Summary
Un protocole de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de la réactivation efficace du VIH et de la clairance du provirus latentes est décrite et appliqué en testant l’impact des interventions sur la transcription de VIH et d’épissage. Des résultats représentatifs de l’effet de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage sont fournis.
Abstract
Le VIH reste incurable en raison de l’existence d’un réservoir de cellules qui recèle une forme stable et latente du virus, qui reste invisible pour le système immunitaire et n’est pas ciblée par l’antirétroviraux actuels (cART). Transcription et épissage ont démontré que renforcer la latence du VIH-1 au repos des cellules T CD4 +. Inversion de la latence de l’utilisation d’agents de renversement de latence (ALE) dans l’approche de « choc et d’abattage » a été largement étudiée dans le but de purger ce réservoir mais n’a jusqu'à présent pas montré aucun succès dans les essais cliniques en raison du manque de développement des petits adéquate molécules qui peuvent perturber efficacement de ce réservoir. Le protocole présenté ici fournit une méthode pour efficacement et de façon fiable évaluer les agents de renversement de latence (alr) sur la transcription du VIH et l’épissage. Cette approche repose sur l’utilisation d’un journaliste bicolore axée sur le LTR qui permet de mesurer simultanément les effets d’un LRA transcription et épissage par cytométrie en flux. Le protocole décrit ici est suffisant pour les cellules adhérentes, mais aussi les cellules en suspension. Il est utile pour tester un grand nombre de médicaments dans un système à haut débit. La méthode est techniquement simple à mettre en œuvre et économique. En outre, l’utilisation de la cytométrie permet l’évaluation de la viabilité cellulaire et toxicité des médicaments donc en même temps.
Introduction
Malgré un traitement antirétroviral à long terme efficace, le VIH persiste dans un état latent comme un provirus intégré dans la mémoire de cellules T CD4 +1. La structure de la chromatine du VIH-1 5 « promoteur de longue répétition terminale (LTR) et des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et désacétylation par ADN méthyltransférases (DNMT) et les histones désacétylases (HDAC) sont des mécanismes importants conduisant à la répression transcriptionnelle et donc post-intégration latence2,3. Une grande variété d’agents d’inversion (ALE) de la latence a été étudiée pour leur efficacité induire la production de virus in vitro et in vivo de manière latente infectés au repos T CD4 + cellules4,5,6,7 ,,8. Parmi les LRA testés, HDACi (inhibiteurs d’HDAC) et inhibiteurs de la côté du pari (BETis) induisent la décondensation de la chromatine et la libération de la transcription positive élongation facteur b (P-TEFb) respectivement, conduisant aux soulager de la transcription répression à la 5' LTR et activation du VIH expression9,10,11,12,13. Toutefois, l’ampleur de la réactivation atteindre par ces collectivités locales et régionales ne se limitait qu’une modeste augmentation associée aux cellules unspliced VIH ARNm (nous RNA), indicatif de transcription virale, a été observée ex vivo14,15. Ce qui est important, ces collectivités locales et régionales a également omis d’induire une diminution de la fréquence des cellules infectées de façon latente.
Expression du VIH peut être encore plus restreint par épissage inefficace16 ainsi que les défauts dans les exportations nucléaires de multiplier épissés ARN VIH (MS RNA)17. Ainsi, l’identification de nouvelles catégories de collectivités locales et régionales qui sont plus puissants et peuvent affecter des aspects distincts de virus production après intégration sont nécessaires. En outre, le développement de nouveaux tests qui aident à définir les composés optimales pour contrer efficacement les temps de latence est nécessaire.
Ici, un protocole est présenté, qui utilise une approche de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de l’impact des interventions axées sur le VIH LTR transcription et épissage. En bref, un nouveau duel axée sur le LTR couleur journaliste système pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figure 1) est utilisé pour évaluer la réactivation du VIH par cytométrie en flux. Dans ce journaliste fluorescent, l’expression de l’ARNm de VIH unspliced (4Ko) conduit à l’expression de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), tandis que l’expression de l’ARNm épissé (2KO) conduirait à Acropora SP rouge (DsRed) expression de la protéine fluorescente. En bref, nous avons utilisé une protéine de fusion Env-EGFP fluorescente, gp140unc. EGFP, où la séquence codante de EGFP a été mises en image avec une forme non clivée et tronquée de l’enveloppe (Env). Modifications ont été apportées pour l’ablation du site de clivage empêche la dissociation des Env en gp120 et gp41-EGFP et de tronquer les protéines gp160 avant le domaine transmembranaire créent un analogue Env soluble qui facilite le pliage correct et expression de EGFP. Lors de l’expression dans une cellule, Rev se localise dans le noyau où il intervient dans les exportations nucléaires et cytoplasmiques 4Ko env ARNm via l’interaction avec l’élément sensible de rev (RRE). La troncation d’Env ne compromet pas le RRE, qui se trouve entre le site d’épissage A7 3' gp120 et gp41. Dans ce système, épissure au VIH-1 donneur 4 (SD4) d’épissure et épisser accepteur 7 (SA7) entraîne la production d’un 2KO ARNm codant pour une protéine Rev non fonctionnels sont tronquée lorsque l’acide aminé 38 fusionnée à la protéine fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. En bref, DsRed a été inséré dans l’exon 2nd de Rev à acides aminés 38 par chevauchement extension18. Afin de faciliter l’exportation nucléaire des ARNm unspliced, un vecteur d’expression mammifère encodage Rev (cmvp-RevNL4.3) a été conjointement transfecté avec la construction de journaliste fluorescent (Figure 2). Cette construction unique journaliste décrite ici est utile dans l’évaluation de haut débit de transcription de VIH et d’épissage, sans la nécessité d’utiliser des vecteurs viraux.
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Protocol
Remarque : Procédures de clonage, séquençage et transformation sont traitées ailleurs18,19. Les protocoles aux présentes commencent de la transfection des vecteurs d’expression chez les mammifères (Figure 3).
1. la transfection de cellules HEK293T avec bicolore journaliste construire
- Cultiver des cellules HEK293T au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), la pénicilline (100 U/mL) et la streptomycine (100 μg/mL) dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C. Après décongélation, expériences de cellules HEK293T passage 2 ou 3 fois avant de les utiliser dans la transfection. Cela donnerait le temps de cellules pour récupérer de la procédure de décongélation.
Mise en garde : La contamination des cultures de cellules de mycoplasmes demeure un problème grave. Bonnes pratiques de laboratoire et de tests de routine des cultures de cellules sont indispensables pour diminuer le risque de contamination par mycoplasmes et éviter la diffusion20. - Fractionner les cellules 1:2 un jour avant de semer et de les transférer dans un milieu DMEM frais. Cultiver les cellules pendant 24 h dans une étuve à2 CO 5 % à 37 ° C.
- La veille de la transfection, retirer le support de la fiole par aspiration et laver les cellules avec tamponnée au phosphate (SPD) du sérum physiologique de Dulbecco sans calcium (Ca2 +) et magnésium (Mg2 +) pour éliminer les traces de sérum.
- Diluer 5 mL de solution de trypsine-EDTA (10 mM dans du PBS 0,05 %) dans le récipient de culture et placez-le à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2 à 5 min.
- Lorsque les cellules sont détachés, ajouter 5 mL de DMEM supplémenté de 10 % (v/v) de SVF encore inhibe l’activité de la trypsine qui peut-être endommager les cellules.
- Resuspendre doucement en pipettant également, la suspension cellulaire up et down pour briser les agrégats.
- Diluer les cellules 01:10 dans tache bleu trypan (0,4 %).
- Compter les cellules vivantes qui ne prennent pas place trypan bleus à l’aide d’un microscope (objectif x 10) et un hémocytomètre.
- Calculer le nombre de cellules viables par millilitre en prenant la moyenne du nombre d’éléments et en multipliant par 10 000 et par le facteur de dilution (01:10) depuis le bleu trypan tacher.
- Plaque de 2 x 104 cellules dans 100 μl de milieu DMEM supplémenté avec 10 % FBS sans antibiotiques dans une plaque à 96 puits à fond plat pendant 24 h.
- Pour chaque puits, diluer 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng du cmvp-RevNL4.3 et 100 ng du cmvp-Tat101AD8-drapeau ADN dans 50 μl de milieu sans sérum. Mélanger doucement. Pour les expériences sans Tat, utilisez un correspondant vide Tat vector pcDNA3.1 (-).
Remarque : L’utilisation de l’ADN exempte d’endotoxine est fortement recommandée. Pour cela, préparer exempte d’endotoxine ADN à l’aide d’un kit de purification d’acides nucléiques midi ou maxiprep. Déterminer la pureté de l’ADN en mesurant le ratio 260/280 OD, qui devrait se situer entre 1,7 et 1,9. - Mélanger le réactif de lipides doucement avant utilisation, puis diluer 0.65 μL dans 50 μl de milieu sans sérum. Mélanger doucement et laisser incuber 5 min à température ambiante.
- Combiner l’ADN dilué avec le réactif de lipides dilué.
- Mélanger doucement et laisser incuber pendant 20 min à température ambiante. La solution peut sembler nuageuse.
Remarque : Passez à l’étape de 1,15. moins de 30 min. - Pipeter 100 μL / puits des complexes ADN-réactif lipides goutte-à-goutte sur le dessus des cellules.
- Mélanger doucement en balançant la plaque avant et en arrière.
-
Incuber la plaque pendant 5 h dans une étuve humide 5 % CO2 à 37 ° C.
- Chaque mélange réactionnel est suffisant pour une transfection de puits unique (96 puits). Ajustez le montant et volume des composants selon le nombre de médicaments et de combinaison qui serait testé et les comptes de variations de pipetage. Toutes les conditions sont habituellement testées en géométrie.
- Transfecter puits supplémentaires avec 100 ng de plasmide EGFP et ADN DsRed-Express pilotée par le CMV fins d’indemnisation.
2. traitement de HEK293T transfectées cellules avec une latence inversion des Agents
Remarque : Avant chaque essai, déterminer l’état physiologique de chaque Ars en mesurant la viabilité des cellules après une exposition à haute et basse dose du médicament avec analyse de prolifération cellulaire.
- Diluer chaque LRA à la concentration appropriée de travail avec le milieu de culture (p. ex., 1 μM pour JQ1(+)).
Mise en garde : Reconstituer les médicaments lyophilisés avec le solvant approprié à une concentration de 10 mM. Magasin stock toutes les collectivités locales et régionales à-80 ° C dans une aliquote à usage unique (5 μL) afin d’éviter les cycles de gel-dégel répétés. - Aspirer moyen de transfection avec un multicanal avec précaution et remplacer par 100 milieu μL contenant approprié LRA (tableau 1). Ajouter médium très doucement aux côtés de la paroi du puits afin de détacher les cellules HEK293T transfectées, qui sont connus pour détacher facilement de la surface de plaque de culture.
- Incuber les plaques pendant 48 heures dans une étuve humide 5 % CO2 à 37 ° C.
3. la coloration des cellules transfectées avec le colorant de viabilité Fixable pour analyse en cytométrie en flux
Mise en garde : Enlever les débris et les cellules mortes est essentiel pour éliminer les faux positifs et d’obtenir des résultats de haute qualité.
- Détacher les cellules dans les médias à l’aide de 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par puits et par doucement pipetage va-et-vient (~ 5 fois) avec un multicanal, tout en évitant de faire mousser des médias. Le cas échéant, détacher les cellules de la plaque avec 35 µL / puits d’une solution de trypsine-EDTA (10 mM dans du PBS 0,05 %) et en laissant incuber 5 min à 37 ° C, avant de neutraliser avec milieu contenant du sérum.
- Les cellules de transfert à une plaque de fond en V 96 puits.
- Faites tourner les cellules pendant 5 min à 500 x g à 4 ° C, puis aspirer soigneusement le support/PBS sans toucher les cellules.
- Laver les cellules au moins 1 fois avec 200 μL de sérum protéine libre PBS.
- Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant en inclinant la plaque et en supprimant le tampon de lavage sans toucher les cellules.
- Préparer une solution de colorant de viabilité fixable par dilution au 1/1000 de colorant viabilité dans du PBS libre de protéine/sérum. Préparer 50 µL de la tache diluée par puits.
Remarque : Colorants de viabilité sont disponibles dans une gamme de couleurs appropriés pour l’usage avec des lasers bleus, rouges et violettes. Préparer une solution de colorant de viabilité fixable par resuspendant un flacon de teinture lyophilisée (composant A) avec 50 μL de DMSO anhydre (composant B). Conserver à-20 ° C dans un aliquote de l’usage unique (1 μL), abri de la lumière. - Ajouter 50 μL de la teinture de viabilité dilué dans chaque puits et mélanger les cellules par pipetage de haut en bas avec un multicanal.
- Détachant pendant 10-15 min à 4 ° C, abri de la lumière.
- Laver 1 ou 2 fois avec 150 μl de tampon de lavage (PBS 1 % bovine serum albumine et 2 mM EDTA).
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Fixer les cellules avec 100 μL de fraîchement préparée 1 % de formaldéhyde dans le tampon de lavage pendant 10-15 min à 4 ° C dans l’obscurité.
Mise en garde : Le formaldéhyde est très toxique. Préparer la solution de formaldéhyde de 1 % dans une hotte aspirante pour éviter toute inhalation tout en portant des gants et des lunettes de protection. - Laver les cellules 1 - 2 fois avec 100 μL de tampon de lavage.
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 70 μL de tampon de lavage.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les cellules fixes pourraient être stockés à 4 ° C dans l’obscurité pour analyse le lendemain sur le cytomètre en flux.
4. EGFP et mesures DsRed par cytométrie en flux et analyse des données
Remarque : Analyser la transcription du VIH (% EGFP) et épissage (% DsRed) sur un cytomètre en flux. Filtrer l’échantillon avant la course avec une cellule-crépine 70 μm ou mailles de nylon 100 μm pour éviter d’obstruer la buse.
- Démarrer le cytomètre et l’ordinateur au moins 10 min avant de l’utiliser pour réchauffer les lasers.
- Avant exécution exemples et commençant d’acquisition de données, remplissez le réservoir de la gaine avec la solution saline à 0,9 % et faire en sorte qu’un comprimé d’hypochlorite de sodium est ajouté pour le réservoir à matières.
- Vérifier les cellules de circulation pour les bulles d’air.
- Vérifiez que les détecteurs et les filtres sont appropriés pour l’expérience.
Remarque : Pour EGFP, utilisation de laser bleu (488 nm) et passe-bande 530/30, tandis que DsRed Express est parfaitement détecté en utilisant le laser jaune (561 nm) et passe-bande 610/20. Un laser bleu (488 nm) et passe-bande 610/20 peut également être utilisé pour détecter l’expression DsRed. - Vérifier le cytomètre performance et la sensibilité à travers des détecteurs en exécutant les perles de l’étalonnage.
- Ajuster l’attaquant (FSC-A) et des tensions de dispersion (SSC-A) côté avec non souillées enregistré l’échantillon alors que la population principale est à l’écran et clairement discernable.
Remarque : FSC (lumière diffusée vers l’avant) est une mesure de la lumière par diffraction dans un angle plat, qui dépend du volume de la cellule (cell surface ou taille), tandis que SSC (côté-la lumière diffusée) est une mesure de diffraction de la lumière à angle droit, qui est proportionnelle à granularité de la cellule et de la complexité interne. - Effectuer une compensation manuelle ou automatique en utilisant les échantillons colorés à l’unique assurant des retombées minimes de population EGFP + dans la DsRed détecteur et vice versa.
Mise en garde : À des fins d’indemnisation, utiliser un échantillon de cellules exprimant chacun de la protéine fluorescente de couleur unique, mais aussi les cellules colorées individuellement avec le colorant de viabilité réparable. Ne pas utiliser les perles de compensation FITC et PE pour EGFP et DsRed compensations de protéines fluorescentes en raison des caractéristiques spectrales différentes. Contrôles de compensation devraient être suffisamment lumineux pour résoudre positive et négative de la population. - Créez des parcelles et définissez les portes à l’aide de fluorescence moins un contrôles (FMO).
- Acquérir et enregistrer un minimum de 10 000 événements de cellules viables par exemple. Exécution d’échantillons à vitesse moyenne ou basse pour éviter les doublets en passant par l’intersection de laser. Utiliser l’impulsion géométrie gating tels que SSC-A contre SSC-H pour éliminer les doublets. Vérifier la stabilité de la course et en temps / SSC-A pour voir que même le flux est pendant la course.
- À la fin de la course, nettoyer la fluidique de cytométrie en flux avec les agents de nettoyage concentrés puis d’eau de 5 min chacun.
- Arrêter le système, jeter les déchets et re-remplir le réservoir de la gaine après acquisition.
- Analyser les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données écoulement cytometry. Exclure les débris cellulaires et touffe (doublets) basé sur la diffusion vers l’avant et latérale, puis éliminer les cellules mortes à l’aide de la tache de colorant de viabilité (négatif population = cellules vivantes). Identifier les cellules exprimant EGFP et DsRed (Figure 4), ainsi que le pourcentage du produit épissé DsRed /(DsRed + EGFP) (Figure 5).
- Déterminer l’effet de la LRA sur la VIH transcription et épissage en comparant des cellules non traitées et les cellules exposées à la personne physique ou une combinaison des ALE (Figure 5).
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Representative Results
Résultats représentatifs sont indiquées à la Figure 5 pour l’expression de HIV-1 unspliced (EGFP) et épissé (DsRed) produits après le traitement par l’inhibiteur de la côté du JQ1. Fois JQ1(+) et Tat a augmenté significativement le pourcentage de cellules exprimant EGFP (2.18 et 4.13 FC au DMSO respectivement ; n = 3) indicatifs des transcriptions unspliced. Par ailleurs, JQ1(+) a considérablement augmenté le pourcentage de cellules exprimant DsRed (46,6 FC au DMSO) ainsi que la proportion de produit épissé (7,37 FC au DMSO) à un niveau similaire comme Tat (59,6 et 5,83 FC au DMSO, respectivement) confirmant la capacité de JQ1(+) pour mettre en marche la VIH transcription et épissage. En revanche, le traitement par le contrôle de stéréoisomère JQ1(-) abolit JQ1(+) effet sur la transcription de VIH et d’épissage confirmant le succès du protocole.
Dans une publication récente, nous avons montré par l’analyse de RNA une accumulation du VIH épissé transcriptions suite JQ1(+) traitement21. En fait, nos données révèlent compatibles changements dans les niveaux d’unspliced et épissage des transcriptions qui ont été mis en miroir par l’expression de protéine EGFP et DsRed dans ce modèle après un traitement avec JQ1(+). Ces résultats indiquent que les EGFP et DsRed exprimant des cellules reflètent la capacité de l’inhibiteur du côté du JQ1(+) pour induire la transcription de VIH et de l’épissage.
En résumé, nous avons validé l’utilisation de la pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed journaliste dans une configuration de haut débit pour l’évaluation de l’effet des collectivités locales et régionales sur le VIH-1 transcription et épissage. Sous-optimal montant de LRA ou toxicité accrue pourrait conduire à des résultats de scud. Optimisant la quantité de médicament utilisé tout en préservant la viabilité cellulaire peut améliorer la précision des résultats.
Figure 1 : schéma du modèle utilisé pour déterminer les effets de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage. L’exprime de construction LTR à que soit protéine de l’enveloppe unspliced (Env) fusionnée amélioré la protéine fluorescente verte (EGFP) ou épissé Δ38rev protéine avec DsRed. Ce chiffre a été tiré à Khoury et al.21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : conception de constructions. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed journaliste épissage permet l’expression de l’enveloppe fusionnée à EGFP (gp140-EGFP) et non fonctionnel protéine Rev tronquée à acides aminés 38 fondue à la protéine fluorescente DsRed (RevΔ38-DsRed). (B) cmvp-RevNL4.3 permet l’expression de la protéine Rev. (C) Tat101-cmvpAD8-indicateur permet l’expression de protéine de Tat101(AD8) avec une balise du pavillon C-terminal. Les plasmides d’expression sont construits à l’aide de la PCR chevauchements et sommaire de restriction. Toutes les cartes vectorielles créées à l’aide de SnapGene logiciel, version 4.1.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : essai de conception pour une évaluation rapide de latence du VIH qui a infirmé des agents. La méthode actuelle pour l’évaluation de l’effet des collectivités locales et régionales sur le VIH-1 transcription et épissage comprend i) ensemencement de cellules HEK293T un jour avant la transfection ii) avec les expressions des vecteurs suivies par un traitement de LRA iii). IV) cellules sont analysées par écoulement cytometry 48 h après le traitement. Utilisant ce protocole, 32 (en triple exemplaire) 96 conditions pourrait être testé par plaque. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : exemple représentatif de l’installation de la plaque et les contrôles nécessaires. Colonnes 1 à 3 correspondent aux témoins négatifs (-) avec aucune drogue et solvant seul (DMSO 1 : 5000) ainsi que des contrôles positifs (+) comme le Tat (100 ng), AGP/PHA = phorbol myristate acétate/phytohémagglutinine (10 nM PMA, 10 μg/mL PHA), JQ1 (+/-) (1 μM), VOR = (vorinostat 0,5 μM) et PAN = panobinostat (30 nM). ALE inconnues sont testés en triple exemplaire sur une gamme de concentrations (15,625 à 1000 nM). À des fins d’indemnisation, les cellules exprimant chacun de la protéine fluorescente de simple-couleur (EGFP + et DsRed +) ainsi que de cellules colorées avec la teinture de viabilité et cellules incolores sont inclus dans chaque série. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Figure 4 : Gating stratégie utilisée dans l’analyse de cytométrie en flux. La première étape dans la stratégie de blocage est basée sur la dispersion vers l’avant et latérale, qui permet la distinction des cellules d’intérêt basée sur les propriétés de taille et de la granularité de ces cellules. Il est recommandé que ce blocage soit aussi généreux que possible inclure tous les événements, tout en éliminant les débris cellulaires et les cellules mortes, qui sont trouvent dans le coin inférieur gauche de la courbe de densité. Supprimez les doublets de dataset à l’aide de la géométrie de l’impulsion gating, SSC-A contre ASC-H et plus étroite sur l’à l’aide de la teinture de la viabilité des cellules vivant. Enfin, un canal de décharge (violet) et l’EGFP ou la DsRed servent à définir aux cellules d’intérêt. L’utilisation de la fluorescence moins un contrôles (FMO) sont essentiels dans la définition de la population visée et aborder les questions de débordement du fluorochrome un autre dans le chenal d’intérêt. Après l’acquisition, les données sont analysées en utilisant le logiciel d’analyse de données de cytométrie en flux. Ce chiffre a été réimprimé en forme adaptée Khoury et al.21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : résultats représentatifs de l’effet des inhibiteurs de la côté sur la VIH transcription et épissage. (A) exemples de deux paramètres double couleur fluorescence EGFP versus DsRed placettes de la densité des cellules celllulaire (-Tat), les cellules transfectées avec 100 ng du cmvp-Tat101AD8-drapeau (+ Tat) et les cellules traitement avec le DMSO, JQ1 (+) ou JQ1 (-). (B) la moyenne de pourcentage (%) des cellules exprimant EGFP, DsRed ou produit épissé (DsRed / DsRed + EGFP) de 3 expériences indépendantes s’affiche. Comparaisons de chaque condition de DMSO ont été faites en utilisant le test d’ANOVA 2 voies. Seules des comparaisons significatives sont affichées. p < 0,05 ; p < 0,01 ; p < 0,001. Les lignes noires représentent le ±sem. DMSO (1 : 5000), JQ1 (+) et JQ1(-) (1 μM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Compte tenu de la difficulté de mesurer une réactivation du virus ex vivo, un large éventail d’in vitro modèles ont été développés au fil du temps afin d’étudier la latence du VIH, y compris de manière latente infectée lignées de cellules T (J-Lats, ACH2, U1), modèles primaires de l’infection latente de repos) O ' Doherty, Lewin, Greene et Spina modèles) ou des cellules T CD4 + pré-activé (Samir, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modèles) avec simple ronde ou réplication journaliste compétente virus22. Pour modéliser les conditions physiologiques de la latence du VIH dans les cellules T CD4 + de repos, les systèmes dual fluorescent journaliste s’ensuivit comme le journaliste Russo (rouge-vert-VIH) mis au point par le groupe de Ivan Sadowski avec un marqueur axée sur le LTR Gag-eGFP et un mCherry pilotée par le CMV en place de Nef23. Une semblable bicolore journaliste virus, Duo-Fluo, a été développé par le laboratoire E. Verdin avec une expression EGFP axée sur la LTR et un marqueur fluorescent mCherry pilotée par un promoteur de EF1α24. Dans ce système, l’EGFP a été insérée à l’extrémité 3' de la provirus en lieu et place de la Nef. La suppression dans l’enveloppe de ces deux systèmes empêche plusieurs tours d’infections. En outre, la combinaison des deux protéines fluorescentes permet la détection de façon productive (eGFP + mCherry +) et de manière latente (eGFP - mCherry +) cellules infectées. Cependant, plusieurs lacunes des virus journaliste bicolore étaient perceptibles dans les lymphocytes t CD4 +, comme l’infection directe des cellules infectées de façon latente est largement tributaire de l’état d’activation cellulaire des lymphocytes T23,24. En effet, très faible taux d’infection a été observée à l’aide de ces virus de deux journaliste au repos des cellules T CD4 + : 0,1 % pour Russo23 et 0,2 % pour DuoFluo25. En outre, comme le CMV promoteur s’est avéré être exprimés à des niveaux inférieurs dans les cellules non-activé26,27,28, un CMV inactif ou promoteur EF1α conduirait à une sous-estimation de la manière latente infectée populations.
Nous avons généré et caractérisé un nouveau vecteur de reporter le VIH afin d’étudier la mise en place de latence et une réactivation du virus dans un essai de débit élevé. Plusieurs avantages à notre méthode de dépistage comprennent i) rentabilité avec la capacité d’évaluer la transcription et épissage simultanément, ii) la possibilité de tester un grand nombre de médicaments ou combinaisons en une seule expérience, iii) rapide évaluation de la effet des ALE par cytométrie en flux (30-45 min typique temps de lecture pour 96 puits plaque indépendamment du nombre de paramètres fluorescents), iv) une plage dynamique élevée, v) adapté pour automatisé de transfection de haut débit et cytométrie en flux à l’aide de bras manipulateurs et plate-forme HTS, polymérisation vi) rapide des données à l’aide d’un modèle d’espace de travail flux de cytométrie en flux, vii) optimal pour la suspension et les cellules adhérentes, viii) simplicité du modèle et capacité d’adaptation aux mesures de lecteur luminescence et plaque (dual luciferase Firefly et Renilla) et ix) évolutivité (formats de pate de 96 et 384 puits).
La propension d’un ALE ou une combinaison des collectivités locales et régionales pour activer axée sur le VIH LTR transcription et épissage ainsi l’expression des protéines fluorescentes EGFP et DsRed pourrait être examinée par cytométrie de flux à l’aide de notre reporter épissage de VIH. Toutefois, avant de tester la synergie du roman alr, il est fortement recommandé de fixer les conditions physiologiques de chaque Ars en mesurant la viabilité des cellules après exposition à une gamme de concentrations du médicament unique. Donc, y compris un marqueur des cellules vivantes et mortes sont essentiel pour éliminer les faux positifs et d’obtenir des résultats de haute qualité. Un autre aspect important de l’analyse en cytométrie en flux est les commandes de compensation ou de la FMO. Il est fortement recommandé d’utiliser des échantillons seuls tachés assurant des retombées minimes de population EGFP + dans la DsRed et vice versa. En outre, il est essentiel au compte pour l’autofluorescence des cellules en incluant les cellules colorées ou non. Enfin, un contrôle régulier du cytomètre en rendement et sensibilité à travers les détecteurs est critique pour la plupart lors de la mesure des échantillons pour une étude s’étendant sur une longue période de temps.
Bien que ne pas discuté dans la section protocole, il y a plusieurs limites de notre système de journaliste épissage. Pour une étude plus approfondie, veuillez consulter notre publication précédente (Al Khoury, 2018). Exportation de la partiellement ou unspliced variantes de l’ARNm du VIH est facilitée par la protéine virale Rev et son association avec l’élément sensible de Rev (RRE) dans ces ARNm espèces29,30,31,32. La surexpression de Rev dans notre système nous a permis de contourner le bloc majeur de rétention nucléaire de multiply épissé et ARNm unspliced observés chez infectés de façon latente de cellules T17 et se concentrer sur la compréhension de comment les LRA induisent la transcription et épissage donc une réactivation du virus. En outre, étant donné que notre système exige la transfection des 3 plasmides, nous avons choisi de cellules HEK293T parce que l’efficacité de transfection haute de ces cellules. Dû à la disponibilité temporelle et spatiale différente des facteurs cellulaires dans les cellules de T par rapport à une lignée de cellules cancéreuses, il est important de valider les résultats de l’épissage journaliste acquis dans les cellules HEK293T dans les lignées de cellules T et cellules primaires, qui pourraient constituer un grand défis techniques en raison de leur transfectability limitée. Par conséquent, l’utilisation des réactifs de livraison alternatives ADN pour transfection comme DMRI-C, qui s’est avéré particulièrement efficace pour la transfection de cellules en suspension (p. ex., Jurkat), ou les méthodes de nucleofection comme nucleofector Amaxa ou néon système de transfection qui ont fait leurs preuves pour faciliter la prestation efficace et fiable d’un ou plusieurs plasmides de difficile-à-transfecter cellules dont les cellules T CD4 + primaires. Sinon, il serait intéressant de tester ce système de journaliste dans le cadre du virus pleine longueur dans un modèle de cellules primaires de latence en utilisant les méthodes de transfection susmentionnés. En fait, les différences dans la disponibilité de transcription de l’hôte, d’allongement et de facteurs dans une cellule de T rCD4 + l’épissage peuvent affecter la capacité d’un LRA à réactiver le provirus latente. Enfin, notre modèle ne traite pas que la LRA peut influer sur la transcription et épissage des cellules d’un observateur, et si il peut induire des virus compétente de réplication. Cependant, on suppose qu’en mesurant l’augmentation à la cellule VIH U.S. et MS RNA, cela conduirait à la production de virus compétente de réplication dans le surnageant de culture. Cela peut être confirmé en procédant à l’étalon-or virus quantitative excroissance test (QVOA)33.
En raison de la nature complexe de la latence tout en assurant une réactivation du virus efficace, une stratégie multiforme combinatoire peut être requis34. Traitement potentiel doit stimuler des voies multiples, y compris la transcription et épissage, qui a déjà été démontré que jouent un rôle essentiel dans la mise en place de latence16,35,36, 37. pilotée par notre LTR épissage journaliste permettrait un criblage à haut débit des médicaments qui peuvent cibler parfaitement les étapes, transcription et épissage, augmentant les chances de trouver des molécules qui peuvent agir en synergie avec efficacité, qui conduirait à une plus faible doses et ainsi la toxicité de chaque médicament.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet APP1129320 et programme de subvention APP1052979 par le NHMRC australien. Nous remercions le Dr Adam Wheatley, Dr Marina Alexander, Dr Jenny L. Anderson et Michelle Y. Lee pour fournir les concepts essentiels et des conseils pour la réussite de ce travail. Nous remercions également le personnel de DMI Flow Facility pour leurs conseils et leur aide généreuse à maintenir le cytomètre en flux utilisé dans cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
