganiserande analyser är tillräcklig för att undanröja proteinaktiviteten, därför att avskaffa självorganisering.

Bredvid proteinkvalitet, membran kvalitet är mest kritiska och felaktig membran bildas är oftast orsaken för defekta självorganisering och beskärningen av tingsliga ytstrukturer.

När du utför protokollet för första gången, är det bra att märka stöds lipid-lipidmonolager av inklusive märkt lipider som Atto-655-knark eller DiI låg molar procentsatser (0,05%). Därmed kan de egenskaper och kvalitet av membranet bedömas direkt. Använda FRAP, kan rörligheten på membranet bedömas. Dessutom kan en direkt bedöma kvaliteten på tvättning av SLB, som det kommer antingen vara alltför många blåsor, ingen flytande membran eller inget membran alls, om det har tvättats. Den öppna avdelning metoden tillåter att noggrant tvätta membranet, och därmed också ta bort blåsor som håller fast på ytan av SLB. De mest avgörande faktorerna för att få vätska och homogen stöds lipid lipidmonolager är rengöring och hydrophilicitet stödytan och rätt storlek och enhetligheten i de SUVs. kan det vara bra att kontrollera SUV storlek och storlek distribution med dynamiska ljusspridning. För smala storlek distributioner rekommenderar vi strängpressning blåsor i stället för att sonicating dem. Andra metoder för rengöring coverslips, exempelvis behandlingar med starka baser, grundläggande tvättmedel eller använda coverslips direkt efter sköljning med vatten, kan ge bra resultat, beroende på applikation och lipid blandningen.

Första halvan av det protokoll som presenteras här, in vitro- beredning på planar stöds lipid lipidmonolager i öppna avdelningar, har fördelen av rendering yta tillgänglig för optiska microscopies, såsom Frida mikroskopi30, FRAP analys6, singel-particle tracking34, samt ytan sonden tekniker såsom atomic force microscopy26. Det stora homogena området möjliggör bättre statistik på definierade koncentrationer. Dessutom kan metoden med öppen kammare att exakt styra proteinkoncentration och en snabb och enkel tillägg av ytterligare komponenter, därav tillåter för att titrera proteinkoncentration i en enda kammare20. Analysen kan också utökas genom tillägg av andra bakteriella divisome komponenter såsom FtsZ22,35, olagligt på den tiden22 eller chimära protein FtsZ-YFP-MTS10,35.

Andra grupper har tagit ett liknande förhållningssätt till beredning av Min system i vitro, men använder en flöde cell i stället för en öppen kammare17,18,19. Flöde-celler har vissa fördelar, särskilt när en sluten 3D-miljö är behövs18, påverkan av flöde17,19,23 eller membran sammansättning23 på MinCDE mönster är undersökt, eller om protein mönster är att observeras under protein begränsning villkor19. Lokal styrning av molekylär koncentrationer är dock svårare. Proteinkomponenter, särskilt sinne, binder starkt till membranet de först möter18,19. Vår erfarenhet uppvisar proteinerna ofta icke-specifik bindning till slangar, vikar, sprutor och andra mikroflödessystem delar. Därför lokala protein koncentrationer skiljer sig från ingående koncentrationer18 och varierar också över längden av cellen flöde, vilket resulterar i en mängd olika protein mönster på membranet mellan inlopp och utlopp, som observerades av andra19.

Den andra hälften av protokollet presenteras här, in vitro- beredning i stavformade mikrostrukturer återanvändning av metoden Öppna avdelningen på en mönstrad stöd omfattas av lipid lipidmonolager möjliggör en enkel härma i vivo protein beteende även om exakt kontroll över protein koncentrationer är förlorad på grund av buffert borttagning. Observera att eftersom våglängden av MinDE är ungefär en storleksordning större in vitro- än i vivo de stavformade microcompartments är också om en storleksordning större (10 x 30 µm) än en stavformad E. coli cell.

Sammantaget gör detta protokoll för exakt kontroll av alla villkor inklusive proteinkoncentration, buffert sammansättning och membran egenskaper. Användningen av 3D strukturerat stöd ger reaktionen att studeras under fysisk inneslutning, härma i vivo beteende utan behov av komplexa mikrofluidik utrustning.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Michael Heymann och Frank Siedler för produktion av kisel wafers, Core Facility MPI-B för stöd i protein rening och Simon Kretschmer och Leon Harrington för synpunkter på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
DOPG Avanti Polar Lipids 840475
E.coli polar lipid extract Avanti Polar Lipids 100600
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate Roche
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma A5285-1G
Sodium chloride VWR 27810.295
Potassium chloride Roth 6781.1
Tris-base Sigma Aldrich T1503-1kg
Hydrochloric acid Roth 9277.1
TCEP-HCl Termo Fisher Scientific 20491
Ethylene Diamine Tetraacetate Merck Millipore 1.08418.1000
Sulfuric Acid 98% Applichem 173163.1611
Hydrogen Peroxide 50% Applichem 147064.1211
HEPES Biomol 05288.1
dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 102950 Uvasol
Glycerol 86% Roth 4043.1
TB medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roth 2316.x
Atto-655-DOPE Atto Tec AD 655-161
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
PDMS base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
PDMS crosslinker Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue Norland Products 6801 #68 and #63 both work well
Coverslips #1.5 24x24 mm Menzel Gläser
Coverslips #1 24x24 mm Menzel Gläser used only for PDMS microstructures
0.5 ml reaction tube Eppendorf  0030123301
culture flask 2L Corning e.g. 734-1905
His-Trap HP GE Healthcare Life Sciences
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column Biorad 7322010
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL Termo Fisher Scientific 66333 or 66330
razor blade
Instruments
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Merck
automated protein purification system: Äkta Pure GE Healthcare Life Sciences
bath sonicator Branson e.g. Model 1510
ARE-250 mixer Thinky Corporation
Plasma cleaner Zepto Diener electronic use oxygen as process gas
positive displacement pipettes Brand Transferpettor models with glass tips
LSM780 confocal laser scanning microscope Zeiss Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield
pET28a-His-MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
  2. Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
  3. Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
  4. Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
  5. Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
  7. Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
  8. Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
  9. Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
  10. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949 (2014).
  11. Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
  12. Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
  13. Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  14. Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758 (2014).
  15. Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
  16. Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
  17. Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
  18. Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271 (2016).
  19. Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
  20. Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).
  21. Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
  22. Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
  23. Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
  24. Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
  25. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
  26. Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
  27. Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).
  28. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116 (2013).
  29. Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
  30. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
  31. Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
  32. Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560 (2013).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
  35. Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).

Tags

Biokemi fråga 137 In vitro-beredning sinne MinE stöds lipid lipidens mönster bildandet mikrostrukturer självorganisering
<em>In Vitro</em> Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P.… More

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P. In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (137), e58139, doi:10.3791/58139 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter